Avaliação da Função Renal Zebrafish Usando um teste de eliminação fluorescente

Resumo

O peixe-zebra é uma ferramenta popular para modelar doença renal crônica (DRC). No entanto, seu pequeno tamanho torna impossível avaliar a função renal através de métodos tradicionais. Nós descrevemos um teste de eliminação fluorescente rim corante ^1, que permite a análise quantitativa da função renal zebrafish em CKD.

Resumo

O embrião de peixe-zebra oferece um modelo tratável para estudar a organogênese e modelo de doença genética humana. Apesar da sua relativa simplicidade, o rim do peixe-zebra e desenvolve funções em quase da mesma maneira como os seres humanos. Uma diferença importante na construção do rim humano é a presença de milhões de nefrónios em comparação com o peixe-zebra que possui apenas dois. No entanto, simplificando um sistema tão complexo em unidades funcionais básicas ajudou nossa compreensão de como o rim desenvolve e opera. No peixe-zebra, a linha média localizada glomérulo é responsável pela filtragem do sangue inicial em duas túbulos pronephric que divergem para funcionar bilateralmente a partir do eixo embrionário antes da fusão para o outro na cloaca. Os túbulos pronephric são fortemente povoada por cílios motilidade que facilitam a circulação de filtrado ao longo do túbulo segmentada, permitindo a troca de vários solutos antes de finalmente sair através da cloaca ^2-4. Muitos genes responsáveis ​​pela DRC, including aqueles relacionados à ciliogênese, têm sido estudadas em peixes-zebra ^5. No entanto, um grande atrativo para trás tem sido a dificuldade em avaliar a função renal zebrafish após manipulação genética. Ensaios tradicionais para medir a disfunção renal em humanos provaram não translacional de peixe-zebra, principalmente devido ao seu ambiente aquático e pequeno porte. Por exemplo, não é fisicamente possível para extrair sangue de peixes embrionários encenado para análise do teor de ureia e creatinina, como eles são muito pequenos. Além disso, o peixe-zebra não produzem urina suficiente para testar em um simples proteinúria 'vareta', que muitas vezes é realizado durante os exames iniciais dos pacientes. Descreve-se um ensaio fluorescente que utiliza a transparência óptica do peixe-zebra para monitorar quantitativamente a depuração de um corante fluorescente, ao longo do tempo, a partir da vasculatura e para fora através do rim, para dar uma leitura de função renal ^1,6-9.

Introdução

O rim humano desempenha um papel crucial na filtragem de resíduos metabólicos do sangue e recuperando os solutos necessários para manter a homeostase celular. Há um número de doenças genéticas humanas que causam disfunção renal. A doença renal hereditária mais comum é a doença renal policística autossómica dominante (ADPKD) caracterizada pelo desenvolvimento de sacos cheios de fluido dentro dos túbulos nefríticos; os danos causados ​​por cistogénese é prejudicial para a função renal ^{a 10.} ADPKD tem uma ocorrência de 1: 800-1: 1000 e responsável por 8 - 10% de doentes com insuficiência renal em fase terminal (ESRF) ^11. Vários genes têm sido implicados para causar ADPKD incluindo policistina-1 (PKD1) e -2 (PKD2), representando cerca de 85% e 15% dos casos, respectivamente, ^12,13. Além disso, os produtos do gene PKD1 para localizar e -2 para o cílio e são fundamentais para ciliogênese ^14,15. Existe agora uma família reconhecida de doenças genéticas humanas, conhecidas comoos ciliopathies, que afetam a função dos cílios e resultam em CKD ^16.

O crescente número de doenças genéticas humanas que afetam o desenvolvimento e função ciliar está despertando o interesse global nesta organela vestigial uma vez considerado. O cílio, uma saliência celular cabelo semelhante, é enriquecido com os receptores e canais necessários para a transdução de eventos de sinalização celular chave de iões. O cílio consiste de um axoneme à base de microtúbulos, normalmente estruturada em nove duplas de microtúbulos dispostos radialmente com ou sem um par central de microtúbulos singletos. A estrutura axonemais define o tipo e modo de acção ciliar. O arranjo de microtúbulos 9 + 2 confere a motilidade do cílio, onde é utilizada no movimento de fluidos através de superfícies epiteliais. A configuração 9 + 0 é não móveis, mas acredita-se principalmente a função em eventos de sinalização celular ^17. Além de CKD, as conseqüências da disfunção ciliar são um conjunto de característicasciliopathy características que incluem, obesidade, degeneração da retina, polidactilia, e disfunção cognitiva ^16. No entanto, a DRC está entre as mais prejudiciais para a qualidade de vida do paciente e, portanto, uma importante força motriz por trás do desenvolvimento adequado em modelos in vivo para ciliar relacionado CKD.

