RAW264.7 transfecção de células com um gene repórter de luciferase

Resumo

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Resumo

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency¹, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Introdução

A transfecção de ácidos nucleicos em células tem uma aplicação variada na pesquisa científica. Exemplos incluem (1) genes repórter para estudar o papel dos diferentes elementos do gene na expressão do gene, (2) expressão da proteína plasmídeos para sobre-expressar a proteína de interesse, e (3) pequeno ARN interferente para regular negativamente a expressão do gene. Ao manipular o nível de expressão de genes particulares e medindo o efeito diferencial de tais manipulações, os investigadores podem-se deduzir as funções de genes em sistemas biológicos seleccionados. Nem todos os métodos de transfecção fornecer a mesma eficiência de transfecção, e mesmo o mesmo método de transfecção não transfectar células igualmente todos os tipos ^1. Assim, diferentes métodos de transfecção têm sido desenvolvidos, tais como o método de fosfato de cálcio, DEAE dextrano, transfecção catiónica lípido, polímero catiónico transfecção não com lipidos, electroporação, e nucleofection ^2,3.

A transfecção em macrófagos é especialmente difícil devido ao fato de que os macrófagos são fagócitos profissionais que são muito sensíveis a materiais estranhos, incluindo as bactérias derivadas (desnaturado) de ADN ^4. A introdução de ADN estranho activa a via do receptor de tipo Toll 9 (TLR9) que conduz à produção de citocinas e ^5,6 de óxido nítrico. Estes macrófagos activados podem então ser menos sensível ao tratamento que os investigadores pretende examinar.

O nosso laboratório transfects rotineiramente a linha celular RAW264.7 de macrófagos com genes repórter da luciferase, e temos desenvolvido um protocolo que seja robusto o suficiente para que o sinal de luciferase significativamente mais elevada do que o fundo, mas também suficientemente suave para os macrófagos para permanecer no seu estado de repouso. Os comportamentos das células transfectadas foram avaliados por um gene repórter de luciferase de pirilampo-abrigando a região de promotor de IκBζ (pGL3- IκBζ). IκBζ expressão é regulada positivamente pelo lábio componente da parede celular bacterianaopolyssacharide (LPS) ^7,8, e regulados negativamente pela citocina anti-inflamatória, interleucina-10 (IL-10) ^8. Para ter em conta a variação entre os poços de transfecção, que co-transfectar um plasmídeo controlo que contém o gene da luciferase de Renilla (por exemplo, phRL-TK) para fins de normalização. O protocolo descrito foi optimizado depois de testar vários parâmetros, incluindo a temporização da transfecção, do tipo de reagentes de transfecção, as quantidades de reagentes de transfecção de ADN e o plasmídeo, bem como a relação de reagente de transfecção de plasmídeo de ADN. Os dois reagentes de transfecção incluídos neste protocolo são (1) um reagente de transfecção à base de lípidos e (2) um / reagente de transfecção à base de poliamina proteína.

Protocolo

1. O plasmídeo de ADN A purificação

1. Extrair ADN de plasmídeo utilizando um kit maxiprep de acordo com o protocolo do fabricante. Ressuspender o ADN do plasmídeo em 500 ul de tampão TE.
2. Execute um fenol: clorofórmio: álcool isoamílico extração e precipitação com isopropanol para remover contaminantes bacterianos residuais. A presença de LPS interfere com transfecção ^9.
   1. Adicionar 500 ul de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1, pH 8) para o ADN de plasmídeo e agitar vigorosamente durante 15 segundos. Fenol provoca queimaduras graves na pele e é um anestésico assim queimaduras não são sempre senti até que haja danos graves. Execute fenol: extração isoamyl no exaustor e tome cuidado: clorofórmio.
3. Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar a 13.000 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Transferir 350 ul da fase aquosa superior num novo tubo de recolha de 1,5 ml.
4. Adicionar 350 ul de tampão TE para o tubo que contém a fase orgânica inferior. Agita-se vigorosamente durante 15 segundos. Centrifugar a 13000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Transferir 350 ul da fase aquosa superior para o mesmo tubo de recolha de 1,5 ml.
5. Adicionar 70 ul de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e misture bem. Adicionar 700 mL de isopropanol a 100%. Misturar bem e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. Centrifugar a 13.000 xg durante 10 minat 4 ° C. Remover o sobrenadante.
6. Adicionar 500 ul de etanol a 75% ao sedimento. Amostras Vortex para misturar e centrifugar a 5000 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante. ADN é no pelete.
7. Abrir a tampa do tubo de ar e secar o sedimento à temperatura ambiente durante 5 - 10 min. A pelete deve tornar-se translúcido. Adicionar 500 ul de tampão TE para ressuspender o sedimento de DNA. Aquece-se a 50 - 60 ° C durante 10 min para dissolver o sedimento de DNA.
8. Medir a absorvância a 260 nm (A260) e a 280 nm (A280) com um espectrómetro. Calcula-se a concentração de ADN pela multiplicação do valor de A260 de 50 ng / ul. Avaliar a qualidade do DNA por calculating a razão A260 / A280. DNA com alta qualidade deve dar uma razão A260 / A280 de 1,8-2,0.

