Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

Resumen

El pez cebra es una herramienta popular para modelar la enfermedad renal crónica (ERC). Sin embargo, su pequeño tamaño hace que sea imposible para evaluar la función renal utilizando métodos tradicionales. Se describe un ensayo de aclaramiento renal tinte fluorescente ¹ que permite el análisis cuantitativo de la función renal pez cebra en la ERC.

Resumen

El embrión de pez cebra ofrece un modelo manejable para estudiar la organogénesis y modelar enfermedades genéticas humanas. A pesar de su relativa simplicidad, el riñón pez cebra se desarrolla y funciona casi de la misma forma que los humanos. Una diferencia importante en la construcción del riñón humano es la presencia de millones de nefronas en comparación con el pez cebra que tiene sólo dos. Sin embargo, la simplificación de un sistema tan complejo en unidades funcionales básicos ha ayudado a nuestra comprensión de cómo se desarrolla el riñón y opera. En el pez cebra, la línea media situada glomérulo es el responsable de la filtración de la sangre inicial en dos túbulos pronéfricos que divergen para funcionar bilateralmente por el eje embrionario antes de fundirse entre sí en la cloaca. Los túbulos pronéfricos están densamente poblados por cilios móviles que facilitan el movimiento de filtrado a lo largo del túbulo segmentada, lo que permite el intercambio de varios solutos antes de finalmente salir a través de la cloaca ^2-4. Muchos de los genes responsables de la enfermedad renal crónica, incLuding los relacionados con ciliogenesis, han sido estudiados en el pez cebra ^5. Sin embargo, un gran inconveniente ha sido la dificultad para evaluar la función renal pez cebra después de la manipulación genética. Ensayos tradicionales para medir la disfunción renal en humanos han demostrado no traslacional para el pez cebra, debido principalmente a su medio acuático y pequeño tamaño. Por ejemplo, no es físicamente posible extraer la sangre de embriones en escena de pescado para el análisis de urea y creatinina contenido, ya que son demasiado pequeñas. Además, el pez cebra no producen suficiente orina para la prueba en un simple proteinuria 'varilla', que a menudo se lleva a cabo durante los exámenes iniciales de los pacientes. Se describe un ensayo fluorescente que utiliza la transparencia óptica del pez cebra para controlar cuantitativamente la liquidación de un colorante fluorescente, con el tiempo, a partir de la vasculatura y hacia fuera a través del riñón, para dar una lectura de la función renal ^1,6-9.

Introducción

El riñón humano juega un papel crucial en el filtrado de los desechos metabólicos de la sangre y la recuperación de solutos necesarios para mantener la homeostasis celular. Hay un número de enfermedades genéticas humanas que causan disfunción renal. La enfermedad renal hereditaria más común es la enfermedad renal poliquística autosómica dominante (PQRAD) caracterizada por el desarrollo de los sacos llenos de líquido dentro de túbulos nefríticos; el daño causado por la quistogénesis es perjudicial para la función renal ^10. PQRAD tiene una ocurrencia de 1: 800 - 1: 1000 y representa el 8 - 10% de los pacientes en insuficiencia renal terminal (IRT) ^11. Varios genes han sido implicados para causar PQRAD incluyendo policistina-1 (PKD1) y -2 (PKD2), que representa aproximadamente el 85% y el 15% de los casos, respectivamente ^12,13. Además, los productos génicos para PKD1 y -2 se localizan en el cilio y son fundamentales para ciliogenesis ^14,15. Existe ahora una familia reconocida de trastornos genéticos humanos, conocidos comolos ciliopatías, que afectan a la función de los cilios y dan lugar a ERC ^16.

