Lesiones Embarcaciones mecánica en embriones de pez cebra

Resumen

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Resumen

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

Introducción

Zebrafish have been used extensively to study a variety of topics in vascular biology, including vascular development, angiogenesis, and hematopoietic development and pathology^1-3. Embryos develop a functional circulation as well as leukocytes and other components of the innate immune system by 1 day post fertilization (dpf) ^1,4,5. The conservation of the inflammatory and leukocyte response to injury has made the zebrafish embryo an informative model for such diverse inflammatory processes as tuberculous infection, enterocolitis, and tissue regeneration^6-9. Zebrafish embryos have been used to study injury-related inflammation particularly in the context of epithelial wounding and the neutrophil response^10,11. Injury to the embryo results in a highly conserved cellular response from cells at the injury site and the innate immune cells recruited to respond to the injury and regulate its resolution^11,12. Other injury models have used focused laser pulses to spatially localize injury to specific cell types including neurons, muscle cells, and cardiomyocytes^13-15.

Zebrafish embryos have been used as a model to study hemostasis and thrombosis in conditions of pharmacological and genetic manipulation, using both mechanical and laser-induced thrombus formation^16-19. Components of the coagulation cascade appear to be well-conserved and transgenics have allowed for detailed studies of thrombocyte and fibrin deposition at the site of coagulation^17,20,21. The procedure presented in this paper complements these methods by providing a system for studying mechanical vessel injury resulting in vessel breach, thrombus formation and resolution, and vessel repair.

Protocolo

NOTA: Procedimientos utilizando el pez cebra fueron aprobados por Institutional Animal Care de UCSF y el empleo.

1. Preparación de Herramientas

1. Inserte el pasador de minucias en un soporte de pasador y sujete el pasador.
2. Con unas pinzas de punta fina, doble cuidadosamente la punta del pasador para crear un ligero gancho.
3. Para la manipulación y la estabilización del embrión durante la lesión, doblar el extremo de un calibre 28 ½ pulgadas aguja montada en una jeringa de insulina con unos alicates de punta fina.

2. Preparación de embriones de pez cebra para Lesiones

1. Configure parejas reproductoras de pez cebra y recoger los huevos en el agua de huevo (sales acuario 60ug / mL) como se muestra previamente ^22.
2. Añadir 0,003% N-feniltiourea (PTU) al agua de huevo cuando los embriones son aproximadamente 8 horas después de la fecundación (HPF) para evitar melanization.
3. Dechorionate dos día después de la fertilización (dpf), los embriones antes del experimento utilizando unas pinzas de punta fina.
   NOTA: Los embriones se pueden lesionar en cualquier momento después de que comience la circulación. Los datos presentados aquí es para 2 dpf embriones, pero la técnica se ha aplicado con éxito en embriones hasta 5 dpf.
4. Anestesiar a los embriones con 0,02% tamponada de ácido 3-aminobenzoico (tricaína) aproximadamente 10 minutos antes de las manipulaciones.

3. Recipiente Mecánica Lesión de embriones

1. Transferencia de embriones anestesiados a una diapositiva depresión en un microscopio estereoscópico de disección utilizando una pipeta de transferencia.
2. Usando el lado plano corto de la aguja de la jeringa para manipular el embrión con la mano dominante, posicionar el embrión en su lado con la superficie ventral de espaldas a la aguja.
3. Coloque el pasador de minucias con la punta apuntando directamente contra la superficie ventral de la posterior peces a la abertura urogenital. Coloque el pasador de minucias en un ligero ángulo tal que la punta curvada es capaz de perforar a través de la peridermis directamente en la vena caudal (Figura 1 </ Strong>).
4. Uso de la aguja de la jeringa para manipular el embrión, perforar la vena caudal con el pasador de minucias tocando el embrión en el pasador para enganchar el pasador ligeramente en la vena.
5. Uso de la aguja de la jeringa, tire el embrión lejos de la clavija de minucias para crear un pequeño desgarro en el recipiente.
   NOTA: Una lesión éxito dará lugar a sangrado inmediato de la vena.

4. Análisis de la hemostasia

1. Elija sólo los embriones con visiblemente células sanguíneas circulantes para este procedimiento.
2. Preparar para iniciar el temporizador, tan pronto como el pasador de minucias se tira desde el recipiente.
3. Inicie el temporizador tan pronto como la pérdida de sangre puede ser visualizada de la herida. Cuando la pérdida de sangre de la herida cesa, detener el cronómetro y registrar el tiempo total como el tiempo de sangrado. Si se inhibe la coagulación, registrar el tiempo para cuando hay ya no visiblemente las células sanguíneas circulantes.

5. Análisis de Curación de Heridas

1. Pos de Transferenciaanimales camiseta de lesiones en placas de formación de imágenes de fondo de vidrio para microscopía.
2. Eliminar la mayor parte del agua del huevo.
3. Cubra los embriones en 0,3 a 1,2% de baja fusión de agarosa disueltos en el agua de huevo, se calentó a entre 42 y 45 ºC y suplementadas con 0.02% tricaína.
4. Posición embriones en sus lados con fórceps.
5. Después de la agarosa se enfría, llenar el plato con un 0,02% tricaína en agua huevo.
6. Adquirir imágenes con campo claro, epifluorescencia, o microscopía confocal.
7. Retire embrión de la agarosa utilizando pinzas y traslado de regreso al agua huevo.

Resultados

Lesión de los vasos mecánica se realizó el 2 de fdd embriones (Figura 2A - C). Lesión resulta en una respuesta rápida y fiable de la coagulación como medidas por el tiempo hasta el cese de la hemorragia (Figura 2D). Para determinar si o no diferencias en la respuesta de coagulación se podrían medir, la hirudina anticoagulante se administró a los embriones mediante inyección en el conducto de Cuvier inmediatamente antes de heridas (5-10 nl de 1 unidad por l hir...

Discusión

El pez cebra se han utilizado con éxito como un modelo para diferentes tipos de heridas incluyendo lesiones láser ^13-15, trombosis inducida por láser ^16, y epitelial hiriendo a ^10. Se presenta un método de la herida mecánico que es fácil de ejecutar y produce una lesión controlada en un modelo in vivo que es altamente susceptible a la microscopía en tiempo real. Lesión resulta en una respuesta hemostática rápido y medible y un programa de reparación de herid...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Minutia Pins	Fine Science Tools	26002-10	Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm
Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Dumont #5 Fine Tip Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Glass Depression Slide	Aquatic Eco-Systems	M30
Low Melting Agarose	Lonza	50081	Preheated to 42 º C
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629
3-aminobenzoic acid (Tricaine)	Sigma Aldrich	E10521
Hirudin	Sigma Aldrich	H7016
Glass bottom imaging dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C
Dissecting microscope	Olympus	SZH10
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Observer
Aquarium salts	Instant Ocean
Insulin syringe with 28G1/2 needle	Becton Dickinson	329461