Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente

Riepilogo

Il pesce zebra è uno strumento popolare per modellare la malattia renale cronica (CKD). Tuttavia, la loro piccola dimensione rende impossibile valutare la funzione renale con metodi tradizionali. Descriviamo un colorante fluorescente rene liquidazione test ¹ che permette l'analisi quantitativa della funzione renale zebrafish in CKD.

Abstract

L'embrione zebrafish offre un modello per lo studio trattabili organogenesi e modello di malattia genetica umana. Nonostante la sua relativa semplicità, il rene zebrafish sviluppa e funzioni quasi nello stesso modo come gli esseri umani. Una differenza importante nella costruzione del rene umano è la presenza di milioni di nefroni rispetto al zebrafish che ha solo due. Tuttavia, semplificando un sistema così complesso in unità funzionali di base ha aiutato la nostra comprensione di come si sviluppa il rene e gestisce. In zebrafish, la linea mediana trova glomerulo è responsabile per la filtrazione del sangue iniziale in due tubuli pronephric che divergono per eseguire bilateralmente lungo l'asse embrionale prima di fondersi tra loro a cloaca. I tubuli pronephric sono fortemente popolate da cilia motili che facilitano il movimento di filtrato lungo il tubulo segmentato, permettendo lo scambio di vari soluti prima infine di uscire attraverso la cloaca ^2-4. Molti geni responsabili di CKD, incLuding quelli relativi alla ciliogenesis, sono stati studiati in zebrafish ^5. Tuttavia, un grande inconveniente è stata la difficoltà di valutare la funzione renale zebrafish dopo manipolazione genetica. Saggi tradizionali per misurare disfunzioni renali nell'uomo hanno dimostrato non traslazionale per zebrafish, dovuto principalmente al loro ambiente acquatico e le dimensioni ridotte. Ad esempio, non è materialmente possibile estrarre sangue da embrionale scena pesci per l'analisi del contenuto di urea e creatinina, in quanto sono troppo piccole. Inoltre, zebrafish non produce abbastanza urine per il test su un semplice proteinuria 'astina', che viene spesso eseguita durante gli esami iniziali paziente. Descriviamo un test di fluorescenza che utilizza la trasparenza ottica della zebrafish per monitorare quantitativamente il passaggio di un colorante fluorescente, nel tempo, dal sistema vascolare e fuori attraverso il rene, per dare una lettura fuori della funzione renale ^1,6-9.

Introduzione

Il rene umano gioca un ruolo cruciale nel filtraggio rifiuti metabolici dal sangue e il recupero soluti necessarie per sostenere l'omeostasi cellulare. Ci sono un certo numero di malattie genetiche umane che causano disfunzioni renali. La malattia renale ereditaria più comune è autosomica dominante malattia del rene policistico (ADPKD) caratterizzato dallo sviluppo di fluidi riempita sacs all'interno tubuli pochechnykh; i danni provocati da cystogenesis è dannoso per la funzione renale ^10. ADPKD ha una occorrenza di 1: 800 - 1: 1.000 e rappresenta il 8-10% dei pazienti con insufficienza renale allo stadio terminale (ESRF) ^11. Diversi geni sono stati implicati a causare ADPKD compreso policistina-1 (PKD1) e -2 (PKD2), che rappresentano circa l'85% e, rispettivamente, ^12,13 15% dei casi. Inoltre, i prodotti genici per PKD1 e -2 localizzano al ciglio e sono fondamentali per ciliogenesis ^14,15. Vi è ora una famiglia riconosciuta di malattie genetiche umane, dettile ciliopatie, che influenzano la funzione delle ciglia e si traducono in CKD ^16.