El creciente número de enfermedades genéticas humanas que afectan el desarrollo y la función ciliar está atrayendo el interés mundial en este orgánulo vestigial una vez considerado. El cilio, un saliente celular-cabello como, está enriquecida con los receptores y canales iónicos necesarios para la transducción de eventos de señalización celular clave. El cilio consiste en un axonema a base de microtúbulos, típicamente estructurado en nueve dobletes de microtúbulos dispuestos radialmente con o sin un par central de microtúbulos singlete. La estructura axonemal define el tipo y modo de acción ciliar. La disposición de los microtúbulos 9 + 2 confiere a la motilidad del cilio donde se utiliza en el movimiento de los fluidos a través de las superficies epiteliales. La configuración 9 + 0 es no móviles, pero se cree que es principalmente función en eventos de señalización celular ^17. Aparte de ERC, las consecuencias de la disfunción ciliar son un conjunto de característicascaracterísticas ciliopatía que incluyen, la obesidad, la degeneración de la retina, polidactilia, y el deterioro cognitivo ^16. Sin embargo, la ERC es una de las más perjudiciales para la calidad de vida del paciente y, por tanto, una importante fuerza impulsora detrás del desarrollo de su caso en modelos in vivo para ciliar relacionada con la ERC.

El pez cebra es un excelente modelo para comprender la etiología de la enfermedad genética humana. Su desarrollo rápido, la producción de un gran número de huevos, tejido transparente, y el crecimiento ex utero permite procesos de desarrollo de pez cebra a ser visualizados y eventos biológicos manipulados con facilidad considerable. Los genes pueden ser alterados genéticamente utilizando el reciente éxito de herramientas de edición genoma (CRISPR ¹⁸ y TALENS ^19), derribados usando tecnología antisentido de morfolino ^20, o farmacológicamente regulados por la adición de compuestos a su medio ambiente acuático. De hecho, el pez cebra ofrece una plataforma para llevar a cabo experimentos que no son permisivos en otros modelos animales. Mientras que el pez cebra son vertebrados relativamente simples (en comparación con los seres humanos) que comparten muchos órganos funcionalmente conservados, los genes y los procesos de señalización en común con los seres humanos. Por ejemplo, el riñón pez cebra es notablemente similar en estructura y función en comparación con los seres humanos ^21,22. Sin embargo, a diferencia del riñón de mamífero que se desarrolla a través de una sucesión de fases, cada una marcada por un riñón más desarrollada (pronefros, mesonefros y metanefros), el pez cebra embrionarias sólo se desarrolla una pronefros, la forma más inmadura de un riñón. Mientras millones de nefronas se encuentran formando los bloques de construcción del riñón de los mamíferos, el embrión de pez cebra sólo poseen dos. Los glomérulos, que permiten el filtrado de sangre inicial, se fusionan en la línea media ventral sólo a la aorta. Filtros de sangre a través de los glomérulos en los túbulos pronéfricos que se ejecutan en sentido caudal a lo largo del eje, la fusión antes de salir a través de la cloaca. El pronephric tubules están fuertemente ciliadas con cilios móviles que son permisivas para el flujo de filtrado hacia la salida caudal ^3,4. Esta estructura pronephric sencillo mantiene la homeostasis pez cebra a través de varias semanas de crecimiento de las larvas en el que el tiempo se convierten en una estructura más compleja mesonefros ^21. Sin embargo, el pez cebra nunca desarrolla un metanefros ^21. A pesar de las idiosincrasias de pez cebra, la nefrona pez cebra se segmenta con perfiles de expresión génica igual a la observada en los mamíferos y por lo tanto ofrece una incomparable modelo in vivo para la nefrogénesis ^3,22.

