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요약

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

초록

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

서문

이러한 형광 분광법, 형광 현미경 및 유동 세포 계측법 같은 기술은, 모두 형광에 의존 속성은 널리, 생화학 생물 의학, 화학 응용 프로그램에서 악용. 형광 극한 또는 라벨링을 통해 단백질 발현 패턴과 프로필, 세포의 운명, 단백질 결합 및 생물학적 기능 1-9의 분석을 위해 이용하고,되었는지 생체 분자 상호 작용 및 구조 변화의 검출을위한 형광 / 포스터 공명 에너지 전이를 통한 10-13. 빅토리아 (Aequorea victoria) 녹색 형광 단백질 (GFP) (14)의 분리 이후, 다른 자포 동물, 특히 산호로부터 추가 천연 형광 단백질의 발견은, 크게 구별 여기 / 발광 스펙트럼을 가진 기존의 형광 단백질의 수가 증가하고있다. 이 함께 유전자 15-19의 돌연변이의 도입으로, 근래전자는 또한 자신의 연구를위한 세포 계측법 및 기타 형광 기반 기술 흐름, 현미경을 이용 과학자 사용할 수 형광 단백질의 진정한 표를 획득, 가능성을 확장했다.

이와 병행하여, 독립적이지만, 레트로 바이러스 기술의 개발이 크게 포유 동물 세포에서 20-23 이소성 유전 정보의 발현 안정성을 촉진했다. 그것은이 기술은 세포 및 조직 유형의 24-28 넓은 수로 29-31 또는 형질 전환 동물의 생산을위한 형광 단백질 유전자를 전송하기 위해 사용되었는지 따라서 놀라운 일이 아니다. 레트로 바이러스의 성질에 따라, 자궁외 형광 단백질의 유전 정보는 셀 (32)의 게놈 내에 도입되고, 셀에 대한 '형광 ever'된다. 이 속성은 세포 운명의 추적을 허용, 또는 세포 집단 내에서 단일 셀의했다. 지금 형광 세포 따라서 아퀴있다자신의 biosignature 빨간색과 바코드로 정의 할 수 있습니다. 독특한 biosignature 다른 세포를 식별하고, 중요한 것은 유 전적으로 구별 흡수 / 방출 스펙트럼과 다른 형광 단백질을 표현하기 위해 조작 된 세포를 구분합니다. 이러한 다 능성 33 향해 리 프로그래밍 인자 트래킹 생물학적 응용 핵소체 지역화 34 해명 용 subnuclear 요인 분석, 전사 연구 35 또는 신경 네트워크 구조 (36)의 연구 뉴런의 유전 표지 용 형광 리포터 플라스미드의 구성 같은 실험 장치에 대해 서로 다른 형광 단백질 유전자를 악용 한 그 많은 단지 네 가지 예입니다.

계측법 대체로 이러한 유전자 발현, 세포주기, 아폽토시스 같은 단일 세포 수준에서의 생물학적 과정의 분석을 위해 이용하고, 포스 포릴 통해 시그널링 된 흐름포유 동물 세포에 형광 단백질 유전자의 ATION 37-43 국지적 인 안정 표현은 더 셀 분석 38,44과 리간드 - 수용체 상호 작용 45 유동 세포 계측법의 유틸리티를 강화했다. 강화 된 기능은 세포 계측법 높은 처리량과 높은 콘텐츠가 46 스크리닝 널리 활용 방법이 될 흐름을 허용했다. 몇 플레이트 리더 시스템, 영상 및 유동 세포 계측법 수 fluorometers과 로봇 기술의 현재 확장 수에도 불구하고, 악용이 향상된 기술력을 들어갈 수있는 실험 설계의 부족있을 것 같습니다.

