斑马鱼肾功能评价采用荧光测定间隙

摘要

斑马鱼是一种流行的工具来模拟慢性肾脏病（CKD）。然而，它们的小尺寸使得它不可能用传统方法评估肾功能。我们描述一个荧光染料肾清除率法^1，允许在CKD斑马鱼肾功能定量分析。

摘要

斑马鱼的胚胎提供了一个听话的模型来研究器官和模拟人类遗传性疾病。尽管其相对简单，斑马鱼肾开发并在几乎相同的方式作为人类的功能。在人类肾脏的结构的主要区别是数以百万计的肾相比，仅具有两个斑马鱼的存在。然而，简化这种复杂的系统进入基本功能单元已资助我们如何肾脏开发和运营的理解。在斑马鱼，位于肾小球中线负责初始血液过滤成发散熔合到彼此的泄殖腔之前两侧向下胚轴运行两个pronephric肾小管。在pronephric肾小管是人口稠密通过运动纤毛有利于滤液的运动沿着分割肾小管，使各种溶质，最后才通过泄殖腔^2-4退出交流。负责CKD，INC许多基因泸那些与ciliogenesis，已经研究了在斑马鱼^5。然而，一个主要的平局背面已在遗传操作之后评估斑马鱼肾功能的困难。传统的检测来衡量肾功能不全的人证明非平移，以斑马鱼，主要是由于他们的水生环境和小尺寸。例如，它不是物理上能够提取血液从对于尿素，肌酐含量分析胚胎上演鱼，因为它们太小。此外，斑马鱼不产生足够的尿液用于测试在一个简单的蛋白尿'试纸'，这是经常在初始病人检查执行。我们描述了一种荧光测定法，利用了斑马鱼的光学透明度，定量监测荧光染料的间隙，随着时间的推移，从脉管并通过肾脏，得到读出肾功能^1,6-9的。

引言

人肾起着从血液过滤代谢废物和回收所需溶质以维持细胞稳态的关键作用。有一个数字，引起肾功能障碍的人类遗传疾病。最常见的遗传性肾脏病是常染色体显性多囊肾病（ADPKD）的特征在于肾脏肾小管内的流体填充囊的发展;引起cystogenesis的损害是不利的肾功能^10。多囊肾具有1的发生:800 - 1:1000，占8 -的患者在末期肾衰竭^（ESRF）11 10％。几个基因有牵连导致多囊肾多囊，包括-1（PKD1）和-2（PKD2），约占85％的病例分别为^12,13 15％。此外，对于与PKD1基因产物-2定位于纤毛和是基本的ciliogenesis ^14,15。现在有人类遗传性疾病，被称为公认的家庭在ciliopathies，影响纤毛的功能，并导致CKD ^16。

越来越多的影响纤毛发育和功能的人类遗传疾病的画在这个曾经被认为是残留的细胞器全球利益。该纤毛，头发般的细胞突起，富含受体和必要的关键细胞信号事件的传导离子通道。该纤毛由一个微管系轴丝，典型地构造成9径向地布置微管双峰具有或不具有中央一对单峰的微管的。该轴丝结构定义的纤毛作用的类型和模式。 9 + 2微管排列赋予蠕动到它被用在跨越上皮表面流体的运动的纤毛。 9 + 0构造为非能动但被认为是主要的功能在细胞信号传递活动^17。除了CKD，睫状功能障碍的后果是一组特征ciliopathy功能，包括，肥胖症，视网膜变性，多趾，以及认知缺损^16。然而，CKD是其中最不利于患者生活质量，因此后面的适当的体内模型的发展纤毛相关CKD的主要动力。