Rutinariamente a los pacientes se prueban para la función renal a través de una serie de pruebas de sangre y orina. Típicamente, la sangre se analiza para disuelto sales, urea y creatinina. Los altos niveles de urea, creatinina y concentraciones anormales de sal son indicativos de problemas con la función renal. Análisis de orina utilizando una tira reactiva colorimétrica detecta niveles anormales de proteína, blood, pus, bacterias y azúcar presente en muestras de orina. Estas pruebas normalmente requieren aproximadamente 30 ml de orina o de 5-10 ml de sangre. Ha sido difícil traducir estos tipos de ensayos a pequeña en organismos modelo in vivo, tales como el pez cebra, debido principalmente a la naturaleza imposible de recogida de sangre u orina suficiente para realizar el ensayo. Aquí, nos dirigimos a la falta de pruebas de función renal pez cebra apropiadas y describimos una técnica innovadora para su estudio. Mediante la inyección de un tinte fluorescente en la corriente sanguínea que son capaces de controlar y cuantificar de forma individual en el tiempo de la filtración y la excreción de la actividad fluorescente de la sangre a través del riñón. Este método puede ser utilizado para estudiar el daño renal causada por la enfermedad, que proporcionan un ejemplo de.

Protocolo

Declaración de Ética: Animal de mantenimiento, la cría y los procedimientos están definidos y controlados por la Ley de 1986. Todos los experimentos con animales se ha llevado a cabo bajo licencias otorgadas por el Ministro del Interior (PIL Nº 70/7892) en cumplimiento con Biológica Animales (Procedimientos Científicos) Grupo de Servicios de Gestión y el Comité de Ética de Servicios Biológica, SGUL, Londres, Reino Unido. Se hicieron todos los esfuerzos para reducir el número de animales utilizados y para perfeccionar los procedimientos y la cría con el fin de minimizar el sufrimiento y mejorar el bienestar.

1. Elaboración de Instrumentos, Anestésico, y colorante fluorescente

1. El uso de un extractor de micropipeta y los capilares de borosilicato de pared estándar (sin filamentos) Tire agujas de longitud adecuada para la microinyección (Figura 1A).
2. Hacer un molde de agarosa para la orientación de los embriones para inyección fácil en el pericardio (Figura 1B). Pegamento aproximadamente diez vidrio microscopio slides juntos para formar una 'escalera' de diapositivas offset. Para obtener los mejores resultados, utilice una gota de pegamento rápido resina epoxi conjunto en el centro de cada diapositiva.
3. Corte un tramo de aproximadamente 78 mm de longitud a medio camino a través de dos pipetas de plástico de 10 ml utilizando un bisturí Mechero Bunsen climatizada, retire la pipeta termina en su caso. Adjuntar y secciones pegamento (resina epoxi) de pipeta a las diapositivas de cristal apilados para proporcionar estabilidad para permitir que el molde para que moje en una placa de Petri de 90 mm. Haga todo lo posible para asegurar las esquinas de diapositivas alinean perpendicular al suelo placa de Petri. Dé tiempo pegamento se seque.
4. Reparto de molde en una solución de agarosa al 2% en agua hecha de pescado (obtenido de la acuario). Verter de agarosa en una placa de Petri de 90 mm y colocar el molde en la parte superior de la placa de Petri abierta, permitiendo la diapositiva apilados bordes para sumergirse en un ángulo bajo la superficie de agarosa. Deja para establecer en el banco de laboratorio durante 30 minutos.
5. Retire el molde deslizante y cubra la agarosa deslizable impresa con peces de agua dulceque contiene tricaína anestésico (ver paso 1,9) a una proporción de 1:25.
6. Haga soluciones de dextrano rodamina (RD) tinte. Resuspender rodamina B 10.000 MW dextrano marcado en agua ultrapura esterilizada en autoclave para hacer una concentración de solución madre de 50 mg / ml. Para la microinyección, diluir aún más la acción a una concentración final de 5 mg / ml en agua ultrapura tratada en autoclave.
   NOTA: pigmentada células comienzan a diferenciarse en el pez cebra de 24 h después de la fecundación (HPF); estos pueden oscurecer marcadores fluorescentes durante la adquisición de imagen.
7. Inhibir la formación de melanocitos mediante el uso de N -Phenylthiourea (PTU), que bloquea la melanogénesis través de la inhibición de la tirosinasa. Hacer una solución madre de 0,003% de PTU disolviendo polvo de PTU en el agua del acuario, la solución se calienta a 60 ° C para solubilizar completamente.
8. Incubar embriones de pez cebra en solución de azul de metileno, un fungicida suave, para evitar las floraciones de hongos y aumentar la supervivencia. Añadir 2 ml de solución de azul de metileno, que contiene 0,1% de azul de metileno en uagua ltrapure, a 1 l de agua del acuario y su uso como medio de embrión estándar.
9. Invente una concentración stock de 15 mM de sal metanosulfonato / acetato de 3-aminobenzoato tricaína como se indica en 'El libro de pez cebra' ^23. Anestesiar a los embriones y por consiguiente ellos inmovilizada para realizar el procedimiento de microinyección.
10. Después de anestesiar a los embriones, orientarlo, para obtener imágenes mediante el uso de las propiedades no tóxicas y viscosas de metilcelulosa. Para hacer una preparación de 200 ml de 3% de metilcelulosa, chill 130 ml de agua a -20 ° C durante 30 min y el lugar en hielo. Calentar 70 ml de agua a 80 ° C en un vaso de precipitados de vidrio, añadir 6 g de metilcelulosa, y agitar con una varilla de vidrio hasta que todas las partículas se humedecen y uniformemente dispersos. Agregue el agua helada, mezcle y deje que la preparación se enfríe a 4 ° C durante 30 minutos antes de alícuotas en tubos de 50 ml.
    NOTA: La reducción de la temperatura permite la metilcelulosa se vuelva soluble. La solución se vuelva más gruesocomo los hidratos de polvo. 3% de metilcelulosa se puede almacenar sin crecimiento bacteriano durante cortos períodos de una semana a 4 ° C o más a -20 ° C. Asegúrese de que la metilcelulosa ha llegado a RT antes de su uso.
11. Para llevar a cabo inyecciones de tinte fluorescente en el pez cebra utilizar una microinyección configuración estándar (Figura 1C). Este consta de un compresor de aire conectado a un sistema regulador de presión que se alimenta en un soporte de pipetas recta para su uso con 1,0 capilares de diámetro exterior. El titular de la pipeta debe ser alojado dentro de un compacto micromanipulador de control 3-MM33 eje fijado a una placa base de acero por un soporte magnético. Los embriones pueden ser visualizados, manipulado y se inyectaron usando un microscopio de disección estéreo.