빠르고 안정적​​ 간단하고 강력한 세포 기반 방법들이 대폭 더 높은 처리 능력을 향상 다중화 애플리케이션 필요하다. 다중화 형식의 엔지니어링 세포 기반 분석은 높은 처리량 검사 39,47-50의 능력을 향상시킬 수있는 곳은 신약 개발 분야에서 특히 그러하다 . 그것은 하나의 샘플에서 동시 분석을 허용하는 멀티플렉싱, 더 높은 처리 능력 (51 ~ 54)을 향상시킨다. 형광 바코드 유전 우아한 다중화를 허용 할뿐만 아니라, 일단 설계 시간을 소비하는 다른 프로토콜의 필요성을 회피, 항체, 구슬 얼룩 39,52,55 수반 비용을 감소시키고, 고 필요한 화면 수를 감소시킬뿐만 아니라 처리 응용 프로그램. 우리는 최근 생물학적 응용 프로그램에 대한, 이전에 다른 임상 적으로 널리 변종 (58) HIV-1 단백질 분해 효소 활동 56,57을 모니터하기 위해 개발 된 분석을 표현함으로써 형광 유전자 바코드를 통해 멀티플렉싱을 어떻게 향상시킬 수 있는지 레트로 바이러스 기술을 설명했다. 방법론은 선택한 유전자 형광 바코드 세포를 증폭하고 뚜렷한 형광 단백질 및 / 또는 상이한 형광 intensit 발현 클론 개체군의 패널을 제조하는 방법을하는 방법에 초점을보다 설명하게 설명한다이거 야. 자신의 형광 특성에 따라 구별 세포 집단의 패널은 또한 다른 생물학적 문제를 해결 세포 기반 분석과 함께 이용 될 수있다 다중화 기능을 향상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 예를 들어 59로, 이전에 실험실에서 개발 된 세포 기반 분석의 한 베어링 바코드 세포의 패널을 설계하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 따라서 유전자 전달을위한 잘 확립 된 레트로 바이러스 / 렌티 기술, 형광 단백질의 값 또는 60,48 유세포의 어플리케이션을 나타 내기위한 것은 아니고, 오히려 다중 애플리케이션을 위해 세 개의 조합의 강화 능력을 보여주는.

프로토콜

포유 동물 세포, 유전자 바코드에 대한 바이러스 생산 및 형질 도입 1. 준비

  1. 10cm 접시에 플레이트 2.5 × 10 6 부착 세포 (또는 주위 50-60%의 컨 플루) 둘 베코의 수정 독수리 중간 10 % 소 태아 혈청 (DMEM) (FCS)에 Transfection 하루 전날. 이러한 피닉스 GP (게리 놀란, 스탠포드 대학에서 일종의 선물)와 같은 선택의 레트로 바이러스 생산 사용 포장 세포 라인.
    주 : 패키징 세포주는 안정적 트랜스 레트로 바이러스 입자 형성 용 개그 단백질 및 폴을 나타낸다. 확인 세포가 이전에 형질에, 건강하고 단층의 판에 부착 해드립니다.
  2. 24 시간 후, DNA 형질 전환 혼합물을 제조한다.
    1. 무 혈청 DMEM 125 ㎕를 3 μg의 구내염 바이러스 봉투 당 단백질 벡터 (PCI-VSVG)과이자의 형광 단백질 유전자를 운반하는 전이 벡터의 3 μg의를 추가합니다. 2 ㎎ / ㎖ (혼합 및 폴리 에틸 이민의 15 μl를 추가).
    2. 실온에서 15 분간 인큐베이션하고, 혼합물을 적가 셀에 추가한다.
      주 : 폴리 에틸 이민은 폴리 플렉스의 형성을위한 형질 전환 시약으로서 균질 DNA 혼합물에 첨가 하였다. 다른 형광 단백질 마커를 운반하는 바이러스 입자를 얻기 위해, 원하는 마커 각각 독립적 형질 전환을 수행한다. 레트로 바이러스 전달 벡터의 길이가 약 7킬로바이트이고 대략 10 KB 이상 포장 될 수 없다는 것을 기억하라.
  3. 37 ° C에서 접시를 품어. 대신에 30 ° C, 32 ° C에서 바이러스 생산 도시 판을 증가시키기 위해.
    참고 : 24 시간 후 형질 매체는 신선한 미디어 7 ㎖로 대체 될 수 있으며, 이러한 세포의 건강을 향상시킬 수 있지만, 그 상청 바이러스 양을 감소시킬 수있다.
  4. 48 시간 게시물 형질은 0.45 μM 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 필터를 뜨는 포함하는 바이러스 입자 필터를 수집합니다. 전달을 위해 갓 수집 된 바이러스 상층 액을 사용합니다. O 번째erwise C ° -80 분량 씩 뜨는을 유지하고 동결 - 해동을 피하십시오. 바이러스 역가가 각각의 동결 - 융해 사이클 아마 최대 50 % 감소한다는 것을 기억.
  5. 이전에 선택 24 시간 접시 세포주 전달하기 위해 부착하는 경우, 즉시 전달 비 부착 경우 전. 2.0 × 10 5-3.0 (여기에 허 7.5.1 및 HEK 293T) × 10 (5) 부착 세포 또는 5.0 × 10 (5) 종자 1 × 6 비 부착 세포 (여기 SupT1) 당 잘 6 웰 플레이트.
    참고 : 세포가 형질 도입시 약 60 %의 포화 상태를 달성 할 수 있도록 세포의 수는, 특히 부착 세포에 대한 있도록 전달하기 전에 접종하는 교정해야합니다.
  6. 시드 세포에 5 ㎍ / ㎖의 폴리 브렌 (hexadimethrene 브로마이드)를 추가 한 후 약 20~40% 감염 (여기에 2 ㎖) 얻기 위해 이전에 수집 된 바이러스 상층 액을 추가합니다.
    참고 : 정렬이 어떤 subpopulat를 증폭 할 수로 MOI이나 감염의 비율이 대부분 임의세포의 이온. 분명히, 감염의 높은 속도는 완화 및 증폭 과정을 가속화.
  7. 32 ° C에서 120 분 1,500 XG에 매달려 버킷 로터에서 원심 분리하여 세포를 형질 도입. 배양 전에 신선한 매체와 비 부착 세포를 재현 탁. 부착 세포의 경우, 신선한 미디어 24 시간 후 전달로 교체.
    주 : 흘리 방지하기 위해 파라 필름으로 원심 분리하기 전에 판을 밀봉하는 것이 좋습니다. 유전자 바코드 셀 다이버 시티를 증가시키기 위해, (단계 1.4로부터 구입) 상이한 형광 단백질을 운반하는 바이러스 입자로 세포를 형질 도입. 형광 마커를 선택할 때, 그들은 장비와 호환되어 있는지 확인하고는 구별 형광 매개 변수가 있습니다.