O peixe-zebra é um excelente modelo para compreender a etiologia da doença genética humana. O seu desenvolvimento rápido, a produção de um grande número de ovos, tecido transparente, e crescimento ex utero permite que os processos de desenvolvimento de peixe-zebra para ser visualizado e eventos biológicos manipulados com facilidade considerável. Genes podem ser geneticamente alterada usando o recente sucesso de ferramentas de edição do genoma (CRISPR ¹⁸ e TALENS ^19), derrubou usando antisense tecnologia morfolino ^20, ou farmacologicamente regulado pela adição de compostos ao seu ambiente aquático. De fato, peixe-zebra oferecer uma plataforma para realizar experiments que não são permissivas em outros modelos animais. Embora peixe-zebra são animais vertebrados relativamente simples (em comparação com os seres humanos) que partilham muitos órgãos funcionalmente conservadas, genes e processos de sinalização em comum com os seres humanos. Por exemplo, o rim do peixe-zebra é notavelmente semelhante em estrutura e função de comparação para os seres humanos ^21,22. No entanto, ao contrário do rim de mamíferos que se desenvolve através de uma sucessão de fases, cada uma marcada por um rim mais desenvolvida (pronephros, mesonephros e metanephros), o peixe-zebra embrionário desenvolve apenas um pronephros, a forma mais imatura de um rim. Enquanto milhões de nefrónios podem ser encontrados formando os blocos de construção de rim de mamífero, o embrião do peixe-zebra possuem apenas dois. Os glomérulos, que permitem o filtrado do sangue inicial, são fundidos na linha média ventral apenas para a aorta. Filtros de sangue através dos glomérulos nos túbulos pronephric que correm caudalmente ao longo do eixo, fundindo antes de sair através da cloaca. O pronephric tutúbulos são fortemente ciliada com cílios motilidade que são permissivas para o fluxo de filtrado para o caudal de saída ^{de 3,4.} Esta estrutura pronephric simples mantém a homeostase do peixe-zebra através de várias semanas de crescimento larval onde eventualmente evoluir para uma estrutura mais complexa mesonephros ^21. No entanto, o peixe-zebra nunca desenvolve um metanephros ^21. Apesar das idiossincrasias de peixe-zebra, o néfron peixe-zebra é segmentado, com perfis de expressão gênica iguais aos observados em mamíferos e, portanto, oferece uma inigualável no modelo vivo para nefrogênese ^3,22.

Rotineiramente, os pacientes são testados quanto à função renal através de uma série de análises de sangue e urina. Tipicamente, o sangue é analisado por sais dissolvidos, ureia e creatinina. Altos níveis de ureia, creatinina e concentrações anormais de sal são indicativas de problemas com a função renal. O exame de urina usando uma vareta colorimétrico detecta níveis anormais de proteínas, Blood, pus, bactérias e açúcar presente em amostras de urina. Tais ensaios requerem normalmente cerca de 30 ml de urina ou de 5 - 10 ml de sangue. Tem sido difícil de traduzir estes tipos de ensaios para pequeno em organismos modelo in vivo, tais como o peixe-zebra, principalmente devido à natureza impossível de recolha de sangue ou de urina suficiente para realizar o ensaio. Aqui, vamos abordar a falta de testes de função do rim zebrafish adequadas e descrever uma técnica inovadora para o seu estudo. Ao injectar um corante fluorescente para a corrente sanguínea que são capazes de monitorizar e quantificar individualmente ao longo do tempo a filtração e a excreção de actividade fluorescente a partir do sangue pelo rim. Este método pode ser usado para estudar os danos causados ​​por doença renal, que fornecem um exemplo de.

Protocolo

Declaração de Ética: Animal de manutenção, criação e procedimentos são definidos e controlados pelos Animais (Scientific Procedures) Act de 1986. Todos os experimentos com animais foi efectuada ao abrigo de licenças concedidas pelo Ministro da Administração Interna (PIL No. 70/7892), em conformidade com Biológica Serviços de Gestão do Grupo e da Comissão de Ética do Serviço Biológica, SGUL, Londres, Reino Unido. Foram feitos todos os esforços para reduzir o número de animais utilizados para refinar e ambos os procedimentos e pecuária, a fim de minimizar o sofrimento e melhorar o bem-estar.

