Transfectar células RAW264.7 con un gen informador de luciferasa

Resumen

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Resumen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency¹, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Introducción

La transfección de ácidos nucleicos en las células tiene una aplicación diversa en la investigación científica. Los ejemplos incluyen (1) genes indicadores para estudiar el papel de los diferentes elementos de genes en la expresión génica, (2) los plásmidos de expresión de proteínas que sobreexpresan la proteína de interés, y (3) pequeños ARN de interferencia para downregulate la expresión génica. Mediante la manipulación del nivel de expresión de genes particulares y midiendo el efecto diferencial de tales manipulaciones, los investigadores pueden deducir las funciones de los genes en los sistemas biológicos seleccionados. No todos los métodos de transfección proporcionan las mismas eficacias de transfección, e incluso el mismo método de transfección no transfectar todos los tipos celulares igualmente ^1. Por lo tanto, los diferentes métodos de transfección se han desarrollado tal como el método de fosfato de calcio, DEAE dextrano, transfección de lípido catiónico, catiónicos transfección polímero no lípidos, electroporación, y nucleofection ^2,3.

La transfección en macrófagos es ESPEcialmente difícil debido al hecho de que los macrófagos son fagocitos profesionales que son muy sensibles a materiales extraños, incluyendo bacterias derivados (metilado) DNA ^4. Introducción de ADN extraño activa la vía Toll-like receptor 9 (TLR9) que conduce a la producción de citoquinas y ^5,6 óxido nítrico. Estos macrófagos activados pueden entonces ser menos sensible al tratamiento que los investigadores pretenden estudiar.

Nuestro laboratorio transfecta rutinariamente la RAW264.7 línea celular de macrófagos con genes informadores de luciferasa, y hemos desarrollado un protocolo que es lo suficientemente robusta como para tener señal de luciferasa significativamente más alto que el fondo, pero también lo suficientemente suave para los macrófagos se mantengan en su estado de reposo. Los comportamientos de las células transfectadas fueron evaluados por un gen reportero de luciferasa de luciérnaga-albergar la región promotora del IκBζ (pGL3- IκBζ). IκBζ expresión está regulada por el labio componente de la pared celular bacterianaopolyssacharide (LPS) ^7,8, y downregulated por la citoquina anti-inflamatoria, la interleucina-10 (IL-10) ^8. Para tener en cuenta la variación de transfección entre pozos, co-transfectar un plásmido de control que contiene el gen de la luciferasa de Renilla (por ejemplo, phRL-TK) con fines de normalización. El protocolo descrito se optimiza después de probar varios parámetros incluyendo la sincronización de la transfección, el tipo de reactivos de transfección, las cantidades de reactivos de transfección y de ADN de plásmido, así como la relación de reactivo de transfección con el plásmido de ADN. Los dos reactivos de transfección incluidos en este protocolo son (1) un reactivo de transfección a base de lípidos y (2) a / reactivo de transfección a base de poliamina proteína.

Protocolo

1. El plásmido DNA Purification

1. Extraer el ADN plásmido usando un kit de maxiprep de acuerdo con el protocolo del fabricante. ADN plásmido Resuspender en 500 l de tampón TE.
2. Realizar un fenol: cloroformo: alcohol isoamílico extracción y precipitación con isopropanol para eliminar contaminantes bacterianos residuales. La presencia de LPS interfiere con la transfección ^9.
   1. Añadir 500 l de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1, pH 8) con el ADN plásmido y agitar enérgicamente durante 15 seg. El fenol provoca quemaduras graves en la piel y es un anestésico para quemaduras no siempre se hacen sentir hasta que no haya daños severos. Realizar fenol: extracción de isoamilo en la campana de humos y tenga cuidado: cloroformo.
3. Incubar la mezcla durante 5 min a TA. Centrifugar a 13000 xg durante 10 min a TA. Transferir 350 l de fase acuosa superior a un nuevo tubo de 1,5 ml colección.
4. Añadir 350 l de tampón TE al tubo que contiene la fase orgánica inferior. Agitar enérgicamente durante 15 segundos. Centrifugar a 13.000 xg durante 5 min a TA. Transferir 350 l de fase acuosa superior a la misma tubo de recogida de 1,5 ml.
5. Añadir 70 l de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y mezclar bien. Añadir 700 l de 100% de isopropanol. Mezclar bien e incubar 10 min a TA. Se centrifuga a 13.000 xg durante 10 MINAT 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
6. Añadir 500 l de etanol al 75% al ​​sedimento. Muestras de mezclar en vórtex y centrifugar a 5000 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. ADN es en el sedimento.
7. Abrir el tapón del tubo y el aire seco el sedimento a temperatura ambiente durante de 5 - 10 min. El sedimento debe convertirse translúcido. Añadir 500 l de tampón TE para resuspender el sedimento de ADN. Se calienta a 50 - 60 ° C durante 10 min para disolver el sedimento de ADN.
8. Medir la absorbancia a 260 nm (A260) y 280 nm (A280) con un espectrómetro. Calcular la concentración de ADN multiplicando el valor A260 por 50 ng / l. Evaluar la calidad del ADN por calculating la relación A260 / A280. ADN con alta calidad debe dar una relación A260 / A280 de 1,8-2,0.