유전자 바코드 세포의 2. 선택과 증폭

  1. 전달의 비율 속도를 정량화하는 유동 세포 계측법에 의해 적어도 72 시간 게시물 전달을 형질 포유 동물 세포 분석. 음성 대조군으로 비교 비 형질 도입 된 세포주를 사용합니다.
    주 : 정렬은, 개별 바코드 세포 집단, 초기 전달의 높은 퍼센트 비율을 정제하는 데 사용될 필요하지 동안 증폭 과정을 빠르게한다.
  2. 관심의 단백질을 발현 세포를 얻기 위해 선택의 셀 소터를 이용한다.
    1. 이러한 목적을 위해, 게이트들이 적절 우측 채널에 설정되도록.
      1. 그래서 음성 대조군과 동일한 나이브 세포 라인을 사용하고 음극 형광 인구 각 축에서 10 세 이하의 값이되도록 파라미터 / 채널 전압 설정을 수행한다. 각각의 형광 채널에 대한 음성 대조군의 위에 표시 이벤트로 긍정적 인 형광 게이팅 결정합니다.
    2. 각 악기는 다를 수 있음을 인식하고 게이팅을 결정하기위한 올바른 전압은 모든 특급에 필수적 양성 및 음성 컨트롤을 만들고 그에 따라 조정되어야한다erimental 설정.
      1. 이 실험 장치에서 형광 검출 TD를 토마토에 대한 eGFP는 대한 FITC 채널 (502 장거리 패스 필터에 의해 진행 30분의 530 대역 통과 필터), PE 채널 (556 장거리 패스 필터에 의해 진행 42분의 585 대역 통과 필터)를 사용 E2 크림슨, 그리고 APC 채널 (20분의 660 밴드 패스 필터).
        참고 : E2 크림슨은 633 nm의 레이저에 의해 흥분되는 동안 488 nm의 레이저 eGFP는 및 TD 토마토 흥분.
  3. 100 % FCS 1 ㎖와 정렬에 15 ML 원뿔 튜브.
    참고 : 하나 직접 개별 클론 (아래 참조)의 종류를 진행할 수있는 형광 세포 집단을 분류하는 과정은 의무적으로하지 않습니다. 선택 형광을 기반으로 꽉 인구를 정​​렬하면 개별 클론의 미래 선택을위한 백업 인구를 보장합니다. 각각의 세포는 항상 세포의 많은 인구 쉽게 냉동 한 후 해동 이후 단계에서 증폭 될 수있다 성장하기 어려운 있음을 알아 두셔야합니다.
  4. SP5 분 32 ° C에서 524g에 매달려 버킷 로터 원심 분리기에 정렬 된 인구 아래에서 셀을 펠렛. 신선한 미디어 1 ㎖에 재현 탁하고, 그 세포 컨 플루 적어도 이틀 동안 성장과 분열을 허용하도록 60 % 미만 정도로 세포 플레이트 재.
    1. 예를 들어, 6 웰 플레이트에 웰 당 미디어 2 ㎖에서 약 3 × 10 5 세포와 6cm ​​판에서 미디어 2 ㎖에 2 × 10 6 세포에서 플레이트 부착 세포. 미부착 세포 부착 및 세포에 대해 RPMI DMEM을 사용하여 (또는 임의의 특정 매체 필요한 경우). 증폭을 할 수 있도록 몇 일 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 도금 세포를 놓습니다.