2. A cultura celular e Sementeira

1. Células RAW264.7 Culturas em DMEM suplementado com 9% de soro fetal de vitelo (DMEM / 9% de FCS) em uma temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2. Durante cada passagem, separar as células a partir da placa por pipetagem contínua, usando uma pipeta de Pasteur. Passage as células a cada dois dias, e semear 1,5-2.000.000 células em um prato de cultura de tecidos tratados 10 centímetros como o estoque. Descongelar um novo estoque de células a cada 5-6 semanas.
2. No dia da transfecção, as sementes 200.000 células por poço numa placa de 24 poços num volume de 500 ul de DMEM / 9% de FCS. Incubam-se as células durante 4 horas na temperatura de 37 ° C incubadora.
3. Ou transfectar células com o reagente à base de lípidos (passo 3.1) ou o reagente à base de poliamina-proteína / (passo 3.2).

3. Transfecção

1. Transfecção à base de lípidos:
   1. Aqueça o Reagen transfecçãot até à TA no escuro. Aquece-se meio isento de soro e meio DMEM / 9% de FCS a 37 ° C.
   2. Adicionar 0,5 ug de ADN de plasmídeo e 50 uL de meio isento de soro em um tubo de 1,5 ml. Adicionar 2 l de reagente de transfecção com a ponta da pipeta abaixo da superfície do líquido. Vortex por 6 s.
   3. Deixar a mistura de reagente / ADN no escuro à temperatura ambiente durante 30 min.
   4. Durante os 30 minutos de incubação, remova a mídia do bem e adicionar 250 mL de fresco DMEM / FCS 9% a cada poço.
   5. Após 30 min, adicionar 250 ul de DMEM / FCS a 9% à mistura reagente / ADN. Misture bem, pipetando cima e para baixo.
   6. Adicionar 300 ul da mistura diluída para cada poço. Incubar durante 2-4 horas numa temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2.
   7. Remover solução de transfecção e adicionar 500 ul de DMEM / 9% de FCS. Incubar durante 24-48 h num banho a 37 ° C, 5% de _CO2 antes da estimulação das células.
2. Proteína / transfecção com base em poliamina:
   1. Aqueça-se livre de soroe meio DMEM / 9% de FCS a 37 ° C.
   2. Adicionar 0,75 mL de reagente de transfecção de 18,75 ul de meio isento de soro. Vortex brevemente para misturar. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Adicionar 0,5 uL de 1 ug / ul de ADN no reagente transfectadas diluída. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
   3. Durante a incubação de 10 min, remover o meio de cada poço da placa de 24 cavidades e adicionar 250 ul de DMEM fresco / 9% de FCS a cada poço.
   4. Após 10 min, adicionar 250 ul de DMEM / FCS a 9% na mistura reagente / ADN.
   5. Adicionar 270 ul da mistura diluída para o poço. Incubar em 37 ° C e 5% de _CO2 durante 2-4 horas.
   6. Remover solução de transfecção e adicionar 500 ul de DMEM / 9% de FCS. Incubar durante 24-48 h num banho a 37 ° C, 5% de _CO2.

4. Estimulação celular e ensaio de luciferase

1. Substituir mídia nos bem com 250 ul de DMEM fresco / 9% FCS.
2. Adicionar 50 ul de LPS ou LPS + IL-10 Nas concentrações desejadas no bem. E volta a placa para a temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2. Estimular para 2-6 horas.
3. Remover solução estimulação por aspiração, lava-se com PBS arrefecido em gelo, e adicionar 200 ul de 1x tampão de lise passivo. Rocha à temperatura ambiente durante 30 min. Raspar e transferir o lisado para tubos de 1,5 ml e remover os detritos celulares por centrifugação a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
4. Transferir 40 uL de ligado clarificado (sobrenadante) para um branco, claro fundo placa de 96 cavidades para a determinação de sinais de luciferase de acordo com o protocolo do fabricante.
5. Ler o sinal de luciferase com um luminómetro em todo o espectro de luz visível.

Análise 5. Dados

1. Calcular o pirilampo: rácio de Renilla dividindo os valores individuais da luciferase do pirilampo por os valores de Renilla luciferase de cada poço.
2. Calcule a variação vezes dividindo o vaga-lume: Renilla razão do bem tratados pelosque do poço não tratado.

Resultados

A Figura 1 compara a eficiência da transfecção dos dois reagentes de transfecção em RAW264.7. O reagente à base de lípidos deu tipicamente cerca de 25% a taxa de transfecção, enquanto a transfecção com base em poliamina proteína / resultou em cerca de 5% de eficiência (Figura 1A). A diferença na eficiência de transfecção foi também observada em sinais de luciferase em células RAW264.7 transfectadas com o repórter do promotor pGL3-IκBζ (Figura 1B). ...

Discussão

O protocolo descrito aqui não incidir exclusivamente sobre a eficiência de transfecção, mas tem o objetivo de estabelecer um equilíbrio entre eficiência e preservação dos estados fisiológicos das células. Especificamente, o nosso procedimento consegue minimizar a toxicidade do reagente de transfecção e maximização de sinal da luciferase.

Um passo essencial no protocolo é a saúde das células. Culturas crescidas não são adequados para a transfecção quanto suas alterações...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Life Technologies	K210007	Any maxiprep kit will work
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Life Technologies	15593-049	Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container.
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal bovine serum	Thermo Scientific	SH30396.03	Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use.
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Warm to at least room temperature before use.
XtremeGene HP DBA transfection reagent	Roche	6366236001	Warm to room temperature before use.
GeneJuice	EMD Millipore	70967	Warm to room temperature before use.
5x Passive Lysis Buffer	Promega	E1941	30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910