Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Zusammenfassung

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

Einleitung

Zebrafish have been used extensively to study a variety of topics in vascular biology, including vascular development, angiogenesis, and hematopoietic development and pathology^1-3. Embryos develop a functional circulation as well as leukocytes and other components of the innate immune system by 1 day post fertilization (dpf) ^1,4,5. The conservation of the inflammatory and leukocyte response to injury has made the zebrafish embryo an informative model for such diverse inflammatory processes as tuberculous infection, enterocolitis, and tissue regeneration^6-9. Zebrafish embryos have been used to study injury-related inflammation particularly in the context of epithelial wounding and the neutrophil response^10,11. Injury to the embryo results in a highly conserved cellular response from cells at the injury site and the innate immune cells recruited to respond to the injury and regulate its resolution^11,12. Other injury models have used focused laser pulses to spatially localize injury to specific cell types including neurons, muscle cells, and cardiomyocytes^13-15.

Zebrafish embryos have been used as a model to study hemostasis and thrombosis in conditions of pharmacological and genetic manipulation, using both mechanical and laser-induced thrombus formation^16-19. Components of the coagulation cascade appear to be well-conserved and transgenics have allowed for detailed studies of thrombocyte and fibrin deposition at the site of coagulation^17,20,21. The procedure presented in this paper complements these methods by providing a system for studying mechanical vessel injury resulting in vessel breach, thrombus formation and resolution, and vessel repair.

Protokoll

HINWEIS: Verfahren mit Zebrafisch wurden von UCSF Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Herstellung der Werkzeuge

1. Legen Minutien Stift in ein Stifthalter und klemmen Sie den Stift.
2. Mit feiner Spitze Pinzette vorsichtig biegen Sie die Spitze des Stiftes, um einen leichten Haken erstellen.
3. Für Bearbeitung und Stabilisierung des Embryos während Verletzungen, biegen Sie das Ende einer 28 Gauge ½ Zoll-Nadel auf einer Insulinspritze mit Spitzzange montiert.

2. Herstellung von Zebrafischembryonen für Verletzungen

1. Richten Sie Zebrafisch Brutpaare und sammeln Eier im Eier Wasser (60ug / ml Aquarium Salze), wie zuvor ²² gezeigt.
2. Fügen 0,003% N-Phenylthioharnstoff (PTU) mit dem Ei Wasser, wenn die Embryonen etwa 8 Stunden nach der Befruchtung (HPF) zu Melanisierung verhindern.
3. Dechorionate 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) Embryonen vor dem Experiment mit feiner Spitze Pinzette.
   Hinweis: Die Embryonen können jederzeit verletzt, nachdem Kreislauf beginnt werden. Die hier präsentierten Daten sind für 2 dpf Embryonen, aber die Technik ist erfolgreich in Embryonen bis 5 dpf aufgebracht.
4. Anesthetize die Embryonen mit 0,02% gepuffert 3-Aminobenzoesäure (Tricaine) ca. 10 min vor Manipulationen.

3. Mechanische Vessel Verletzung von Embryonen

1. Übertragen narkotisierten Embryonen auf eine Depression gleiten auf einem Seziertisch Stereomikroskop mit einer Transferpipette.
2. Mit dem kurzen flachen Seite der Spritzennadel, um den Embryo mit der dominanten Hand zu manipulieren, positionieren Sie den Embryo auf die Seite mit der Bauchseite abgewandten Nadel.
3. Positionieren Sie die Minutien Stift mit der Spitze zeigte direkt auf der Bauchseite des Fisches hinter dem urogenitalen Öffnung. Positionieren Sie den Pin Minutien in einem leichten Winkel, so dass die gebogene Spitze ist in der Lage, durch die Periderm direkt in die Schwanzvene (Abbildung 1 / Strong>).
4. Mit der Spritzennadel, um den Embryo zu manipulieren, durchbohren die Schwanzvene mit der Minutien Stift durch Antippen des Embryos in den Stift, um etwas haken Sie den Stift in die Vene.
5. Mit der Spritzennadel, ziehen Sie den Embryo von der Minutien Stift einen kleinen Riss im Behälter zu schaffen.
   ANMERKUNG: Eine erfolgreiche Verletzung führt zur sofortigen Blutungen aus der Vene führen.

4. Analyse der Blutstillung

1. Wählen Sie nur Embryonen mit sichtbar zirkulierenden Blutzellen für dieses Verfahren.
2. Bereiten Sie den Timer, sobald die Minutien Stift aus dem Behälter gezogen beginnen.
3. Den Timer zu starten, sobald der Blutverlust aus der Wunde sichtbar gemacht werden. Wenn Blutverlust aus der Wunde nicht mehr, stoppen Sie die Zeit und notieren Gesamtzeit als Blutungszeit. Wenn die Koagulation inhibiert wird, nimmt die Zeit auf, um, wenn es nicht mehr sichtbar zirkulierenden Blutzellen.

5. Analyse der Wundheilung

1. Über post-Verletzungen Tiere auf dem Glasboden Bildgebung Gerichte für die Mikroskopie.
2. Entfernen Sie die Mehrheit der Eier Wasser.
3. Decken Sie die Embryonen in 0,3 bis 1,2% niedrig schmelzender Agarose in Ei Wasser gelöst, um zwischen 42 und 45 ° C erwärmt und mit 0,02% Tricaine ergänzt.
4. Position Embryonen auf ihren Seiten mit einer Pinzette.
5. Nachdem die Agarose kühlt, füllen Sie die Schale mit 0,02% Tricaine in Ei Wasser.
6. Erwerben Sie Bilder mit Hellfeld, Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie.
7. Entfernen Embryo aus der Agarose mit einer Pinzette und Transfer zurück zum Ei Wasser.

Ergebnisse

Mechanische Gefäßverletzung wurde am 2. dpf Embryonen (- C 2A) durchgeführt. Schädigung führt zu einer schnellen und zuverlässigen Koagulation Reaktion wie durch die Zeit zur Beendigung der Blutung (2D) gemessen. Um zu bestimmen, ob oder ob nicht Unterschiede in der Gerinnungsreaktion gemessen werden konnte, das Antikoagulans Hirudin wurde den Embryonen durch Injektion in die Kanal Cuviers unmittelbar vor der Verletzung (5-10 nl von 1 Einheit pro ul Hirudin gelöst in Wasser) vera...

Diskussion

Zebrafische wurden erfolgreich als ein Modell für die verschiedenen Arten von Wunden einschließlich Laserbeschädigung ^13-15, Laser-induzierte Thrombose ¹⁶ und epithelialen Verwundung ¹⁰ verwendet. Wir berichten über ein Verfahren zur mechanischen Verwundung, die einfach auszuführen ist und erzeugt einen kontrollierten Verletzungen in einem in vivo-Modell, das sehr gut für Echtzeit-Mikroskopie ist. Schädigung führt zu einem schnellen und messbaren hämostatische ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Minutia Pins	Fine Science Tools	26002-10	Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm
Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Dumont #5 Fine Tip Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Glass Depression Slide	Aquatic Eco-Systems	M30
Low Melting Agarose	Lonza	50081	Preheated to 42 º C
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629
3-aminobenzoic acid (Tricaine)	Sigma Aldrich	E10521
Hirudin	Sigma Aldrich	H7016
Glass bottom imaging dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C
Dissecting microscope	Olympus	SZH10
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Observer
Aquarium salts	Instant Ocean
Insulin syringe with 28G1/2 needle	Becton Dickinson	329461