3. 다른 강렬에서 유전자 바코드 세포의 클론 인구를 얻습니다

  1. 원래 형질 세포 클론 인구를 확보 (1.7 단계) 또는 정렬 된 인구에서 (단계 2.3).
    참고 :이 모든 세포 사이에 형광 단백질의 발현과 같거나 유사한 수준을 보장합니다집단 내의 S (40 %의 평균 형광 강도에서 작은 CV와 타이트한 인구).
    1. 그 목적을 위해, 자동화 된 셀 증착 부 (ACDU) 96 웰 플레이트로 정렬 단셀. 관심의 인구에 따라 정렬 게이트를 설정합니다. 확인 게이트는 서로 다른 형광 강도에 셀을 선택할 때 구별 인구를 얻기 위해 떨어져 적어도 하나의 로그 스케일을 설정합니다. 여기에 표시된 절차, 단계 2.2에 설명 된대로 설정 실험 세포 계측법 같은 흐름을 사용합니다.
  2. 약 2 주 동안 37 ℃의 배양기에서 개별 클론을 증폭. 증폭 과정을 통해 성장하는 인구가 하나 이상의 개별 셀들에서 발생되지 않도록 현미경으로 세포를 분석한다.
    참고 : 정렬은 평​​균에 잘 당 하나의 셀을 배치합니다, 일부 우물에서 모든 셀이 없을 수 있지만, 다른 사람들이 하나 이상있을 수 있음을 기억하십시오.
    1. 포 있도록하려면pulation는, 플레이트와 매우 부드러운하고 피펫으로 우물을 방해 결코 하나의 셀에서 발생한다. 현미경, 잘 잘하여 판을 준수하십시오.
      참고 : 각각의 세포는 항상 그들이 쉽게 알아볼 수있을 것입니다 분할하기 시작하면, 확인하는 것이 어려울 수도있다.
    2. 가장자리를 따라 종종 세포 '덩어리'그주의하십시오. 여러 클론 인구 관찰 할 수있는 그 우물을 버리고 하나 꽉 인구를 가지고 그 사람들을 유지.
      참고 :이 증폭에 큰 접시에 사람들을 전송하는 것이 좋습니다.
  3. 유동 세포 계측법에 의해 이들을 분석하여 클론의 개체군을 추정 화면. 실험 장치 세포 계측법 같은 흐름을 이용하여 음성 대조군에 비교.
    1. 샘플의 일부만을 분석하고 백업으로 나머지를 유지합니다. 평균 강도 및 인구의 압박감을 기반으로 가장 뚜렷하게 별도의 인구를 선택합니다. 필요에 따라 증폭 또는에서 주식을 동결더 이상 시간 또는 액체 질소의 짧은 기간 동안 -80 ° C에서 20 % 글리세롤과 미디어를 동결.
      참고 : '진정한'클론 인구가 아주 꽉 형광 패턴을 가져야한다는 것을 기억하십시오.

4. (HTS)을 높은 처리량 검진에 대한 다중화 기능을 확인하십시오

  1. 상기 다중화 된 포맷으로 이용 될 수있는 필요한만큼 뚜렷한 클론 개체군 수확기. 구별 흡수 / 방출 스펙트럼 및 / 또는 다른 강도와 클론을 선택합니다. 96- 웰 플레이트 형식 HTS 적합되는 사용되는 경우, 200 μL에 50,000 세포를 웰 당 종자.
    참고 : 세포의 수는 추정치이며, 세포 유형에 따라 변경 될 수 있으며이 부착인지 여부 있음을 알아 두셔야합니다.
  2. 독립적 인 형광 확립 된 세포주의 각각이 서로 구별 될 수 있도록 유동 세포 계측법을 사용하여 샘​​플을 분석. 분석에 앞서 음의 준비단일 색상 컨트롤이 매개 변수와 보정 값을 설정합니다.
    참고 : 분명히을 가능하게 혼합 된 인구를 구분하는 매개 변수를 설정하면 더 다중화 형식으로 사용합니다.