Il crescente numero di malattie genetiche umane che influenzano lo sviluppo e la funzione ciliare sta disegnando interesse globale in questo organello vestigial tempo considerato. Il cilium, una sporgenza cellulare a ciglia, è arricchito con recettori e canali necessari per la trasduzione di eventi di segnalazione cellulare chiave ioni. Il cilium consiste di un axoneme basata microtubuli, tipicamente strutturato in nove doppietti microtubuli disposte radialmente con o senza una coppia centrale di microtubuli singoletto. La struttura axonemal definisce il tipo e la modalità di azione ciliare. La disposizione 9 + 2 microtubuli conferisce alla motilità cilium dove viene utilizzato nel movimento dei fluidi attraverso superfici epiteliali. La configurazione 9 + 0 non è mobili, ma si crede che soprattutto in funzione di eventi di segnalazione cellulare ^17. Oltre CKD, le conseguenze della disfunzione ciliare sono un insieme di caratteristichecaratteristiche ciliopathy che comprendono, l'obesità, la degenerazione della retina, polidattilia, e deterioramento cognitivo ^16. Tuttavia, CKD è tra i più dannosi per la qualità della vita del paziente e quindi una forza trainante dietro lo sviluppo di adeguati modelli in vivo per ciliare correlati CKD.

Il pesce zebra è un ottimo modello per comprendere l'eziologia della malattia genetica umana. Il loro rapido sviluppo, la produzione di un gran numero di uova, il tessuto trasparente, e la crescita ex utero permette processi di sviluppo di zebrafish per essere visualizzati e gli eventi biologici manipolati con notevole facilità. I geni possono essere geneticamente modificati con il recente successo di strumenti di editing genoma (CRISPR ¹⁸ e Talens ^19), abbattuto con antisenso tecnologia morfolino ^20, o farmacologicamente regolati con l'aggiunta di composti al loro ambiente acquatico. Infatti, zebrafish offrire una piattaforma di intraprendere experiments che non sono permissive in altri modelli animali. Mentre zebrafish sono vertebrati relativamente semplici (rispetto per gli esseri umani) hanno in comune molti organi funzionalmente conservati, geni e processi di segnalazione in comune con gli esseri umani. Ad esempio, il rene zebrafish è notevolmente simile in struttura e funzione rispetto agli esseri umani ^21,22. Tuttavia, a differenza del rene mammiferi che si sviluppa attraverso una serie di fasi, ciascuna contrassegnata da un rene più sviluppata (Pronefro, mesonefro e metanefro), il pesce zebra embrionale si sviluppa solo pronephros, la forma più immatura di un rene. Mentre milioni di nefroni si trovano formare i mattoni del rene mammiferi, l'embrione zebrafish solo possiede due. Il glomeruli, che consentono il filtrato del sangue iniziale, si fondono sulla linea mediana appena ventrale all'aorta. I filtri di sangue attraverso il glomeruli nei tubuli pronephric che corrono caudalmente lungo l'asse, fusione prima di uscire attraverso la cloaca. Il pronephric tubules sono fortemente ciliato con cilia motilità che sono permissive al flusso del filtrato verso l'uscita caudale ^3,4. Questa struttura semplice pronephric mantiene l'omeostasi zebrafish attraverso diverse settimane di crescita delle larve dove alla fine si sviluppano in una più complessa struttura mesonefro ^21. Tuttavia, il pesce zebra non sviluppa una metanefro ^21. Nonostante le idiosincrasie zebrafish, nefrone zebrafish è segmentato con profili di espressione genica pari a quello osservato nei mammiferi e offre così un impareggiabile nel modello in vivo per nefrogenesi ^3,22.