2. El cultivo de células y Siembra

1. Células RAW264.7 Cultura en DMEM suplementado con suero fetal de ternera 9% (DMEM / 9% de FCS) en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora. Durante cada paso, separar las células de la placa por pipeteado continuo con una pipeta Pasteur. Passage las células cada 2 días, y sembrar 1,5-2.000.000 células en una placa de cultivo de tejidos tratados con 10 cm como el stock. Descongelar un nuevo balance de células cada 5-6 semanas.
2. En el día de la transfección, las semillas de 200.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos en un volumen de 500 l de DMEM / 9% de FCS. Se incuban las células durante 4 horas en la incubadora a 37ºC.
3. Transfectar células ya sea con el reactivo basado en lípidos (paso 3.1) o el reactivo de base poliamina-proteína / (paso 3.2).

3. La transfección

1. Basados ​​en lípidos transfección:
   1. Caliente el reagen transfecciónt a RT en la oscuridad. Calentar medio libre de suero y DMEM / 9% de FCS a 37 ° C.
   2. Añadir 0,5 g de ADN plásmido a 50 l de medio libre de suero en un tubo de 1,5 ml. Añadir 2 l de reactivo de transfección con la punta de la pipeta por debajo de la superficie del líquido. Vortex durante 6 s.
   3. Dejar reposar la mezcla reactivo / ADN en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.
   4. Durante la incubación de 30 minutos, retire los medios de comunicación desde el bien y añadir 250 l de DMEM / 9% de FCS a cada pocillo.
   5. Después de 30 min, añadir 250 l de DMEM / 9% de FCS a la mezcla de reactivo / ADN. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo.
   6. Añadir 300 l de la mezcla diluida a cada pocillo. Incubar durante 2-4 horas en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora.
   7. Retire solución de transfección y añadir 500 l de DMEM / 9% de FCS. Incubar durante 24 - 48 horas en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora antes de la estimulación celular.
2. Proteína / a base de poliamina transfección:
   1. Calentar el suero librey medio DMEM / 9% de FCS a 37 ° C.
   2. Añadir 0,75 l de reactivo de transfección de 18,75 l de medio libre de suero. Vortex brevemente para mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 0,5 l de 1 mg / l de ADN en el reactivo transfectadas diluida. Incubar a TA durante 10 min.
   3. Durante la incubación de 10 min, quitar el medio de cada pocillo de la placa de 24 pocillos y añadir 250 l fresco DMEM / 9% de FCS a cada pocillo.
   4. Después de 10 min, añadir 250 l de DMEM / FCS 9% en la mezcla de reactivo / ADN.
   5. Añadir 270 l de la mezcla diluida al pozo. Incubar en un incubador de _CO2 de 37 ° C y 5% para 2-4 horas.
   6. Retire solución de transfección y añadir 500 l de DMEM / 9% de FCS. Incubar durante 24 - 48 horas en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora.

4. La estimulación celular y ensayo de luciferasa

1. Reemplace los medios en los bien con 250 l de DMEM / 9% de FCS.
2. Añadir 50 l de LPS o LPS + IL-10 A las concentraciones deseadas al pozo. Devuelva la placa a la 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora. Estimular el 2 - 6 horas.
3. Retire solución estimulación mediante aspiración, lavar con PBS frío hielo, y añadir 200 l de 1x pasiva tampón de lisis. Roca a temperatura ambiente durante 30 min. Raspar y transferir el lisado a tubos de 1,5 ml y eliminar los desechos celulares por centrifugación a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
4. Transferencia de 40 l de lisado aclarado (sobrenadante) a un plato blanco, fondo claro de 96 pocillos para la determinación de las señales de luciferasa de acuerdo con el protocolo del fabricante.
5. Lea la señal de luciferasa con un luminómetro en todo el espectro de luz visible.

Análisis 5. Datos

1. Calcular la luciérnaga: relación Renilla dividiendo los valores individuales de la luciferasa de luciérnaga por los valores de Renilla luciferasa de cada pocillo.
2. Calcular el cambio veces dividiendo la luciérnaga: Renilla relación del tratado bien porque del pozo sin tratar.

Resultados

La Figura 1 compara la eficiencia de transfección de los dos reactivos de transfección en RAW264.7. El reactivo basado en lípidos típicamente dio aproximadamente 25% de tasa de transfección, mientras que la transfección basado poliamina-proteína / resultó en aproximadamente 5% de eficiencia (Figura 1A). La diferencia en la eficiencia de transfección se observó también en señales de luciferasa en las células RAW264.7 transfectadas con el promotor reportero pGL3-IκBζ

Discusión

El protocolo descrito aquí no sólo se centran en la eficiencia de la transfección, sino que pretende lograr un equilibrio entre la eficiencia y la conservación de los estados fisiológicos de las células. Específicamente, nuestro procedimiento tiene éxito en la reducción de la toxicidad del reactivo de transfección y la maximización de la señal de luciferasa.

Un paso crítico en el protocolo es la salud de las células. Culturas Cubierto de vegetación no son adecuados para la tra...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Life Technologies	K210007	Any maxiprep kit will work
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Life Technologies	15593-049	Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container.
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	Warm in 37°C water bath before use.
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH30396.03	Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use.
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Warm to at least room temperature before use.
XtremeGene HP DBA transfection reagent	Roche	6366236001	Warm to room temperature before use.
GeneJuice	EMD Millipore	70967	Warm to room temperature before use.
5X Passive Lysis Buffer	Promega	E1941	30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910