5. 선택의 생물학적 응용 프로그램에 대한 유전자 바코드 세포주를 적응

  1. Stolp 외., 2013 (59)에서 여기에 기술 된 바와 같이 원하는 분석 소자를 포함하는 바이러스 입자 유전자 바코드 확립 된 세포주를 형질 도입. 선택의 추가적인 분석은 형광과 구별 채널을 점유한다는 것을 기억하고, 따라서 적절한 바코드 세포주에 전달하여야한다.
    주 : 각 바코드 세포주는 다른 분석을 품을 수있다.
  2. 분석 요소를 포함 할 것들에 대한 정렬 유전자 형광 바코드 세포.
    참고 : 분석 요소는 F (융합 또는 내부 리보솜 항목 사이트를 통해) 태그 또는 형광 단백질에 결합 설계 할 수있다또는 간단 검출 서부 블로 팅, 세포 계측법 또는 현미경 흐름. 이 프로토콜에 사용 된 시스템은 혼자 HA 항원의 표면 발현에 의존, 또는 추가 FLAG 에피토프 식.
    1. HA 및 APC-형광 결합 된 항체와 분석을 포함하는 클론 인구를 얼룩. 그리고 안티 - 플래그와 FITC - 복합 항체 염색 클론 인구를 분석 할 수 있습니다.
    2. 분석을 다시 추적하기 위해 분석 또는 '디코드'고유 유전자 바코드 세포주가 구별 될 수있는 적절한 채널 인구. 여기서, TD 토마토 검출 PE 채널에서 분석함으로써, 기판의 특성을 디코딩.

결과

다중화 형광 유전자 개별 클론 집단이 생성되면 만 달성 될 수 생물학적 응용을 목적으로 세포를 바코드. 바코드 인구가 최소한의 스펙트럼 오버랩 명확 별개의 형광 특성이있을 때 다중 가장 효과적입니다. 포유류 SupT1 세포의 클론 집단으로도 1에 도시 된 예와 mCherry 아노 형광 단백질 (CFP)와 바코드 세포 용이 개별 형광 특성을 잃지 않고 동시에 분석 할 수 있음을 나타낸다. 이 행렬...

토론

여기에 두 잘 확립 된 절차가 결합되었습니다; 레트로 바이러스 및 기술을 이용하여 유세포 형광 단백질의 검출을 통해 유전 공학. 고유 세포주의 제조 계 형광 단백질 유전자 바코드 다중화 애플리케이션 견고하고 간단한 방법을 제공한다. 레트로 바이러스 유전자 조작 기술을 통해 세포 바코드를 생성하는 초기 긴 과정이지만, 한 번, 셀 물질의 신뢰성 있고 안정된 소스를 설립 얻게한다. 이 기?...

공개

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 말

우리는 레트로 바이러스 입자의 생산을 위해 피닉스 GP 포장 세포주를 제공하기 위해 스탠포드 대학에서 박사 게리 놀란에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 TD 토마토를 제공하기 위해 캘리포니아 샌디에고 대학에서 박사 로저 첸 감사합니다. 우리는 또한 자신의 서비스와 도움을 샌디에고 주립 대학 유동 세포 계측법 핵심 시설에게 감사의 말씀을 전합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
10 ml syringesBD309604used for filtering the virus
0.45 µm ploytetrafluoroethylene filterPall Corporation4219used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Corning45000-304cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)poly sciences23966-22 mg/ml concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)Eppendorf5805 000.017used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)Corning21-040-CVused for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)Sigma-Aldrich107689Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration.
FACSAriaBD Biosciencesinstrument used for sorting cell populations
FACSCantoBD Biosciencesinstrument used for cell analysis
Phoenix-GPGift from Gary Nolancell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serumMediatechMT35015CVused for cell growth and sorting
SupT1 cellsATCCCRL-1942Human T lymphoblasts
HEK 293T cellsATCCCRL-11268Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640Corning10-040-CVcell growth media for SupT1 cells

참고문헌

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