Trasfettando Cellule RAW264.7 con luciferasi Reporter Gene

Riepilogo

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Abstract

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency¹, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Introduzione

La trasfezione di acidi nucleici nelle cellule ha un'applicazione diversificata nella ricerca scientifica. Gli esempi includono (1) geni reporter per studiare il ruolo dei diversi elementi di gene espressione genica, (2) plasmidi di espressione proteica per overexpress la proteina di interesse, e (3) small interfering RNA downregulate espressione genica. Manipolando il livello di espressione di particolari geni e misurando l'effetto differenziale di tali manipolazioni, i ricercatori possono dedurre le funzioni geniche nei sistemi biologici scelti. Non tutti i metodi di trasfezione forniscono la stessa efficienza di trasfezione, e anche lo stesso metodo di trasfezione non trasfettare tutti i tipi cellulari parimenti ^1. Quindi, diversi metodi di trasfezione sono stati sviluppati come metodo di fosfato di calcio, DEAE destrano, cationico lipidi trasfezione, cationico trasfezione polimero non lipidi, elettroporazione, e nucleofection ^2,3.

Transfection in macrofagi è especialmente difficile a causa del fatto che i macrofagi sono fagociti professionali che sono molto sensibili a materiali estranei, tra cui i batteri derivati ​​(metilato) DNA ^4. Introduzione di DNA estraneo attiva la via Toll-like receptor 9 (TLR9) che porta alla produzione di citochine e ossido nitrico ^5,6. Questi macrofagi attivati ​​possono quindi essere meno sensibili al trattamento che i ricercatori intendono esaminare.

Il nostro laboratorio transfects regolarmente la linea cellulare di macrofagi RAW264.7 con geni reporter luciferasi, e abbiamo sviluppato un protocollo che è abbastanza robusto per avere segnale luciferasi significativamente superiore a quello di fondo, ma anche abbastanza delicato per i macrofagi di rimanere al loro stato di riposo. I comportamenti delle cellule trasfettate sono state valutate da un gene reporter luciferasi di lucciola-ospitare la regione del promotore di IκBζ (pGL3- IκBζ). Espressione IκBζ è upregulated dalla parete cellulare batterica componente labbroopolyssacharide (LPS) ^7,8, e downregulated dalla citochina anti-infiammatoria, interleuchina-10 (IL-10) ^8. Per tenere conto delle variazioni trasfezione tra pozzi, abbiamo co-trasfettare un plasmide di controllo che contiene il gene della luciferasi Renilla (ad esempio, phRL-TK) a fini di normalizzazione. Il protocollo descritto è ottimizzato dopo test vari parametri tra cui tempi di trasfezione, tipo di reagenti di trasfezione, quantità di reagenti e trasfezione di DNA plasmidico, così come rapporto di reagente di trasfezione di DNA plasmidico. I due reagenti di trasfezione compresi in questo protocollo sono (1) un reagente di trasfezione base lipidica e (2) una proteina / basato poliammina-trasfezione reagente.

Protocollo

1. plasmide DNA Purification

1. Estrarre DNA plasmidico utilizzando un kit maxiprep secondo il protocollo del produttore. Risospendere plasmide DNA in 500 ml di tampone TE.
2. Eseguire un fenolo: cloroformio: estrazione di alcool isoamilico e isopropanolo precipitazioni per rimuovere i contaminanti batterici residue. La presenza di LPS interferisce con trasfezione ^9.
   1. Aggiungere 500 ml di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1, pH 8) al DNA plasmide e agitare energicamente per 15 sec. Fenolo provoca gravi ustioni cutanee ed è un anestetico così ustioni non sono sempre sentito fino a quando vi è un danno grave. Eseguire fenolo: estrazione isoamilico nella cappa e usare cautela: cloroformio.
3. Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 13.000 xg per 10 min a RT. Trasferire 350 ml di fase acquosa superiore in una nuova provetta di raccolta da 1,5 ml.
4. Aggiungere 350 microlitri di tampone TE alla provetta che contiene la fase organica inferiore. Agitare energicamente per 15 sec. Centrifugare a 13.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire 350 ml di fase acquosa superiore allo stesso tubo di raccolta da 1,5 ml.
5. Aggiungere 70 ml di 3 M acetato di sodio (pH 5.2) e mescolare bene. Aggiungere 700 ml di isopropanolo al 100%. Mescolare bene e incubare 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 13.000 xg per 10 minat 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
6. Aggiungere 500 ml di etanolo al 75% al ​​pellet. Campioni Vortex di mescolare e centrifugare a 5000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. DNA è in pellet.
7. Aprire il tappo del tubo e asciugare il pellet a temperatura ambiente per 5 - 10 min. Il pellet dovrebbe diventare trasparente. Aggiungere 500 ml di tampone TE per risospendere il pellet di DNA. Riscaldare a 50 - 60 ° C per 10 minuti per sciogliere il pellet di DNA.
8. Misurare l'assorbanza a 260 nm (A260) e 280 nm (A280) con uno spettrometro. Calcolare la concentrazione di DNA moltiplicando il valore A260 da 50 ng / ml. Valutare la qualità del DNA da parte calculating il rapporto A260 / A280. DNA con alta qualità dovrebbe dare un rapporto A260 / A280 di 1,8-2,0.

