Zebra balığı Embriyolar Mekanik Gemi Sakatlık

Özet

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Özet

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

Giriş

Zebrafish have been used extensively to study a variety of topics in vascular biology, including vascular development, angiogenesis, and hematopoietic development and pathology^1-3. Embryos develop a functional circulation as well as leukocytes and other components of the innate immune system by 1 day post fertilization (dpf) ^1,4,5. The conservation of the inflammatory and leukocyte response to injury has made the zebrafish embryo an informative model for such diverse inflammatory processes as tuberculous infection, enterocolitis, and tissue regeneration^6-9. Zebrafish embryos have been used to study injury-related inflammation particularly in the context of epithelial wounding and the neutrophil response^10,11. Injury to the embryo results in a highly conserved cellular response from cells at the injury site and the innate immune cells recruited to respond to the injury and regulate its resolution^11,12. Other injury models have used focused laser pulses to spatially localize injury to specific cell types including neurons, muscle cells, and cardiomyocytes^13-15.

Zebrafish embryos have been used as a model to study hemostasis and thrombosis in conditions of pharmacological and genetic manipulation, using both mechanical and laser-induced thrombus formation^16-19. Components of the coagulation cascade appear to be well-conserved and transgenics have allowed for detailed studies of thrombocyte and fibrin deposition at the site of coagulation^17,20,21. The procedure presented in this paper complements these methods by providing a system for studying mechanical vessel injury resulting in vessel breach, thrombus formation and resolution, and vessel repair.

Protokol

NOT: Zebra balığı kullanarak Prosedürleri UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Araçlar 1. Hazırlık

1. Bir iğne tutucu içine minutia pimini takın ve pin kelepçe.
2. Ince uçlu forseps kullanarak, dikkatli bir hafif kanca oluşturmak için pimin ucunu bükün.
3. Manipülasyon ve yaralanma sırasında embriyonun stabilizasyonu için, iğne-burun pense kullanarak bir insülin şırınga üzerine monte edilmiş bir 28 guage ½ inç iğne ucunu bükün.

Sakatlık için Zebra balığı Embriyolar 2. Hazırlık

1. Zebra balığı yetiştiriciliği çiftleri kurmak ve daha önce ²² gösterildiği gibi yumurta su (60ug / ml akvaryum tuzları) yumurta toplamak.
2. Embriyolar yaklaşık melanization önlemek için 8 saat sonra döllenme (hpf) olduğunda yumurta suya% 0.003 N-feniltiyoüre (PTU) ekleyin.
3. Ince uçlu forseps kullanarak deney öncesinde dechorionate iki gün sonrası fertilizasyon (dpf) embriyolar.
   Not: dolaşım başladıktan sonra Embriyolar her zaman yaralı olabilir. Burada sunulan veriler embriyolar dpf'e 2 için, ama tekniği başarıyla 5 dpf'e kadar embriyolarda uygulanmıştır.
4. % 0.02 tamponlanmış 3-aminobenzoik asit (Tricaine), önceki kontroller için yaklaşık 10 dakika ile embriyolar anestezisi.

3. Mekanik Gemi Embriyolar yaralanması

1. Bir transfer pipeti kullanarak bir diseksiyon stereomikroskopta bir depresyon slayt anestezi embriyolar transfer.
2. Dominant elin ile embriyo işlemek için şırınga iğnesi kısa düz tarafını kullanarak, uzak iğne bakan ventral yüzeyi ile yan embriyo yerleştirin.
3. Ucu ile minutia pimi ürogenital açılış balık posterior ventral yüzeyine doğrudan işaret yerleştirin. Hafif bir açıyla minutia pimini yerleştirin böyle kavisli ucu kaudal ven (Şekil 1 periderm delip mümkün olduğunu/ Strong>).
4. Embriyo işlemek için şırınga iğnesi kullanarak, hafifçe damar içine iğne kanca pin içine embriyo dokunarak minutia iğne ile kaudal ven delmek.
5. Şırınga iğnesi kullanarak, kap içinde küçük bir gözyaşı oluşturmak için uzak minutia pin embriyo çekin.
   NOT: Başarılı bir yaralanma damarından derhal kanama neden olur.

Hemostazın 4. Analizi

1. Gözle görülür bu işlem için kan hücreleri dolaşımdaki sadece embriyolar seçin.
2. En kısa sürede minutia pimi kabından çekilir gibi zamanlayıcı başlamak için hazırlayın.
3. En kısa sürede kan kaybı yaradan görüntülenmiştir edilebilir Sayacı başlatmak. Yaradan kan kaybı kesildiğinde, Sayacı durdurmak ve Zaman Kanama gibi toplam süreyi kaydetmek. Pıhtılaşma engellenir ise, artık gözle görülür dolaşan kan hücreleri varken zaman kaydedin.

Yara Şifa 5. Analizi

1. Aktarım posmikroskopi için cam alt görüntüleme yemekleri üzerine t-yaralanma hayvanlar.
2. Yumurta suyun çoğunluğu çıkarın.
3. ºC 42 ila 45 kadar ısıtılır ve% 0.02 Tricaine ile takviye agaroz yumurta suda çözünmüş 0,3-1,2% düşük erime embriyolar, örtün.
4. Forseps kullanarak kendi yüzüne Pozisyon embriyolar.
5. Agaroz soğuduktan sonra, yumurta, su içinde% 0,02 Tricaine ile çanak doldurun.
6. Aydınlık, Epifloresans veya konfokal mikroskopi kullanılarak görüntü elde.
7. Forseps kullanarak agaroz embriyo çıkarın ve yumurta suya geri aktarın.

Sonuçlar

Mekanik damar hasarı embriyolar (- C Şekil 2A) dpf, 2 gerçekleştirilmiştir. Hızlı ve güvenilir bir pıhtılaşma yanıt olarak yaralanma sonucu (Şekil 2D) kanamanın durdurulması zaman ile ölçülmüştür. Pıhtılaşma karşılık olarak fark ölçülebilir olup olmadığını belirlemek için, pıhtılaşma önleyici Hirudin (için hemen önce (5-10 nl su içinde çözülmüş hirudin ul başına 1 ünite) yaralama ile Cuvier'in gösterilen kanal içine enjekte embriyo...

Tartışmalar

Balığı ¹⁰ yaralama lazer yaralanması ^13-15, lazer kaynaklı tromboz ¹⁶ ve epiteliyal da dahil olmak üzere yaraların farklı türleri için bir model olarak başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bu çalıştırmak için basit ve gerçek zamanlı mikroskopi için son derece müsait olan bir in vivo modeli olarak kontrollü bir yaralanma üreten mekanik yaralama için bir yöntem sunulmaktadır. Hızlı ve ölçülebilir hemostatik tepki ve görüntü ve timelapse mikr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Minutia Pins	Fine Science Tools	26002-10	Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm
Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Dumont #5 Fine Tip Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Glass Depression Slide	Aquatic Eco-Systems	M30
Low Melting Agarose	Lonza	50081	Preheated to 42 º C
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629
3-aminobenzoic acid (Tricaine)	Sigma Aldrich	E10521
Hirudin	Sigma Aldrich	H7016
Glass bottom imaging dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C
Dissecting microscope	Olympus	SZH10
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Observer
Aquarium salts	Instant Ocean
Insulin syringe with 28G1/2 needle	Becton Dickinson	329461