1. Preparação de Instrumentos, anestésico, e corante fluorescente

1. Usando um extractor de micropipeta e capilares padrão de borosilicato de parede (sem filamentos) puxam agulhas de comprimento adequado para microinjecção (Figura 1A).
2. Fazer um molde de agarose para orientação de embriões para injecção fácil no pericárdio (Figura 1B). Glue aproximadamente dez vidro microscópio slides juntos para formar uma "escada" de lâminas de compensado. Para melhores resultados, usar uma gota de cola de resina epoxi rápida conjunto no centro de cada lâmina.
3. Cortar uma seção de aproximadamente 78 mm de comprimento no meio duas pipetas de 10 ml de plástico com um bico de Bunsen bisturi aquecido, remova pipeta termina conforme o caso. Encaixe e secções de cola (resina epóxi) de pipeta para as lâminas de vidro empilhadas para proporcionar estabilidade para permitir que o molde de mergulhar em uma placa de Petri de 90 mm. Faça todos os esforços para garantir os cantos de slides alinhar perpendicular ao chão placa de Petri. Dê tempo cola para definir.
4. Lançar o molde em uma solução de agarose 2% feita em peixes de água (obtido a partir do aquário). Pour agarose em uma placa de Petri de 90 milímetros e colocar o molde por cima do prato de Petri abertas, permitindo que a lâmina de orlas empilhadas para submergir num ângulo abaixo da superfície de agarose. Deixar para definir sobre a bancada do laboratório durante 30 minutos.
5. Retirar o elenco slide e cobrir a agarose impressa-slide com água peixe frescocontendo tricaina anestésico (veja o passo 1.9) a uma razão de 1:25.
6. Faça soluções de rhodamine dextrano corante (RD). Ressuspender rodamina B 10.000 MW marcado de dextrano em água ultrapura esterilizada para fazer uma concentração de estoque de 50 mg / ml. Para micro-injecção, dilui-se ainda mais o material a uma concentração final de 5 mg / ml em água ultrapura esterilizada.
   NOTA: Pigmentado células começam a se diferenciar no peixe-zebra a partir de 24 horas pós fecundação (hpf); estes podem obscurecer marcadores fluorescentes na aquisição da imagem.
7. Inibir a formação de melanócitos usando N -Phenylthiourea (PTU), que bloqueia a melanogênese através da inibição da tirosinase. Adicione uma solução de estoque de 0,003% do PTU dissolvendo PTU pó em água do aquário, solução de calor a 60 ° C para solubilizar por completo.
8. Incubar embriões de peixes-zebra em solução de azul de metileno, um fungicida leve, para evitar blooms fúngicas e aumentar a sobrevida. Adicionar 2 ml de solução de estoque de azul de metileno, contendo 0,1% de azul de metileno em uágua ltrapure, para 1 L de água do aquário e utilização como meio de embrião padrão.
9. Certifique-se uma concentração de estoque 15 mM de tricaina sal metano / acetato de 3-aminobenzoate conforme as instruções em 'O Livro Zebrafish ^»23. Anestesiar os embriões e, consequentemente, eles imobilizadas para executar o procedimento de microinjecção.
10. Depois de anestesiar os embriões, orientá-los, para geração de imagens usando as propriedades não-tóxicos e viscosos de metilcelulose. Para fazer uma preparação de 3% de metilcelulose 200 ml, chill 130 ml de água à temperatura de -20 ° C durante 30 minutos e colocar em gelo. Aquecer 70 ml de água a 80 ° C numa proveta de vidro, adiciona-se 6 g de metilcelulose, e agita-se usando uma vareta de vidro, até que todas as partículas são molhadas e uniformemente dispersas. Adicionar a água com gelo, mistura, e permitir que a preparação para arrefecer a 4 ° C durante 30 min antes de alíquotas em tubos de 50 ml.
    NOTA: A redução da temperatura permite a metilcelulose para se tornar solúvel. A solução torna-se mais espessacomo os hidratos de pó. Metilcelulose a 3% pode ser armazenado sem o crescimento bacteriano por curtos períodos de uma semana a 4 ° C ou mais, à temperatura de -20 ° C. Certifique-se a metilcelulose atingiu RT antes do uso.
11. Para realizar injecções de corante fluorescente para o peixe-zebra usar microinjecção um set-up padrão (Figura 1C). Este é constituído por um compressor de ar ligado a um sistema regulador de pressão que alimenta um suporte pipeta linear para utilização com 1,0 de diâmetro exterior capilares. O titular da pipeta devem ser alojados dentro de um compacto micromanipulator controle de 3 eixos MM33 preso a uma placa de base de aço por um suporte magnético. Os embriões podem ser visualizados, manipulados e injectados utilizando um microscópio de dissecação estéreo.