Ordinariamente i pazienti sono testati per la funzione renale, attraverso una serie di esami del sangue e delle vie urinarie. Tipicamente il sangue viene analizzato per disciolto sali, urea e creatinina. Alti livelli di urea, creatinina e concentrazioni saline anomale sono indicativi di problemi con la funzione renale. L'analisi delle urine utilizzando un asta colorimetrico rileva i livelli anormali di proteine, Blood, pus, batteri e zucchero in campioni di urina presente. Tali prove normalmente richiedono circa 30 ml di urina o di 5-10 ml di sangue. È stato difficile tradurre questi tipi di saggi di piccole organismi modello in vivo, come il pesce zebra, dovuta principalmente alla natura impossibile della raccolta di sangue o di urina sufficiente per eseguire il test. Qui, ci rivolgiamo la mancanza di adeguati test di funzionalità renale zebrafish e descriviamo una tecnica innovativa per il suo studio. Iniettando un colorante fluorescente nel flusso sanguigno siamo in grado di monitorare e quantificare singolarmente nel tempo la filtrazione e l'escrezione di attività fluorescente dal sangue attraverso i reni. Questo metodo può essere usato per studiare il danno renale causato da malattia, cui forniamo un esempio di.

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Protocollo

Etica Dichiarazione: animali di manutenzione, allevamento, e le procedure sono definiti e controllati dagli Animali (procedure scientifiche) Act 1986. Tutti sperimentazione animale è stata effettuata sotto licenze concesse dallo Home Secretary (PIL No. 70/7892) in conformità con Biologica Servizi Management Group e il Comitato Etico Servizi biologica, SGUL, Londra, UK. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre il numero di animali utilizzati e di affinare sia le procedure e allevamento, al fine di ridurre al minimo le sofferenze e migliorare il benessere.

1. Preparazione degli strumenti, anestetici, e fluorescente Dye

1. Utilizzando un estrattore micropipetta e capillari standard di borosilicato parete (senza fili) tirare aghi di lunghezza appropriata per microiniezione (Figura 1A).
2. Fare uno stampo agarosio per l'orientamento di embrioni per l'iniezione facile nel pericardio (Figura 1B). Colla circa dieci vetro microscopio slidi insieme per formare una 'scala' di diapositive offset. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare una goccia di rapida messa resina epossidica colla nel centro di ciascuna diapositiva.
3. Tagliare una sezione di circa 78 mm di lunghezza a metà due pipette 10 ml in plastica con un becco Bunsen bisturi riscaldata, rimuovere pipetta finisce a seconda dei casi. Attaccare e sezioni colla (resina epossidica) pipette ai vetrini impilati per fornire stabilità per consentire lo stampo di immergere in una capsula di Petri 90 mm. Fare ogni sforzo per garantire angoli di scorrimento allineano perpendicolare al pavimento piatto Petri. Lasciare il tempo colla per impostare.
4. Cast lo stampo in una soluzione di agarosio 2% made in acqua pesci (ottenuto dall'acquario). Versare agarosio in un piatto 90 millimetri Petri e posizionare lo stampo sulla parte superiore del piatto Petri aperta, permettendo la diapositiva impilati bordi per immergere un angolo sotto la superficie agarosio. Lasciare impostata sul banco di laboratorio per 30 min.
5. Rimuovere il cast vetrino e coprire il agarosio slide-impresso con acqua il pesce frescocontenente Tricaine anestetico (vedi punto 1.9) con un rapporto di 01:25.
6. Fare soluzioni di rodamina destrano (RD) dye. Risospendere rodamina B 10.000 MW etichettato destrano in acqua ultrapura autoclavato a fare una scorta di concentrazione di 50 mg / ml. Per microiniezione, diluire ulteriormente il titolo ad una concentrazione finale di 5 mg / ml in acqua ultrapura autoclave.
   NOTA: Pigmento cellule iniziano a differenziarsi in zebrafish da 24 ore dopo la fecondazione (HPF); questi possono oscurare marcatori fluorescenti durante l'acquisizione dell'immagine.
7. Inibire la formazione melanocita utilizzando N -Phenylthiourea (PTU), che blocca la melanogenesi attraverso l'inibizione della tirosinasi. Fare una soluzione madre 0,003% di PTU sciogliendo polvere PTU in acquario, soluzione di calore a 60 ° C per solubilizzare completamente.
8. Incubare embrioni di zebrafish in soluzione di blu di metilene, un fungicida lieve, per evitare fioriture fungine e aumentare la sopravvivenza. Aggiungere 2 ml di blu di metilene soluzione madre, contenente 0,1% blu di metilene in uacqua ltrapure, a 1 l di acqua e l'uso come mezzo embrione standard.
9. Portare a 15 mM concentrazione magazzino di Tricaine sale methanesulfonate / etil-3 amminobenzoato come indicato in 'The Zebrafish libro' ^23. Anestetizzare gli embrioni e di conseguenza li immobilizzato per eseguire la procedura di microiniezione.
10. Dopo anestetizzante gli embrioni, orientarli, per l'imaging utilizzando le proprietà non-tossici e viscosi di metilcellulosa. Per fare un 200 ml preparazione di 3% metilcellulosa, chill 130 ml di acqua a -20 ° C per 30 min e posto su ghiaccio. Riscaldare 70 ml di acqua a 80 ° C in un bicchiere di vetro, aggiungere 6 g di metilcellulosa, ed agitare con una bacchetta di vetro fino a che tutte le particelle sono bagnate ed uniformemente dispersi. Aggiungere l'acqua ghiacciata, mescolare, e consentire la preparazione raffreddare a 4 ° C per 30 minuti prima di aliquotando in 50 ml provette.
    NOTA: L'abbassamento della temperatura permette la metilcellulosa di diventare solubile. La soluzione diventerà più spessacome gli idrati polvere. 3% di metilcellulosa può essere conservato senza crescita batterica per brevi periodi di una settimana a 4 ° C o più a -20 ° C. Assicurarsi che la metilcellulosa ha raggiunto RT prima dell'uso.
11. Per eseguire iniezioni di colorante fluorescente nel zebrafish utilizzare un microiniezione set-up standard (Figura 1C). Questo consiste in un compressore d'aria collegato ad un sistema regolatore di pressione che alimenta un supporto pipetta diritta per l'uso con 1.0 capillari diametro esterno. Il titolare pipetta deve essere ricavato da un compatto micromanipolatore di controllo a 3 assi MM33 fissato ad una piastra di base in acciaio da un supporto magnetico. Gli embrioni possono essere visualizzati, manipolato e iniettato utilizzando un microscopio da dissezione stereo.

