Механическая судно Травмы у эмбрионов данио рерио

Резюме

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Аннотация

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

Введение

Zebrafish have been used extensively to study a variety of topics in vascular biology, including vascular development, angiogenesis, and hematopoietic development and pathology^1-3. Embryos develop a functional circulation as well as leukocytes and other components of the innate immune system by 1 day post fertilization (dpf) ^1,4,5. The conservation of the inflammatory and leukocyte response to injury has made the zebrafish embryo an informative model for such diverse inflammatory processes as tuberculous infection, enterocolitis, and tissue regeneration^6-9. Zebrafish embryos have been used to study injury-related inflammation particularly in the context of epithelial wounding and the neutrophil response^10,11. Injury to the embryo results in a highly conserved cellular response from cells at the injury site and the innate immune cells recruited to respond to the injury and regulate its resolution^11,12. Other injury models have used focused laser pulses to spatially localize injury to specific cell types including neurons, muscle cells, and cardiomyocytes^13-15.

Zebrafish embryos have been used as a model to study hemostasis and thrombosis in conditions of pharmacological and genetic manipulation, using both mechanical and laser-induced thrombus formation^16-19. Components of the coagulation cascade appear to be well-conserved and transgenics have allowed for detailed studies of thrombocyte and fibrin deposition at the site of coagulation^17,20,21. The procedure presented in this paper complements these methods by providing a system for studying mechanical vessel injury resulting in vessel breach, thrombus formation and resolution, and vessel repair.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры с использованием данио были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета UCSF-х годов.

1. Подготовка инструментов

1. Вставьте мелочах штифт в держатель контактный и зажмите палец.
2. Использование тонких наконечников щипцов, осторожно отогните кончиком пальца, чтобы создать небольшое крючок.
3. Для манипуляции и стабилизации эмбриона во время травмы, согните конец 28 ЯЗЫК ½ дюйма иглы, установленной на инсулиновый шприц с использованием остроносые плоскогубцы.

2. Подготовка эмбрионов данио рерио за травмы

1. Настройка гнездящихся пар данио и собирать яйца в яйца водой (60ug / аквариум солей мл), как было показано ранее ^22.
2. Добавить 0,003% N-фенилтиомочевины (ПТУ) к яичной водой, когда эмбрионы примерно 8 ч после оплодотворения (ФВЧ), чтобы предотвратить меланизации.
3. Dechorionate два дня после оплодотворения (DPF) эмбрионы до эксперимента с использованием тонких наконечников щипцов.
   Примечание: Эмбрионы могут быть повреждены в любое время после начала циркуляции. Представленные здесь данные для 2 DPF эмбрионов, но техника была успешно применена в эмбрионах до 5 DPF.
4. Обезболить эмбрионов с 0,02% буферном 3-аминобензойной кислоты (Tricaine) примерно 10 минут до манипуляции.

3. Механическая судно Травмы эмбрионов

1. Трансфер наркотизированных эмбрионов к депрессии слайда на вскрытии стереомикроскопом с помощью передачи пипетки.
2. Использование короткого плоскую сторону иглы шприца манипулировать эмбриона с доминирующей стороны, положение эмбриона на бок с вентральной поверхности, обращенной в сторону от иглы.
3. Установите мелочах контактный с наконечником направлен непосредственно против вентральной поверхности рыбы кзади от открытия мочеполовой. Установите мелочах штифт под небольшим углом, так что изогнутая наконечник может пробить перидермы непосредственно в хвостовую вену (рис 1 </ STRONG>).
4. Использование иглу шприца, чтобы манипулировать эмбриона, проколоть хвостовую вену с мелочах штифта, нажав на эмбрион в булавку, чтобы немного зацепить штифт в вену.
5. Использование иглу шприца, потяните эмбрион от мелочах булавку, чтобы создать небольшой разрыв в сосуде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: успешное что приведет к травмам в непосредственной кровотечения из вены.

4. Анализ гемостаза

1. Выбирайте только эмбрионы с явно циркулирующих в крови клеток для этой процедуры.
2. Подготовьте, чтобы начать таймер, как только мелочах контактный вытягивается из сосуда.
3. Запустите таймер, как только потеря крови могут быть визуализированы из раны. При потере крови из раны прекращается, остановить таймер и записывать общее время в время кровотечения. Если свертывания тормозится, записывать время, когда к уже не заметно циркулирующих клеток крови.

5. Анализ заживления ран

1. Передача позT-травмы животных на стеклянное дно блюд изображений для микроскопии.
2. Удалить большинство яиц водой.
3. Обложка эмбрионов в 0,3-1,2% низкой температурой плавления агарозы растворенные в яичном воды, нагревают до температуры 42 и 45 ° С и с добавкой 0,02% Tricaine.
4. Эмбрионы Позиция на боку с помощью щипцов.
5. После агарозном охлаждает, заполните блюдо с 0,02% Tricaine в яйце воды.
6. Получение изображений с помощью светлого поля, эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.
7. Удалить эмбрион из агарозы с помощью щипцов и передать обратно в яйцо воду.

Результаты

Механические травмы сосуда проводили на 2 денье эмбрионов (фиг.2А - С). Результаты травм при быстрой и надежной связи коагуляции измеряется время прекращения кровотечения (рис 2d). Чтобы определить, может ли или нет быть измерена различия в ответ коагуляции, ант?...

Обсуждение

Данио рерио были успешно использованы в качестве модели для разных типов ран, включая лазерную травму ^13-15, лазерно-индуцированной тромбоз ¹⁶ и эпителиальные ранив ^10. Мы сообщаем метод механического ранения, которое является простым для выполнения и производит контрол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Minutia Pins	Fine Science Tools	26002-10	Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm
Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Dumont #5 Fine Tip Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Glass Depression Slide	Aquatic Eco-Systems	M30
Low Melting Agarose	Lonza	50081	Preheated to 42 º C
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629
3-aminobenzoic acid (Tricaine)	Sigma Aldrich	E10521
Hirudin	Sigma Aldrich	H7016
Glass bottom imaging dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C
Dissecting microscope	Olympus	SZH10
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Observer
Aquarium salts	Instant Ocean
Insulin syringe with 28G1/2 needle	Becton Dickinson	329461