斑马鱼是一个很好的模型，以了解人类遗传病的病因。他们的快速发展，生产大量的鸡蛋，透明的组织，和前宫内生长使得斑马鱼发育过程进行可视化和生物操纵的事件相当容易。基因可以使用的基因组编辑工具（CRISPR ¹⁸和TALENS ^19）最近成功进行遗传改变，撞倒使用反义吗啉代技术^20，或通过加入化合物以它们的水生环境中的药理学调节。事实上，斑马鱼提供了一个平台，承接éxperiments不在容许在其它动物模型。而斑马鱼都比较简单脊椎动物（相比人类）它们共同与人类有许多共同的功能保守的器官，基因，和信令进程。例如，斑马鱼肾是非常相似的结构和功能相比人类^21,22。然而，与哺乳动物肾，通过相的连续发展，各带标记的较发达的肾（前肾，中肾和后肾），胚胎斑马鱼只开发了一个前肾，肾的最不成熟的形式。虽然百万肾单位，可以发现在形成哺乳动物肾的积木，斑马鱼胚胎只具有两个。肾小球，它允许在初始血液滤液，融合在主动脉中线只是腹侧。通过肾小球成运行尾端沿轴线经由泄殖腔退出之前熔合pronephric肾小管血液过滤器。在pronephric TUbules被大量纤毛与运动纤毛是宽容到滤液对尾^3,4退出流通。这种简单的pronephric结构经过几个星期的幼虫生长在那里他们最终发展成一个更复杂的结构中肾²¹斑马鱼保持动态平衡。然而，斑马鱼从未开发出后肾^21。尽管斑马鱼特质，斑马鱼肾单位被分段与基因表达谱等于在哺乳动物观察，从而提供了在体内模型无与伦比为nephrogenesis ^3,22。

常规的患者通过一系列的血液和尿中的测试测试肾功能。通常将血液溶解的盐，尿素和肌酸酐进行分析。高水平的尿素，肌酸酐和异常盐浓度是指示问题具有肾功能。用比色试纸尿液检测的蛋白质，布卢异常水平D，脓液，细菌和现在的尿液样本中的糖。这样的测试通常需要大约30毫升尿液或5 - 加入10ml的血液。它已经难以在体内模式生物，如斑马鱼翻译这些类型的测定，以小的，主要是由于收集足够的血液或尿液进行测定的不可能性质。在这里，我们解决缺乏相应的斑马鱼肾功能检查，并描述了创新技术的研究。用荧光染料注射入血流中，我们能够通过肾脏，以监测和个别地量化随着时间的推移过滤和荧光活性的排泄从血液。该方法可用于研究疾病引起的肾损害，这是我们提供的一个例子。

研究方案

伦理学声明:动物保养，畜牧业和程序是由动物（科学程序）所有的动物实验已经进行了下符合生物授予内政大臣（PIL号七千八百九十二分之七十零）许可证法案1986年界定和控制服务管理组和生物服务伦理委员会，SGUL，伦敦，英国。所作的所有努力，以减少使用动物的数量，并以尽量减少痛苦，提高福利完善两个程序和畜牧业。

1.制备仪器，麻醉，并且荧光染料

1. 使用微量拉马和硼硅标准毛细血管壁（无灯丝）拉的适当长度针显微注射（ 图1A）。
2. 使琼脂糖模具胚胎易于注射的取向入心包（ 图1B）。胶约10玻璃显微镜SL新娘子在一起，形成抵消幻灯片的"楼梯"。为了达到最佳效果，请使用每张幻灯片的中心一滴快速设定环氧树脂胶。
3. 切出约78毫米长到一半使用本生灯加热的手术刀两个10毫升的塑料吸管的一段，取出吸管结束适当。附上和胶（环氧树脂）吸管部分，以​​堆叠的载玻片，以提供稳定性，以允许模具浸成90毫米的培养皿。尽一切努力，确保滑动角对准垂直于培养皿地板。允许胶时间来设置。
4. 浇铸模具中鱼水制成2％的琼脂糖溶液（来自水族馆获得）。倾琼脂糖成90毫米的培养皿，并放置在模具上开培养皿的顶部，允许堆叠滑刃淹没在琼脂糖表面下的角度。离开实验室长凳上设置30分钟。
5. 去除幻灯片演员和覆盖滑印琼脂糖新鲜的鱼水包含三卡因麻醉（见步骤1.9）在1:25的比例。
6. 使罗丹明右旋糖酐（RD）染料溶液。重悬罗丹明乙万兆瓦标记的葡聚糖在蒸压超纯水中，使得一个储备浓度为50毫克/毫升。对于显微注射，进一步稀释股票为5毫克/毫升在高压灭菌超纯水的最终浓度。
   注:色素细胞开始在斑马鱼从24小时受精后（HPF）区分;这些可以在图像采集过程中模糊的荧光标记物。
7. 用正-Phenylthiourea（PTU），其中块通过抑制酪氨酸酶的抑制黑色素生成黑色素的形成。使PTU的0.003％储备溶液通过在60℃下在水族馆的水，热溶液溶解PTU粉末完全溶解。
8. 孵育亚甲基蓝溶液，温和的杀菌剂斑马鱼胚胎，以防止霉菌大量繁殖，提高存活率。加入2毫升亚甲蓝原液，含0.1％亚甲蓝以Ultrapure水，至1升的水族馆的水和作为一个标准的胚胎培养基。
9. 补15mM的储备浓度三卡因/ 3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐中的说明"斑马鱼书^"23。麻醉胚胎，从而固定它们以执行注射过程。
10. 麻醉胚胎后，通过使用甲基纤维素的无毒性和粘性定向它们，用于成像。使200毫升制备3％的甲基纤维素，寒意130毫升水于-20℃下30分钟，并置于冰上。热70ml水至80℃，在一个玻璃烧杯中，加入6克甲基纤维素，和搅拌用玻璃棒，直到所有的颗粒润湿和均匀地分散。添加冰冷的水，混合，并允许准备在4℃等分到50ml试管前冷却30分钟。
    注:降低温度使甲基纤维素变成可溶性的。该解决方案将变得更浓作为粉末水合物。 3％的甲基纤维素可存储无细菌生长一个星期的时间很短，在4℃以上，在-20℃下。确保使用前甲基达到RT。
11. 以执行荧光染料注射入斑马鱼使用标准的显微注射设置（ 图1C）。这是由一个空气压缩机连接到压力调节器系统，该系统馈入用于与1.0外径毛细管使用的直吸管保持器。吸管持有人应被安置的MM33紧凑的3轴控制显微用磁性支架固定在一个钢制底板内。胚胎可以可视化，操纵和使用立体解剖显微镜注入。

