蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

要約

ゼブラフィッシュは、慢性腎臓病（CKD）をモデル化するための一般的なツールである。しかし、それらの小さいサイズは、それが不可能な従来の方法を使用して腎機能を評価することを可能にする。私たちは、CKDにおけるゼブラフィッシュ腎臓機能の定量的な分析を可能にする蛍光色素腎クリアランスアッセイ^1を記述する。

要約

ゼブラフィッシュ胚は、器官形成を研究し、人間の遺伝病をモデル化するための扱いやすいモデルを提供しています。その相対的なシンプルさにもかかわらず、ゼブラフィッシュ腎臓が開発し、人間とほぼ同じように機能します。ヒト腎臓の建設に大きな違いは、唯一の2があるゼブラフィッシュに比べネフロンの数百万の存在である。しかし、基本的な機能単位にそのような複雑なシステムを簡素化することは、腎臓が開発し、どのように動作するかの理解を助けている。ゼブラフィッシュでは、正中線に位置する糸球体は、排出腔で互いに融合する前に、胚軸上下左右対称に実行するように分岐する2前腎細管への最初の血液濾過を担当しています。前腎 ​​細管は重く最終的に排出腔^2-4を経由して、終了する前に、各種の溶質の交換を可能にする、セグメント化された尿細管に沿って、ろ液の移動を容易に運動性の繊毛が移入されている。 CKD株式会社の責任多くの遺伝子繊毛形成に関連するものをluding、ゼブラフィッシュ⁵に研究されている。しかし、主要なドローバック、遺伝子操作した後にゼブラフィッシュ腎機能を評価するのが困難となっている。ヒトで腎機能障害を測定するための伝統的なアッセイは、主に彼らの水生環境と小型サイズのため、ゼブラフィッシュに非翻訳を証明している。例えば、胚から血液を抽出するために、物理的に不可能であり、それらが小さすぎるように、尿素およびクレアチニン含有量の分析のために魚を上演した。また、ゼブラフィッシュは、多くの場合、最初の患者の検査中に実施されるシンプルな蛋白尿「ディップスティック」、上のテストのための十分な尿を生成しない。我々は、腎機能^1,6-9からの読み出しを与えるように、血管系から出腎臓を介して、経時的に、定量的蛍光色素のクリアランスを監視するためにゼブラフィッシュの光透過性を利用した蛍光アッセイを記載する。

概要

ヒト腎臓は、血液からの代謝老廃物を濾過し、細胞の恒常性を維持するために必要な溶質を回収することに重要な役割を果たしている。腎機能障害の原因となるヒトの遺伝疾患がいくつかあります。最も一般的な遺伝性腎疾患は腎炎尿細管内の流体満たされた嚢の開発によって特徴付けられる常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）です。嚢胞形成に起因する損傷は、腎臓機能¹⁰にとって有害である。 1,000 8占める-末期腎不全^（ESRF）11の患者の10％：800から1：ADPKD 1の発生がある。いくつかの遺伝子は約85％と、それぞれ^12,13症例の15％を占め、ポリシスチン1（PKD1）および-2（PKD2）を含む、ADPKDを引き起こすことが関係している。さらに、遺伝子PKD1のための製品と-2は、繊毛に局在し、繊毛形成^14,15の基本である。として知られているヒトの遺伝性疾患の認識の家族は、用意されました繊毛の機能に影響を与え、CKD ¹⁶もたらすciliopathies。

毛様体の発達と機能に影響を与える人間の遺伝性疾患の増加数は、このかつて考えられて残留細胞小器官におけるグローバル関心を集めている。繊毛、毛様細胞性突起は、重要な細胞シグナル伝達事象の伝達に必要な受容体及びイオンチャンネルに濃縮される。繊毛は、一般的に、または一重微小管の中央ペアなしで9放射状に配置された微小管のダブレットに構造化微小管ベースの軸糸で構成されています。軸糸構造は、繊毛作用の種類とモードを定義します。 9 + 2微小管の配置は、それが上皮表面を横切る流体の移動に利用されている繊毛に運動を付与する。 9 + 0構成は、非運動性であるが、主に細胞のシグナル伝達事象¹⁷において機能すると考えられている。別にCKDから、毛様体機能障害の影響は、特徴のセットです、肥満、網膜変性、多指症、及び認知障害^16を含むciliopathy機能。しかし、CKDは、患者の生活の質に最も有害なので、毛様体関連CKDのためのin vivoモデルで適切なの発展の主要な推進力の中で。