2. Coltura cellulare e Seeding

1. Culture cellule RAW264.7 in DMEM supplementato con siero fetale di vitello 9% (DMEM / 9% FCS) a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore. Durante ogni passaggio, staccare le cellule dalla piastra pipettando continuo utilizzando una pipetta Pasteur. Passage le celle ogni 2 giorni, e sementi 1,5-2.000.000 cellule su un piatto di coltura di tessuti trattati 10 centimetri come il magazzino. Scongelare un nuovo stock di cellule ogni 5-6 settimane.
2. Il giorno della trasfezione, sementi 200.000 cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti in un volume di 500 ml di DMEM / 9% FCS. Incubare le cellule per 4 ore in C incubatore 37 °.
3. Cellule transfect sia con il reagente a base lipidica (passo 3.1) o del reattivo a base di poliammine proteine ​​/ (punto 3.2).

3. Trasfezione

1. A base di lipidi trasfezione:
   1. Riscaldare il reagen trasfezionet a Rt nel buio. Warm up mezzo privo di siero e DMEM / 9% FCS a 37 ° C.
   2. Aggiungere 0,5 pg di DNA plasmidico a 50 ml di mezzo privo di siero in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 2 ml di reagente di trasfezione con la punta della pipetta di sotto della superficie del liquido. Vortex per 6 secondi.
   3. Lasciare la miscela reagente / DNA al buio a temperatura ambiente per 30 min.
   4. Durante la 30 min di incubazione, rimuovere il supporto dal bene e aggiungere 250 ml di fresco DMEM / 9% FCS per ogni bene.
   5. Dopo 30 min, aggiungere 250 ml di DMEM / 9% FCS per la miscela reagente / DNA. Mescolare bene pipettando su e giù.
   6. Aggiungere 300 microlitri della miscela diluita in ciascun pozzetto. Incubare per 2 - 4 ore a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
   7. Rimuovere la soluzione di trasfezione e aggiungere 500 ml di DMEM / 9% FCS. Incubare per 24 - 48 ore a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore prima stimolazione cellulare.
2. Proteine ​​/ a base di poliammine-trasfezione:
   1. Warm up privo di sieromedio e DMEM / 9% FCS a 37 ° C.
   2. Aggiungere 0,75 ml di reagente di trasfezione a 18,75 ml di terreno privo di siero. Vortex brevemente per miscelare. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Aggiungere 0,5 ml di 1 mg / ml di DNA nel reagente transfettate diluito. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
   3. Durante i 10 minuti di incubazione, rimuovere il supporto da ciascun pozzetto della piastra da 24 pozzetti e aggiungere 250 microlitri DMEM fresco / 9% FCS per ogni bene.
   4. Dopo 10 min, aggiungere 250 ml di DMEM / 9% FCS nella miscela reagente / DNA.
   5. Aggiungere 270 microlitri della miscela diluita al pozzo. Incubare in un incubatore CO ₂ 37 ° C e 5% per 2-4 ore.
   6. Rimuovere la soluzione di trasfezione e aggiungere 500 ml di DMEM / 9% FCS. Incubare per 24 - 48 ore a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.

4. La stimolazione cellulare e luciferasi Assay

1. Sostituire media negli bene con 250 ml di fresco DMEM / 9% FCS.
2. Aggiungere 50 ml di LPS o LPS + IL-10 Alle concentrazioni desiderate al pozzo. Riportare la piastra a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore. Stimolare per 2-6 ore.
3. Rimuovere la soluzione stimolazione mediante aspirazione, lavare con ghiaccio freddo PBS e aggiungere 200 ml di 1x Passive Lysis Buffer. Roccia a temperatura ambiente per 30 min. Raschiare e trasferire il lisato provette da 1,5 ml e rimuovere i detriti cellulari per centrifugazione a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C.
4. Trasferimento 40 ml di lisato eliminato (surnatante) a una, chiara fondo piastra a 96 pozzetti bianco per la determinazione di segnali luciferasi secondo il protocollo del produttore.
5. Leggere il segnale luciferasi con un luminometro attraverso l'intero spettro della luce visibile.

Analisi 5. I dati

1. Calcolare la lucciola: rapporto Renilla dividendo valori individuali di luciferasi di lucciola dai valori di Renilla luciferasi da ogni pozzetto.
2. Calcolare il fold change dividendo la lucciola: Renilla rapporto tra il trattato bene daquella del pozzo non trattato.

Risultati

Figura 1 confronta l'efficienza di trasfezione dei due reagenti di trasfezione in RAW264.7. Il reagente a base lipidica tipicamente dato circa il 25% tasso trasfezione mentre la trasfezione basata poliammina-proteina / portato in circa il 5% di efficienza (Figura 1A). La differenza in termini di efficienza di trasfezione è stata anche osservata in segnali luciferasi in cellule RAW264.7 trasfettate con il promotore giornalista pGL3-IκBζ (Figura 1B). L'aggiunta...

Discussione

Il protocollo qui descritto non si concentra esclusivamente sulla efficienza di trasfezione, ma ha lo scopo di trovare un equilibrio tra efficienza e la conservazione degli stati fisiologici delle cellule. In particolare, la nostra procedura riesce a ridurre al minimo la tossicità di reagente di trasfezione e massimizzare il segnale luciferasi.

Un passo critico nel protocollo è la salute delle cellule. Culture Overgrown non sono adatti per la trasfezione come loro cambiamenti fisiologia e ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Life Technologies	K210007	Any maxiprep kit will work
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Life Technologies	15593-049	Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container.
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	Warm in 37°C water bath before use.
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH30396.03	Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use.
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Warm to at least room temperature before use.
XtremeGene HP DBA transfection reagent	Roche	6366236001	Warm to room temperature before use.
GeneJuice	EMD Millipore	70967	Warm to room temperature before use.
5X Passive Lysis Buffer	Promega	E1941	30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910