ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

要約

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

要約

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

概要

Zebrafish have been used extensively to study a variety of topics in vascular biology, including vascular development, angiogenesis, and hematopoietic development and pathology^1-3. Embryos develop a functional circulation as well as leukocytes and other components of the innate immune system by 1 day post fertilization (dpf) ^1,4,5. The conservation of the inflammatory and leukocyte response to injury has made the zebrafish embryo an informative model for such diverse inflammatory processes as tuberculous infection, enterocolitis, and tissue regeneration^6-9. Zebrafish embryos have been used to study injury-related inflammation particularly in the context of epithelial wounding and the neutrophil response^10,11. Injury to the embryo results in a highly conserved cellular response from cells at the injury site and the innate immune cells recruited to respond to the injury and regulate its resolution^11,12. Other injury models have used focused laser pulses to spatially localize injury to specific cell types including neurons, muscle cells, and cardiomyocytes^13-15.

Zebrafish embryos have been used as a model to study hemostasis and thrombosis in conditions of pharmacological and genetic manipulation, using both mechanical and laser-induced thrombus formation^16-19. Components of the coagulation cascade appear to be well-conserved and transgenics have allowed for detailed studies of thrombocyte and fibrin deposition at the site of coagulation^17,20,21. The procedure presented in this paper complements these methods by providing a system for studying mechanical vessel injury resulting in vessel breach, thrombus formation and resolution, and vessel repair.

プロトコル

注：ゼブラフィッシュを使用した手順は、UCSFの施設内動物管理使用委員会によって承認された。

ツールの調製

1. ピンホルダーに特徴点のピンを挿入し、ピンをクランプ。
2. 先端の細い鉗子を使用して、慎重にわずかにフックを作成するために、ピンの先端を曲げる。
3. 負傷中の胚の操作および安定化のために、ラジオペンチを使用して、インスリン注射器に取り付けられた28ゲージ1/2インチの針の端を曲げ。

傷害のためのゼブラフィッシュ胚の作製

1. ゼブラフィッシュの繁殖ペアを設定し、以前に²²示すように、卵の水（60ug / mLの水族館塩）で卵を集める。
2. 胚はメラニン化を防ぐために、約8時間後に受精（HPF）であるとき、卵の水に0.003％、N-フェニルチオ尿素（PTU）を追加します。
3. 先端の細い鉗子を用いた実験に先立ってDechorionate 2日後の受精（DPF）の胚。
   注：循環開始後胚はいつでも怪我をすることができます。ここに示されたデータは、胚のdpf 2のためであるが、技術は成功し5のdpfまでの胚で適用されている。
4. 0.02％緩衝化3-アミノ安息香酸（トリカイン）前の操作に約10分を有する胚を麻酔。

胚の3。機械的血管損傷

1. 転送ピペットを用いて、解剖実体顕微鏡でうつ病のスライドに麻酔をかけた胚を転送します。
2. 利き手で胚を操作するために注射針の短い平らな面を使用して、腹面が針から離れて向けてその側に胚を配置する。
3. 先端で特徴点のピンの位置を決め泌尿生殖器の開口部に魚の後部の腹面に対して直接指摘した。湾曲した先端が尾静脈（ 図1 <に直接周皮を貫通することができるようにわずかな角度で特徴点のピンを配置します/強い>）。
4. 胚を操作するために注射針を使用して、少し静脈にピンをフックするピンに胚をタップして特徴点ピンと尾静脈を貫通。
5. 注射針を使用して、容器内の小さな涙を作成するために離れて特徴点ピンから胚を引き出します。
   注：成功した損傷は静脈から即時の出血になります。

止血4.分析

1. 目に見えて、この手順のために血液細胞の循環を持つ唯一の胚を選択してください。
2. とすぐに特徴点ピンが容器から引っ張られるようにタイマーを開始する準備をします。
3. とすぐに血液損失を傷から可視化することができるようにタイマーを起動します。傷口からの血液損失がなくなると、タイマーを停止し、出血時間として総時間を記録する。凝固が抑制される場合には、もはや目に見えて循環する血液細胞が存在しないときまでの時間を記録する。

創傷治癒の5.分析

1. 転送POS顕微鏡用ガラスボトムイメージング皿上にT-傷害動物。
2. 卵の水の大部分を削除します。
3. アガロース42〜45ºCに加熱し、卵の水に溶解し、0.02％トリカインで補充0.3から1.2パーセントの低融点で胚をカバーする。
4. ピンセットを用いて、その両側に位置胚。
5. アガロースが冷却した後、卵の水中の0.02％トリカインで料理を埋める。
6. 明視野、落射蛍光、または共焦点顕微鏡を用いて画像を取得する。
7. ピンセットを用いてアガロースから胚を取り出し、卵の水に戻って転送する。

結果

機械的な血管損傷が2 dpfの胚（ - C図2A）で行った。 （ 図2D）出血の停止までの時間によって測定されるように、迅速かつ信頼性の高い凝固応答の傷害をもたらす。凝固応答の差異を測定することができたか否かを判断するために、抗凝固ヒルジンはのために（直前に（水に溶解μlのヒルジンあた​​り1単位の5~10オランダ）を創傷にキュビエのダクトへの注入によっ?...

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、レーザー傷害^13-15、レーザー誘発血栓^16、および上皮創傷¹⁰を含む創傷の異なるタイプのモデルとして成功裡に使用されている。我々は、実行が簡単であり、リアルタイムの顕微鏡検査に非常に適しているin vivoモデルで制御怪我を生産機械的損傷の方法を報告している。迅速かつ測定可能な止血応答映像やタイムラプス顕微鏡を用いてモニ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Minutia Pins	Fine Science Tools	26002-10	Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm
Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Dumont #5 Fine Tip Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Glass Depression Slide	Aquatic Eco-Systems	M30
Low Melting Agarose	Lonza	50081	Preheated to 42 º C
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629
3-aminobenzoic acid (Tricaine)	Sigma Aldrich	E10521
Hirudin	Sigma Aldrich	H7016
Glass bottom imaging dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C
Dissecting microscope	Olympus	SZH10
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Observer
Aquarium salts	Instant Ocean
Insulin syringe with 28G1/2 needle	Becton Dickinson	329461