ゼブラフィッシュは、人間の遺伝病の病因を理解するための優れたモデルです。彼らの迅速な開発は、卵の大多数、透明な組織、および子宮外の成長の生産は、ゼブラフィッシュの発生過程を可視化し、生物学的事象が、かなり簡単に操作することができるようになります。遺伝子は、遺伝的に、ゲノム編集ツール（CRISPR ¹⁸とTALENS ^19）の最近の成功を使用して変更するアンチセンスモルホリノ技術^20を用いてノックダウン、または薬理学的に彼らの水生環境に対する化合物の添加によって調節することができる。確かに、ゼブラフィッシュは、電子を実施するためのプラットフォームを提供します他の動物モデルにおいて許容されないxperiments。ゼブラフィッシュ一方で、彼らは人間と共通する多くの機能的に保存された臓器、遺伝子、およびシグナル伝達プロセスを共有する（ヒトに比べて）比較的単純な脊椎動物である。例えば、ゼブラフィッシュの腎臓は、人間^21,22に比べて構造及び機能で非常に似ています。しかし、位相の連続を通じて開発した哺乳動物の腎臓とは異なり、それぞれがより発展腎臓（前腎、中腎、および後腎）でマークされ、胚のゼブラフィッシュは、前腎、腎臓の最も未熟型を開発しています。ネフロン数百万の哺乳類の腎臓のビルディングブロックを形成見つけることができる一方で、ゼブラフィッシュ胚2つだけを持っている。初期の血液濾過液を可能に糸球体は、大動脈のちょうど腹側正中で融合されている。排出腔を経由して終了する前に融合させ、軸に沿って尾側に実行する前腎細管への糸球体を通して血液フィルター。前腎TUbulesは重く尾側の出口^3,4に向けたろ液の流れに許容され、運動性繊毛と繊毛されている。この単純な前腎構造は、彼らが最終的にはより複雑な中腎構造²¹へと発展幼虫の成長の数週間を通じてゼブラフィッシュの恒常性を維持します。しかし、ゼブラフィッシュは、後腎^21を開発^したことがない。ゼブラフィッシュ特異性にもかかわらず、ゼブラフィッシュネフロンは、哺乳類で観察されたものと同等の遺伝子発現プロファイルでセグメント化され、したがって腎形成^3,22のための生体モデルで他の追随を許さないを提供しています。

日常的に患者の血液および尿検査の一連の腎機能について試験される。典型的には、血液を溶解した塩、尿素およびクレアチニンについて分析する。尿素、クレアチニンおよび異常な塩濃度の高いレベルは、腎機能の問題を示している。比色ディップスティックを使用して尿検査は、タンパク質、する当館の異常なレベルを検出し、dは、膿、細菌および尿サンプル中に存在する糖。 10ミリリットルの血液 - このようなテストは、通常、約30ミリリットルの尿または5が必要です。これは、主として、アッセイを行うために十分な血液や尿を収集不可能な性質のために、そのようなゼブラフィッシュのような生体内モデル生物、 小にこれらのタイプのアッセイを翻訳することは困難であった。ここでは、適切なゼブラフィッシュ腎機能検査の不足に対処し、その研究のための革新的な技術が記載されている。血流中に蛍光色素を注入することにより、我々は、腎臓を介して血液からろ過し、蛍光活性の排泄を監視し、個別に時間をかけて定量化することができる。この方法では、我々は、例を提供する病気によって引き起こされる腎障害を研究するために使用することができる。

プロトコル

倫理声明：動物のメンテナンス、畜産、および手続きは動物によって定義され、制御されている（科学的処置）法1986年のすべての動物実験は、生物学的に適合して内務大臣（PIL号7892分の70）によって与えられたライセンスの下で実施されましたサービス管理グループと生物サービス倫理委員会、SGUL、ロンドン、英国。すべての努力は、使用される動物の数を減少させ、苦痛を最小にし、福祉を向上させるために、手順および飼育の両方を洗練するために行われた。