2. Zebrafish Husbandry e trattamento pre-iniezione

1. Mantenere zebrafish come descritto in precedenza ^23. Utilizzare un acquario set-up che fornisce l'acqua di ricircolo fornita ad una temperatura costante di 28,5 ° C, Condizionati a pH 6,8-7,2 e conducibilità 450-550 mS con bicarbonato di sodio e Instant Ocean Sea Salt, rispettivamente. Utilizzare tipo selvatico o linee di zebrafish transgenici come appropriato per l'esperimento, il mantenimento di una densità di 15 maschi 15 femmine per 8 L serbatoio. Impostare il fotociclo impianto pesce a 14 ore di luce del giorno tra le 09:00-23:00.
2. Deposizione Zebrafish comincia all'inizio della fotociclo, quando le luci accendono al mattino. Per garantire il massimo delle uova possono essere raccolti senza disturbare il pesce, immergere (inserti in rete contenenti, disponibili da specialisti zebrafish) vasche di allevamento in magazzino serbatoi di tipo selvatico la sera prima della raccolta.
3. Il giorno della raccolta, permette 30 - 40 minuti per i pesci a deporre le uova, dopo di che raccogliere e lavare le uova con un colino da tè e acqua dell'acquario fresca. Depositare le uova pulite in un terreno contenente embrione 90 millimetri piastra di Petri e incubare a 28,5 ° C.
4. Trattare gli embrioni con PTU inibisce melanogenesi. Alle 8 HPF, trasferire embrioni vitali in liquido minimo per piatti freschi Petri contenenti 1: 100 PTU medio embrione e l'ulteriore incubare a 28,5 ° C fino 72 HPF.
   NOTA: PTU può causare difetti di sviluppo, se utilizzato nelle fasi precedenti così dovrebbe essere limitato a postare 8 tappe HPF, ma può essere trattata più tardi 24 HPF. Tardo aggiunta di PTU non blocca completamente la pigmentazione degli occhi, ma è generalmente efficace e inibendo la formazione del tronco melanociti.