2.斑马鱼饲养和预注射治疗

1. 维持斑马鱼如前所述^23。使用一个水族馆建立，提供在28.5℃的恒温供给再循环水分别7.2和450-550μS用碳酸氢钠和即时海洋海盐，电导率 - ，调节至pH为6.8。用野生型或转基因斑马鱼线适当实验，维持男性15例，放养密度为15名女性每8升油箱。鱼设施光周期设置为14小时上午9点之间的日光 - 晚上11点。
2. 斑马鱼产卵开始于光周期中，当灯在早上打开的开始。为了确保最大的蛋可在不干扰鱼类收集，收藏前淹没繁殖缸（含网状嵌件，可从斑马鱼专家）为野生型股票坦克的夜晚。
3. 对收集的一天，等待30 - 40分钟为鱼产卵，之后收集和冲洗用滤茶和新鲜的水族箱的水蛋。存清洗鸡蛋放在90毫米的培养皿含有胚胎培养基和孵化在28.5℃。
4. 对待胚胎PTU抑制黑色素起源。 8 HPF，在最短的液体转移可行的胚胎含有1新鲜培养皿:100 PTU胚胎中，进一步培养在28.5°C，直到72高倍视野。
   注:PTU可引起发育缺陷，如果用在早期阶段所以应限制要发表8 HPF阶段，但可以迟至24 HPF处理。晚此外PTU不完全阻塞眼部色素沉着，但一般是成功的，抑制黑色素细胞干线形成。

3.显微注射

注:心包包住心脏，但被流体心包腔内分开保护和方便的心脏运动。这个程序的目的是要注入的RD进入心包腔，这允许所述染料到脉管系统的快速吸收。

1. 负载针与6微升 - 稀释RD，使用微加载提示和安全进入显微的持针器。打破针用细TIPP结束编辑钳（ 图1A）。移动的RD溶液到针的尖端通过最大化脉冲持续到分钟设定，切换回毫秒一次完成。
2. 使用一个阶段微米，压力调节器，和改进对针尖长度（使用镊子）来调整排出液滴的大小为100微米的直径，这相当于0.5 NL体积（ 图2A）。
   注:当破针，小心不要折断太多关闭否则会令校准注射量困难。如果需要的话，进一步打破针尖以增加墨滴大小然而，保持的针厚度，允许进入心包无需过度弯曲或损坏的组织。
3. 注射前，在麻醉胚胎培养基含有三卡因的胚胎。建立含有5ml的胚胎中，标签1'三卡因"和其他'恢复'2×35毫米培养皿。
4. 加入200股市微升的三卡因在适当标记的菜。一旦准备就绪注入，选择单个胚胎在72 HPF，并在最短的液体转移到三卡因菜。监测胚胎的活性，测试胚胎被麻醉并用截短微加载尖端通过温和搅拌固定。
5. 麻醉胚胎转移到注射模具和定向内琼脂糖槽所以左侧朝上，定位心脏到的视场的左侧的胚胎。
6. 到RD注入心脏，刺破用针心包注入1 NL RD入心包的麻醉胚胎（ 图2B，右图）的腔。注射后撤回针。在最小的液体转移注入胚胎到'恢复菜'和监测1分钟。个别胚胎移植至含有1ml新鲜胚胎培养基（含PTU）24孔板并正确标记。
   注意:心包是艰难的，但有是那里的心包符合腹，尾咽弓和背侧，喙卵黄囊（ 图2B箭头）的交点一个显着的薄弱点。针头应被定向到该槽。当针到位，手指上的显微顶部的自来水公司将有利于进入心包腔。
7. 重复步骤3.2 - 3.6元实验组至少有10胚胎，把每条鱼在一个单独的好，唯一labelto允许单个实验跟进。孵育在28.5℃下进行3小时。