2. El pez cebra Cría y Tratamiento Pre-inyección

1. Mantener el pez cebra como se describió anteriormente ^23. Utilice un acuario configuración que proporciona agua de recirculación suministrado a una temperatura constante de 28,5 ° C, Condicionado a pH 6.8 a 7.2 y la conductividad de 450 a 550 mS con bicarbonato de sodio y la sal del mar Océano instantánea, respectivamente. Utilice tipo salvaje o líneas de pez cebra transgénico según sea apropiado para el experimento, el mantenimiento de una densidad de población de 15 machos y 15 hembras por 8 tanque L. Ajuste el fotociclo instalación pescado a 14 horas de luz del día entre las 09 a.m.-11 p.m..
2. Desove pez cebra comienza a principios de la fotociclo, cuando las luces se encienden en la mañana. Para asegurar huevos máximas pueden recogerse sin molestar a los peces, sumerja los tanques de cría (que contienen inserciones de malla, disponible de especialistas de pez cebra) en los tanques de almacenamiento de tipo salvaje de la noche antes de la recolección.
3. En el día de la recolección, permite 30 - 40 min para los peces para desovar, después de lo cual recoger y enjuagar los huevos usando un colador de té y agua del acuario fresco. Deposita los huevos limpios en un medio que contiene el embrión de 90 mm placa de Petri y se incuba a 28,5 ° C.
4. Tratar a los embriones con PTU para inhibir melanogénesis. A las 8 de HPF, transferir embriones viables en el líquido mínimo en placas de Petri que contienen frescos 1: 100 PTU a medio embrión y se incuba adicionalmente a 28,5 ° C hasta 72 HPF.
   NOTA: PTU puede causar defectos de desarrollo si se usa en las primeras etapas de modo debe limitarse a publicar 8 etapas HPF, pero puede ser tratada tan tarde como 24 HPF. Además tardía de PTU no bloquea completamente la pigmentación del ojo, pero generalmente es exitoso y la inhibición de la formación de los melanocitos tronco.