楽器、麻酔剤、蛍光色素の調製

1. （フィラメントなしで）マイクロピペットプラーとホウケイ標準壁毛細血管を使用して、マイクロインジェクション（ 図1A）のための適切な長さの針を引っ張る。
2. 心膜（ 図1B）への容易な注射のための胚の向きのためにアガロースの金型を作成します。のり約10ガラス顕微鏡SL一緒のIDEオフセットスライドの「階段」を形成する。最良の結果を得るには、各スライドの中央に急速なセットエポキシ樹脂接着剤のドロップを使用。
3. ブンゼンバーナー加熱されたメスを用いてプラスチック製のピペット2 10ミリリットルを通じて長さを半で約78ミリメートルのセクションを切り取り、ピペットは、必要に応じて終了し削除します。金型90のペトリ皿中に浸漬することを可能にするために安定性を提供するために、積み重ねられたガラススライドにピペット部を取り付け、接着剤（エポキシ樹脂）。スライドの角をペトリ皿の床に垂直に整列することを確認するためにあらゆる努力をする。糊時間が設定できるようにする。
4. （水族館から入手）の魚を水に作ら2％アガロース溶液中に金型にキャスト。 90ミリメートルペトリ皿にアガロース注ぎ、オープンペトリ皿の上に金型を置き、積み重ねられたスライドはアガロース表面の下の角度で水没するエッジ許可する。 30分間の実験台に設定することにしておきます。
5. スライドキャストを取り外し、スライドインプリント新鮮な魚の水でアガロースをカバートリカイン麻酔薬を含む1：25の比率で（ステップ1.9を参照）。
6. ローダミンデキストラン（RD）染料のソリューションを作成します。ローダミンB、10,000MWの50 mg / mlのストック濃度を作るためにオートクレーブした超純水に標識デキストランを再懸濁する。マイクロインジェクションのために、さらにオートクレーブした超純水中5mg / mlの最終濃度にストックを希釈する。
   注：色素沈着細胞を24時間後に受精（HPF）からゼブラフィッシュに分化し始める。これらは、画像取得中蛍光マーカーを曖昧にすることができます。
7. ブロックは、チロシナーゼの阻害を介してメラニンN -Phenylthiourea（PTU）を使用してメラニン形成を阻害する。完全に可溶化するために60℃の水槽水、熱溶液にPTU粉末を溶解することによりPTU 0.003％原液を作る。
8. 真菌ブルームを防止し、生存率を高めるために、メチレンブルー溶液、穏やかな殺菌剤でゼブラフィッシュ胚を培養する。 Uの0.1％メチレンブルーを含む、メチレンブルー原液の2ミリリットルを追加します。ltrapure水、標準的な胚培地として、水槽の水および使用の1 Lに。
9. 「ゼブラフィッシュブック^」23の手順に従って、トリカイン/エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩の15 mMストック濃度を構成している。胚を麻酔し、結果的にマイクロインジェクションの手順を実行するためにそれらを固定化した。
10. 胚を麻酔した後、メチルセルロースの非毒性および粘性の特性を利用して画像化するために、それらを方向付ける。 、3％メチルセルロース200mlの準備を行う氷上で30分間置き、-20℃で130mlの水を冷却した。ガラスビーカー中で80℃の熱水70mlを、メチルセルロース6gのを追加し、全ての粒子が濡れ均一に分散されるまで、ガラス棒を用いて攪拌する。氷冷した水を加え混合し、製剤を50 mlチューブに等分する前に、30分間、4℃で冷却する。
    注：温度を下げることはメチルセルロースが可溶性になることができます。溶液は濃厚になります粉末水和物として。 3％のメチルセルロースを、細菌を4℃で一週間の短期間増殖または-20℃で長くすることなく保存することができる。メチルセルロースは、使用前にRTに達していることを確認してください。
11. ゼブラフィッシュへの蛍光色素の注入を実行するには、標準的なマイクロインジェクションのセットアップ（ 図1C）を使用します。これは、1.0外径毛細管で使用するためのストレートピペットホルダに供給する圧力調整器システムに接続された空気圧縮機で構成されている。ピペットホルダは、磁気スタンドにより鋼製基板に固定MM33コンパクトな3軸制御マニピュレーター内に収容されるべきである。胚を操作し、可視化し、立体解剖顕微鏡を用いて注入することができる。