4.图像采集

1. 在3小时后喷射（HPI）麻醉胚胎如前所述并转移到含有3％甲基纤维素35毫米培养皿。轻轻推胚胎到甲基纤维素和定向等侧面进行成像。
2. 获得的UV下将胚胎的图像，使用的过滤器的可视化ø˚F发出的光在570nm（ 图2C）。图像采集后，让胚胎在更换指定的良好之前恢复。获取图像的所有注射​​的胚胎，并进一步培养在28.5℃。
   注:在这个协议中，我们使用了荧光体视显微镜用TXR过滤器集，DFC300FX摄像头和相应的应用软件。记下后续图像采集准确采集设置。
3. 在24 HPI，如上所述获得的第二轮的图像。一旦所有的图像已被获取，在两个3 HPI和24 HPI，人道地处置胚胎或用于其他的实验手段例如，免疫组织化学。

5.图像处理

1. 量化每个注射胚胎的荧光强度，在3 HPI和24 HPI，通过NIH的ImageJ的软件分析图像。为了测量荧光强度，打开ImageJ的图像，并在1指定的感兴趣区域（ROI）的区域00 PX ^2（编辑→选择→指定）。
2. 在投资回报率（ 图2C）的中心位置的心脏，集测量，包括平均灰度和面积（分析→设置测量），进行测量（分析→测量）。完成对每个图像组，在3 HPI和24 HPI，每个胚胎和用于进一步处理的平均灰度值传送到电子表格。
   注:我们选择100像素²的固定投资回报率的大小，因为这包括胚胎之间的个人的心。的心脏被选择执行测量，由于其大尺寸，使一个方便的位置，以在进入肾脏之前测量血液的荧光内容。
3. 使用合适的统计软件进行统计分析。比较使用学生氏t检验组进行统计学意义。

结果

巴比二氏综合征（BBS）是一种罕见的异类ciliopathy影响约为1:全球¹⁶ 16万人。患者目前有许多相关的问题，包括多囊性肾脏，随后患者经常需要肾透析或移植^24。 ESRF是死亡BBS的最常见的原因，大约有30％的患者发展CKD ^16。目前，20个非相关的基因有牵连的BBS，没有发表基因型 - 表型的关联。在BBS蛋白质共享纤毛和基体，随着患者的特性特征，推断ciliopathy诊断中常见蛋白质定?...

讨论

斑马鱼提供了一个宝贵的工具，人类遗传病模型，他们作为一个科学仪器体内研究使用使许多生物系统，包括肾脏的遗传击穿详细的研究。很多现在被理解如何斑马鱼肾脏发展和功能。惊人的相似，以人类nephrogenesis和同源性致病基因²¹已示于理解如何斑马鱼已成为基本的基因功能导致肾疾病的病理学缺陷如何。事实上，遗传操作，可以毫不费力地使用反义吗啉击倒技术或更先进的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller	Intracel	P-97
borosilicate standard wall capillaries	Harvard Apparatus	30-0017
Glass microscope slides	VWR International	631-0109
Epoxy Resin Glue	Evo-Stik
Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran	Life technologies	D-1824
N-Phenylthiourea	Sigma-Aldrich	P7629
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich	A5040
methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
air compressor	Jun-Air	OF302-15
Picospritzer III	Parker Instruments	051-0500-900
compact 3-axis control micromanipulator	Marzhauser	MM33
Dissecting stereo microscope	Nikon	SMZ1000
microloader tips	Eppendorf	5242956003
Dumont #5 forceps	Sigma-Aldrich	F6521
stage micrometer	Pyser- SGI	02A00404