3. La microinyección

NOTA: El pericardio encierra al corazón, pero se separa para la protección y facilidad de movimiento cardiaco por el fluido dentro de la cavidad pericárdica. El objetivo de este procedimiento es inyectar RD en la cavidad pericárdica, esto permite la rápida captación del colorante al sistema de vasculatura.

1. Agujas de carga con 6 l - diluyen RD, utilizando puntas Microloader y segura en el soporte de la aguja del micromanipulador. Romper el extremo de la aguja usando bien tippfórceps ed (Figura 1A). Mover la solución RD a la punta de la aguja mediante la maximización de la duración del pulso a la configuración minutos, volver a mseg una vez completa.
2. Utilice un micrómetro de platina, el regulador de presión, y refinamientos a la longitud de punta de la aguja (utilizando pinzas) para ajustar el tamaño de la gotita expulsada a 100 micras de diámetro, esto equivale a un volumen de 0,5 nl (Figura 2A).
   NOTA: Al romper la aguja, tenga cuidado de no romper demasiado fuera de lo contrario hará que calibrar el volumen de inyección difícil. Si es necesario, romper aún más la punta de la aguja para aumentar el tamaño de la gota sin embargo, mantener un espesor de la aguja que permite la entrada en el pericardio sin flexión excesiva o daños en el tejido.
3. Antes de la inyección, anestesiar a los embriones en medio de embrión que contienen tricaína. Configure 2 x 35 mm placas de Petri que contenían 5 ml de medio de embriones, una etiqueta 'tricaína' y la otra 'recuperación'.
4. Añadir 200l de stock tricaína al plato debidamente etiquetado. Una vez listo para inyectar, seleccionar un embrión individual en 72 HPF y transferir en líquido mínimo para el plato tricaína. Supervisar la actividad del embrión, pruebe el embrión se anestesia y se inmoviliza mediante agitación suave con una punta de microloader truncado.
5. Transferir el embrión anestesiado para el molde de inyección y orientar el embrión dentro de una cubeta de agarosa de manera que el lado izquierdo está mirando hacia arriba, el posicionamiento del corazón a la izquierda del campo de vista.
6. Para inyectar la RD en el corazón, el pericardio perforar con la aguja e inyectar 1 nl de RD en la cavidad pericárdica del embrión anestesiado (Figura 2B, panel derecho). Retire la aguja después de la inyección. Transferir el embrión inyectado en el líquido mínimo para el 'plato recuperación' y vigilar durante 1 min. Transferir el embrión individual a una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml de medio de embriones frescos (que contiene PTU) y la etiqueta de manera apropiada.
   NOTA: El pericardio es difícil, sin embargo hay un punto débil notable en la intersección donde el pericardio cumple con los arcos faríngeos ventro-caudal y saco vitelino dorso-rostral (Figura 2B punta de flecha). La aguja debe dirigirse a esta ranura. Cuando la aguja está en su lugar, un grifo firma de un dedo en la parte superior de la micromanipulador facilitará la entrada en la cavidad pericárdica.
7. Repita los pasos 3.2 a 3.6 por lo menos 10 embriones por grupo experimental, coloque cada pez en un pozo independiente y única labelto permiso individuales experimentales de seguimiento. Se incuba a 28,5 ° C durante 3 horas.