2. Zebrafish Pecuária e Tratamento Pré-injeção

1. Manter peixe-zebra, como previamente descrito ^23. Use um aquário set-up que fornece água de recirculação fornecido a uma temperatura constante de 28,5 ° CCondicionadas ao pH 6,8-7,2 e condutividade de 450-550 uS com bicarbonato de sódio e Instant Oceano Mar Salgado, respectivamente. Use wildtype ou linhas de peixes-zebra transgénicos, conforme apropriado para o experimento, mantendo uma densidade de 15 machos e 15 fêmeas por 8 L tanque. Defina o photocycle facilidade de peixe para 14 horas de luz do dia entre 09:00-23:00.
2. Desova do peixe-zebra começa no início do photocycle, quando as luzes se acendem na parte da manhã. Para garantir o máximo de ovos podem ser recolhidos, sem perturbar o peixe, submergir tanques de criação (que contêm inserções de malha, disponíveis a partir de especialistas de peixe-zebra) em tanques de estoque de tipo selvagem a noite antes da coleta.
3. No dia da coleta, permitir que 30 - 40 min para os peixes para a desova, após o que coletar e enxaguar ovos usando um coador de chá e água do aquário fresco. Depositar os ovos limpos em um meio contendo embrião 90 milímetros placa de Petri e incubar a 28,5 ° C.
4. Trate os embriões com PTU para inibir melanogênese. Às 8 hpf, transferir embriões viáveis ​​em líquido mínimo para placas de Petri fresco com 1: 100 PTU e médio embrião e mais incubar a 28,5 ° C até 72 hpf.
   NOTA: PTU pode causar defeitos de desenvolvimento, se usado em fases anteriores por isso deve ser limitado ao postar 8 etapas HPF, mas pode ser tratada tão tarde quanto 24 hpf. Além Late of PTU não bloqueia totalmente a pigmentação do olho, mas é geralmente bem sucedido e inibir a formação de tronco dos melanócitos.

3. Microinjection

NOTA: O pericárdio envolve o coração, mas é separado para a proteção e facilidade de movimento cardíaco por fluido no interior da cavidade do pericárdio. O objectivo deste procedimento é injectar RD na cavidade pericárdica, isto permite a absorção rápida do corante para o sistema vascular.

1. Agulhas carga com 6 ul - diluída RD, usando dicas Microloader e seguro no porta-agulha da micromanipulator. Quebre a ponta da agulha usando tipp multafórceps ED (Figura 1A). Mova a solução RD à ponta da agulha, maximizando duração do pulso para a definição dos minutos, voltar para milisegundos, uma vez concluída.
2. Usar um micrómetro de plataforma, o regulador de pressão, e refinamentos de comprimento de ponta de agulha (utilizando pinças) para ajustar o tamanho da gotícula expelido a 100 um de diâmetro, isto equivale a um volume de 0,5 nl (Figura 2A).
   NOTA: Ao quebrar a agulha, tenha cuidado para não quebrar muito off caso contrário ele irá fazer a calibração do volume de injeção difícil. Se necessário, quebrar a ponta da agulha ainda mais para aumentar o tamanho de gota no entanto, manter uma espessura que permite a entrada da agulha no pericárdio sem uma curvatura excessiva ou danos no tecido.
3. Antes da injecção, anestesiar os embriões em meio contendo tricaina embrião. Configure 2 x 35 milímetros placas de Petri contendo 5 ml de meio de embrião, uma etiqueta do 'tricaina' eo outro 'Recovery'.
4. Adicionar 200ul de estoque tricaina ao prato devidamente rotulados. Uma vez pronto para injetar, selecionar um embrião humano no 72 hpf e transferir em líquido mínimo para o prato tricaina. Monitorizar a actividade do embrião, o embrião é testar anestesiados e imobilizados por agitação suave usando uma ponta microloader truncado.
5. Transferir o embrião anestesiado para o molde de injecção e orientação do embrião dentro de uma calha de agarose de modo que o lado esquerdo está virada para cima, o posicionamento do coração para a esquerda do campo de visão.
6. Para injectar a RD para o coração, o pericárdio perfurar com a agulha e injectam-se 1 nl de RD na cavidade pericárdica do embrião anestesiados (Figura 2B, painel da direita). Retire a agulha após a injeção. Transferir o embrião injectado no líquido mínimo para o "prato de recuperação 'e monitorar durante 1 min. Transferência do embrião individual a uma placa de 24 poços contendo 1 ml de meio de embrião fresco (contendo o PTU) e etiqueta apropriadamente.
   NOTA: O pericárdio é difícil, no entanto, há um ponto fraco notável no cruzamento onde o pericárdio atende aos arcos faríngeos ventro-caudal e dorso-rostral saco vitelino (Figura 2B ponta de seta). A agulha deve ser direcionado para este groove. Quando a agulha está no lugar, uma torneira firme de um dedo na parte superior do micromanipulador vai facilitar a entrada na cavidade pericárdica.
7. Repita os passos de 3,2-3,6 por pelo menos 10 embriões por grupo experimental, coloque cada peixe em um bem separado e exclusivamente labelto autorização individuais experimentais follow-ups. Incubar a 28,5 ° C durante 3 h.