2.ゼブラフィッシュ畜産とプレ噴射トリートメント

1. 以前に^23を説明したようにゼブラフィッシュを維持します。 28.5℃の一定温度で供給される循環水を供給する水槽セットアップを使用、pHを6.8に調整 - 7.2と重炭酸ナトリウムとインスタントオーシャン海塩、と450〜550μSの導電率をそれぞれ。 8 Lタンクあたり15人の女性に15人の男性の飼育密度を維持し、実験に適するように、野生型またはトランスジェニックゼブラフィッシュラインを使用してください。午後11時 - 午前9時との間に日光の14時間に魚ファシリティ光サイクルを設定します。
2. ゼブラフィッシュ産卵はライトが午前中に電源を入れたときに、光サイクルの開始時に開始する。最大の卵が魚を乱すことなく収集することができるようにするには、コレクションの前に夕方野生ストックタンクに（ゼブラフィッシュの専門家から入手可能なメッシュインサートを含む、）繁殖タンクを水没。
3. 収集し、茶こし、新鮮な水槽の水を使用して卵を洗い流した後、魚が産卵するための40分 - コレクションの日に、30を許可する。胚培地を含む90ミリメートルペトリ皿にきれいに卵を堆積し、28.5℃でインキュベートする。
4. メラノを阻害するためにPTUで胚を扱う創世記。 8 HPFでは、1を含む新鮮なペトリ皿に最小限の液体中の生存胚を転送：胚培地に100 PTUをし、さらに72 HPFまで28.5℃でインキュベートする。
   注：PTUので8 HPF段階を投稿する制限する必要があり、以前の段階で使用した場合発達障害を引き起こす可能性がありますが、遅くとも24 HPFとして扱うことができます。 PTUの後期に加え、完全に目の色素沈着をブロックするが、一般的には成功したとトランクメラニン形成を阻害されていません。

3.マイクロインジェクション

注：心膜は心臓を包むが、心膜キャビティ内の流体によって保護と心臓の動きを容易にするために分離されている。この手順の目的は、これは、脈管系への染料の迅速な取り込みを可能にする、心膜腔にRDを注入することである。

1. 6μlのロード針は - microloaderのヒントを使用して、RDに希釈し、マイクロマニピュレーターの針ホルダーに固定します。細かいティップを使用した針の端を破るED鉗子（ 図1A）。一度完全なミリ秒に切り替える、微細な設定にパルス持続時間を最大化することにより、針の先端にRDソリューションを移動します。
2. 直径が100μmに放出液滴のサイズを調整する（鉗子を用いて）針先端の長さに対するステージマイクロメーター、圧力調整器、および改良を使用し、これは0.5 nlの体積（ 図2A）に等しい。
   注：針を壊した場合、それ以外の場合は難しい注入量を校正するようになりますからあまりを壊さないように注意してください。必要であれば、さらなる液滴サイズを増加させるために針の先端を破るが、過度の屈曲または組織に損傷を与えることなく、心膜への進入を可能にする針の厚さを維持する。
3. 注射の前に、トリカインを含む胚培地中で胚を麻酔。 5ミリリットル胚培地、ラベル1」トリカイン」と他の「回復」を含む2×35ミリメートルペトリ皿を設定します。
4. 200を追加適切に標識された皿に株式トリカインのμL。注入する準備ができたら、72 HPFで個々の胚を選択して、トリカイン皿に最小限の液体中に移す。胚のアクティビティを監視し、胚を麻酔と切り捨てmicroloaderチップを用いて穏やかな攪拌により固定化されたテスト。
5. 射出成形金型に麻酔をかけた胚を移し、左側が視野の左に心を配置する、上を向いているので、アガローストラフ内の胚を方向付ける。
6. 心にRDを注入するために、針で心膜を貫通し、麻酔した胚（ 図2B、右パネル）の心膜腔にRDの1 NLを注入する。注射後に針を撤回。 「回復ディッシュ 'に最小限の液体中に注入された胚を移し、1分間監視します。適切に1ミリリットルの新鮮胚培地（PTUを含む）とラベルを含む24ウェルプレートに、個々の胚を転送します。
   注意：心膜は厳しいです、しかし心膜が腹-尾咽頭アーチと背吻側卵黄嚢（ 図2Bの矢印）を満たしている交差点で注目すべき弱点があります。針はこの溝に向けられるべき。針が所定の位置にあるときに、マイクロマニピュレータの上に指をしっかりとタップが心膜腔への侵入を容易にする。
7. 、実験群あたり少なくとも10の胚のために3.6別々のウェル内の各魚を置き、独自にlabelto許可個々の実験的なフォローアップ - 繰り返して、3.2を繰り返します。 3時間28.5℃でインキュベートする。