4. Imaging Acquisition

1. A las 3 h después de la inyección (hpi) anestesiar a los embriones como se describió anteriormente y transferir a un plato de Petri de 35 mm que contiene 3% de metilcelulosa. Presione suavemente los embriones en la metilcelulosa y orientar para que el lado lateral se pueden obtener imágenes.
2. Adquirir una imagen del embrión bajo UV, utilizando un filtro para la visualización of emite luz a 570 nm (Figura 2C). Después de la adquisición de imágenes, permite que el embrión se recupere antes de reemplazar en el bien designado. Adquirir imágenes de todos los embriones inyectados e incubar mayor a 28,5 ° C.
   NOTA: En este protocolo se utilizó un microscopio estereoscópico fluorescente con un conjunto de filtros TXR, una cámara DFC300FX y software de aplicación respectiva. Tome nota de los ajustes de adquisición exactos para la adquisición de la imagen posterior.
3. A las 24 hpi, adquirir una segunda ronda de imágenes como se describe anteriormente. Una vez que todas las imágenes han sido adquiridas, tanto a los 3 hpi y 24 hpi, humanamente disponer de los embriones o el uso para otros medios experimentales, por ejemplo, la inmunohistoquímica.

Procesamiento 5. Imagen

1. Cuantificar la intensidad de fluorescencia de cada embrión inyectado, a las 3 hpi y 24 hpi, mediante el análisis de imágenes utilizando el software ImageJ de NIH. Para medir la intensidad de fluorescencia, abrir una imagen en ImageJ y especificar una región de interés (ROI) a 100 px ² (Editar → Selección → especificar).
2. Coloque el corazón en el centro de la roi (Figura 2C), establezca medidas para incluir la escala de gris medio y el área (Analizar → medidas de ajuste), lleve a cabo la medición (Analizar → medida). Completar para cada conjunto de imágenes, a las 3 hpi y 24 hpi, por embrión y transferir valores promedio en escala de grises a una hoja de cálculo para su posterior procesamiento.
   NOTA: Seleccionamos un tamaño roi fijo de 100 px ² ya que esto abarca corazones individuales entre embriones. El corazón fue seleccionado para realizar mediciones debido a su gran tamaño que permite una ubicación conveniente para medir el contenido fluorescente de la sangre antes de entrar en el riñón.
3. Realizar análisis estadístico utilizando el software estadístico apropiado. Comparar grupos de significación estadística utilizando la prueba t de estudiante.

Resultados

Síndrome de Bardet-Biedl (BBS) es una rara ciliopatía heterogénea que afecta aproximadamente a 1: 160.000 personas en todo el mundo ^16. Los pacientes presentan una serie de problemas asociados incluyendo riñones poliquísticos, posteriormente los pacientes con frecuencia requieren diálisis o trasplante ^24. ESRF es la causa más común de muerte en BBS, con alrededor del 30% de los pacientes que desarrollan ERC ^16. En la actualidad, 20 genes no relacionados han sido implicados en BBS...

Discusión

El pez cebra ofrece una valiosa herramienta para modelar la enfermedad genética humana, su utilización como instrumento científico para la investigación in vivo han permitido estudios detallados de la descomposición genética de muchos sistemas biológicos, incluido el riñón. Mucho ahora se entiende acerca de cómo se desarrolla y funciona el riñón pez cebra. Las similitudes con nefrogénesis humana y la homología con los genes causantes de enfermedades ²¹ ha ilustrado cómo el pez...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller	Intracel	P-97
borosilicate standard wall capillaries	Harvard Apparatus	30-0017
Glass microscope slides	VWR International	631-0109
Epoxy Resin Glue	Evo-Stik
Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran	Life technologies	D-1824
N-Phenylthiourea	Sigma-Aldrich	P7629
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich	A5040
methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
air compressor	Jun-Air	OF302-15
Picospritzer III	Parker Instruments	051-0500-900
compact 3-axis control micromanipulator	Marzhauser	MM33
Dissecting stereo microscope	Nikon	SMZ1000
microloader tips	Eppendorf	5242956003
Dumont #5 forceps	Sigma-Aldrich	F6521
stage micrometer	Pyser- SGI	02A00404