3. Microiniezione

NOTA: Il pericardio avvolge il cuore, ma è separato per la protezione e la facilità di movimento cardiaco fluido nella cavità pericardico. Lo scopo di questa procedura è di iniettare RD nella cavità pericardio, questo permette un rapido assorbimento del colorante al sistema vascolare.

1. Aghi di carico con 6 ml - diluito RD, con punte microloader e sicuro nel supporto ago della micromanipolatore. Rompere la fine dell'ago utilizzando tipp benepinza Ed (Figura 1A). Spostare la soluzione RD alla punta dell'ago massimizzando durata dell'impulso per l'impostazione dei minuti, tornare alla msec una volta completato.
2. Utilizzare un micrometro, il regolatore di pressione, ed i parametri di lunghezza della punta dell'ago (usando pinze) per regolare la dimensione della gocciolina espulsa a 100 micron di diametro, ciò equivale a un volume di 0,5 nl (Figura 2A).
   NOTA: Quando si spezza l'ago, fare attenzione a non rompere troppo fuori altrimenti farà calibrare il volume di iniezione difficile. Se necessario, rompere ulteriormente la punta dell'ago per aumentare la dimensione della goccia tuttavia mantenere uno spessore ago che permette l'ingresso nel pericardio senza eccessiva flessione o danni al tessuto.
3. Prima dell'iniezione anestetizzare gli embrioni in media embrione contenente Tricaine. Impostare 2 x 35 millimetri piastre Petri contenenti 5 ml di mezzo embrione, un'etichetta di 'Tricaine' e l'altro 'Recovery'.
4. Aggiungere 200ml di magazzino Tricaine al piatto adeguatamente etichettati. Una volta pronto per iniettare, selezionare un singolo embrione a 72 HPF e trasferire in un liquido minimo al piatto Tricaine. Monitorare l'attività dell'embrione, testare l'embrione è anestetizzato e immobilizzato da agitazione con una punta microloader troncato.
5. Trasferire l'embrione anestetizzato allo stampo di iniezione e orientare l'embrione in un trogolo agarosio modo che il lato sinistro è rivolto verso l'alto, posizionando il cuore a sinistra del campo di vista.
6. Per iniettare il RD nel cuore, perforare il pericardio con l'ago e iniettare 1 nl del RD nella cavità pericardico dell'embrione anestetizzato (Figura 2B, pannello di destra). Estrarre l'ago dopo l'iniezione. Trasferire l'embrione iniettato nel liquido minimo per il 'piatto Recovery' e monitor per 1 min. Trasferire l'embrione individuo a un 24-pozzetti contenenti 1 ml di mezzo embrione fresco (contenente PTU) e l'etichetta in modo appropriato.
   NOTA: Il pericardio è dura, tuttavia c'è un notevole punto debole all'incrocio dove il pericardio incontra gli archi faringei ventro-caudale e dorso-rostrale sacco vitellino (Figura 2B freccia). L'ago deve essere diretto a questo solco. Quando l'ago è in posizione, un rubinetto di un dito ferma sulla sommità del micromanipolatore faciliterà ingresso nella cavità pericardico.
7. Ripetere i passaggi 3,2-3,6 per almeno 10 embrioni per gruppo sperimentale, mettere ogni pesce in un pozzo separato ed unicamente labelto permesso singoli esperimenti di follow-up. Incubare a 28.5 ° C per 3 ore.