4.イメージング買収

1. 前述のように3時間後に注射（hpiの）で胚を麻酔し、3％メチルセルロースを含む35ミリメートルのペトリ皿に移す。静かメチルセルロースに胚をプッシュし、側面を画像化することができるので、方向付ける。
2. 可視化oについてフィルターを使用して、UV下での胚の画像を取得する570nmで（ 図2C）で放出された光fは。画像取得後、胚がよく指定されたに交換する前に回復することができます。すべての注入した胚のための画像を取得し、さらに28.5℃でインキュベートする。
   注：このプロトコルでは、我々はTXRフィルターセット、DFC300FXカメラと、それぞれのアプリケーション·ソフトウェアと蛍光実体顕微鏡を使用していました。次の画像取得のための正確な取得の設定をメモします。
3. 上記のように24 HPIでは、画像の第二ラウンドを獲得。すべての画像が取得された後、3 HPIと24 HPIの両方で、人道的に胚を処分するか、他の実験的な手段例えば、免疫組織化学のために使用します。

5.画像処理

1. NIHのImageJソフトウェアを用いて画像を解析することによって、3のhpi、24 hpiので、各注入された胚の蛍光強度を定量化する。 、蛍光強度を測定したImageJで画像を開いて、1から関心領域（ROI）を指定するには00 PX ^2（編集→選択→指定）。
2. ROI（ 図2C）の中心に心を置き、（→対策の分析）測定を行い、（→セットの測定値を分析します）は、平均グレースケールと面積を含めるように測定値を設定する。胚あたり、3 HPIと24 HPIで、画像のセットごとに記入し、さらなる処理のためにスプレッドシートに平均グレイスケール値を転送する。
   注：これは、胚間の個々の心をも包含するとして、私たちは100 PX ²の固定ROIサイズを選択しました。心臓が原因の前に腎臓に入る血液の蛍光量を測定するために便利な場所を可能にする、その大きなサイズに測定を行うために選択した。
3. 適切な統計ソフトウェアを使用して統計分析を実行します。スチューデントのt検定を用いて統計的有意性のためのグループを比較する。

結果

全世界で16万人^16：バルデ-ビードル症候群（BBS）は約1に影響を与える稀な異質ciliopathyです。多嚢胞腎臓を含む関連する問題の数が存在する患者は、その後の患者は頻繁に腎臓透析や移植が^24を必要とする。 ESRFはCKD ^16を開発^した患者の約30％で、BBSの死亡の最も一般的な原因である。現在、20の非関連遺伝子が公表遺伝子型 - 表現型関連でBBSに関与している。 B...

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、人間の遺伝病をモデル化するための貴重なツールを提供し、in vivoでの研究のための科学的な楽器としてのそれらの使用は、腎臓を含む多くの生物学的システムの遺伝内訳の詳細な研究を可能にしてきた。多くは今ゼブラフィッシュ腎臓の発達や機能方法について理解されている。病気の原因遺伝子と人間の腎形成と相同性に印象的な類似点^21は、ゼブラ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller	Intracel	P-97
borosilicate standard wall capillaries	Harvard Apparatus	30-0017
Glass microscope slides	VWR International	631-0109
Epoxy Resin Glue	Evo-Stik
Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran	Life technologies	D-1824
N-Phenylthiourea	Sigma-Aldrich	P7629
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich	A5040
methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
air compressor	Jun-Air	OF302-15
Picospritzer III	Parker Instruments	051-0500-900
compact 3-axis control micromanipulator	Marzhauser	MM33
Dissecting stereo microscope	Nikon	SMZ1000
microloader tips	Eppendorf	5242956003
Dumont #5 forceps	Sigma-Aldrich	F6521
stage micrometer	Pyser- SGI	02A00404