4. Imaging Acquisition

1. Às 3 horas pós injeção (HPI) anestesiar embriões como descrito anteriormente e transfira para um prato de 35 milímetros Petri contendo 3% de metilcelulose. Com cuidado, empurre embriões na metilcelulose e orientar para que o lateral pode ser trabalhada.
2. Adquirir uma imagem do embrião sob UV, utilizando um filtro para o visualizaçãof a luz emitida a 570 nm (Figura 2C). Após a aquisição da imagem, permitir que o embrião para se recuperar antes de substituir no poço designado. Aquisição de imagens para todos os embriões injetados e mais incubar a 28,5 ° C.
   NOTA: Neste protocolo foi utilizado um microscópio estereoscópico fluorescente com um conjunto de filtros TXR, uma câmera DFC300FX e respectivo software aplicativo. Anote as configurações de aquisição exatas para aquisição de imagem subsequente.
3. Aos 24 hpi, adquirir uma segunda rodada de imagens como descrito acima. Uma vez que todas as imagens foram adquiridas, tanto a 3 hpi e 24 hpi, humanamente descarte dos embriões ou utilização para outros meios experimentais, por exemplo, imuno-histoquímica.

5. Processamento de Imagem

1. Quantificar intensidade de fluorescência de cada embrião injetado, em 3 hpi e 24 hpi, através da análise de imagens usando o software ImageJ do NIH. Para medir a intensidade de fluorescência, abra uma imagem em ImageJ e especificar uma região de interesse (ROI) a 100 px ² (Edit → seleção → especificar).
2. Posicione o coração no centro do roi (Figura 2C), definir as medidas a incluir escala de cinza médio e área (Analisar → medições de conjunto), efectuar a medição (Analisar → medida). Completar para cada conjunto de imagens, em 3 hpi e 24 hpi, por embrião e transferir valores médios de escala de cinza para uma folha de cálculo para posterior processamento.
   NOTA: Nós selecionamos um tamanho roi fixa de 100 px ² como esta engloba corações individuais entre embriões. O coração foi escolhido para realizar medições, devido ao seu grande tamanho que permite uma localização conveniente para medir o teor de fluorescência do sangue antes de entrar no rim.
3. Realizar a análise estatística usando o software estatístico adequado. Compare grupos para significância estatística usando o teste t de um estudante.

Resultados

A síndrome de Bardet-Biedl (BBS) é um ciliopathy heterogêneo rara que afeta cerca de 1: 160 mil pessoas em todo o mundo ^16. Os pacientes apresentam uma série de problemas associados, incluindo rins policísticos, posteriormente pacientes frequentemente necessitam de diálise ou transplante renal ^24. ESRF é a causa mais comum de morte em BBS, com cerca de 30% dos pacientes em desenvolvimento CKD ^16. Actualmente, 20 genes não relacionados têm sido implicados em BBS sem associação ...

Discussão

Zebrafish oferecer uma ferramenta valiosa para modelar doença genética humana, a sua utilização como um instrumento científico para a pesquisa in vivo têm permitido estudos detalhados sobre a repartição genética de muitos sistemas biológicos, incluindo o rim. Muito se agora sabe sobre como o rim zebrafish desenvolve e funções. As semelhanças com nefrogênese humana e homologia com a doença que causa genes ²¹ ilustrou como peixe-zebra tornaram-se fundamentais na compreensão de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller	Intracel	P-97
borosilicate standard wall capillaries	Harvard Apparatus	30-0017
Glass microscope slides	VWR International	631-0109
Epoxy Resin Glue	Evo-Stik
Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran	Life technologies	D-1824
N-Phenylthiourea	Sigma-Aldrich	P7629
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich	A5040
methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
air compressor	Jun-Air	OF302-15
Picospritzer III	Parker Instruments	051-0500-900
compact 3-axis control micromanipulator	Marzhauser	MM33
Dissecting stereo microscope	Nikon	SMZ1000
microloader tips	Eppendorf	5242956003
Dumont #5 forceps	Sigma-Aldrich	F6521
stage micrometer	Pyser- SGI	02A00404