4. Imaging Acquisition

1. A 3 ore dopo l'iniezione (HPI) anestetizzare gli embrioni come precedentemente descritto e versare in un piatto 35 millimetri Petri contenente 3% metilcellulosa. Spingere delicatamente embrioni in metilcellulosa e orientare così la parte laterale può essere ripreso.
2. Acquisire un'immagine dell'embrione sotto UV, utilizzando un filtro per la visualizzazione of emessa luce a 570 nm (Figura 2C). Dopo l'acquisizione delle immagini, permettono l'embrione di recuperare prima di sostituire ben designato. Acquisire le immagini per tutti gli embrioni iniettati e in seguito incubare a 28,5 ° C.
   NOTA: In questo protocollo abbiamo utilizzato uno stereomicroscopio a fluorescenza con un set di filtri TXR, una macchina fotografica DFC300FX e relativo software applicativo. Annotare le impostazioni di acquisizione esatte per la successiva acquisizione delle immagini.
3. Al 24 hpi, acquisire una seconda tornata di immagini, come descritto sopra. Una volta che tutte le immagini sono state acquisite, sia a 3 e 24 HPI HPI, umanamente disporre degli embrioni o utilizzare altri mezzi sperimentali per esempio, immunoistochimica.

Elaborazione 5. Immagine

1. Quantificare intensità fluorescenza di ogni embrione iniettato, a 3 e 24 HPI HPI, analizzando le immagini utilizzando il software ImageJ del NIH. Per misurare l'intensità fluorescente, aprire un'immagine in ImageJ e specificare una regione di interesse (ROI) a 100 px ² (Modifica → selezione → specificare).
2. Posizionare il cuore nel centro del roi (Figura 2C), impostare misure di includere media scala dei grigi e la zona (Analizza → misure set), eseguire la misurazione (Analyze → misura). Completare per ogni set di immagini, alle 3 e 24 HPI HPI, per embrioni e trasferire valori medi scala di grigi di un foglio di calcolo per ulteriori elaborazioni.
   NOTA: Abbiamo scelto una dimensione roi fisso pari a 100 px ² come questo comprende cuori individuali tra embrioni. Il cuore è stato selezionato per effettuare misurazioni a causa delle dimensioni che consente una posizione comoda per misurare il contenuto di fluorescenza del sangue prima di entrare nel rene.
3. Eseguire l'analisi statistica utilizzando appropriati software statistico. Confronta i gruppi per la significatività statistica con t-test di uno studente.

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Risultati

Sindrome di Bardet-Biedl (BBS) è una ciliopathy eterogeneo rara che colpisce circa 1: 160.000 persone in tutto il mondo ^16. I pazienti presentano una serie di problemi connessi compresi reni policistici, successivamente i pazienti spesso richiedono dialisi o il trapianto ^24. ESRF è la causa più comune di morte in BBS, con circa il 30% dei pazienti che sviluppano CKD ^16. Attualmente, 20 geni non correlati sono stati implicati in BBS senza pubblicato associazione genotipo-fenotipo. Le p...

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Discussione

Zebrafish offrire un prezioso strumento per modellare malattia genetica umana, il loro impiego come strumento scientifico per la ricerca in vivo hanno consentito studi dettagliati sulla composizione genetica di molti sistemi biologici, tra cui il rene. Ora molto è capito su come si sviluppa il rene zebrafish e funzioni. Le somiglianze sorprendenti per nefrogenesi umana e omologia con i geni che causano malattie ²¹ ha illustrato come zebrafish sono diventati fondamentali per capire come difetti di fu...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller	Intracel	P-97
borosilicate standard wall capillaries	Harvard Apparatus	30-0017
Glass microscope slides	VWR International	631-0109
Epoxy Resin Glue	Evo-Stik
Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran	Life technologies	D-1824
N-Phenylthiourea	Sigma-Aldrich	P7629
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich	A5040
methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
air compressor	Jun-Air	OF302-15
Picospritzer III	Parker Instruments	051-0500-900
compact 3-axis control micromanipulator	Marzhauser	MM33
Dissecting stereo microscope	Nikon	SMZ1000
microloader tips	Eppendorf	5242956003
Dumont #5 forceps	Sigma-Aldrich	F6521
stage micrometer	Pyser- SGI	02A00404