ルシフェラーゼレポーター遺伝子でRAW264.7細胞をトランスフェクト

要約

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

要約

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency¹, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

概要

細胞中の核酸のトランスフェクションは、科学研究における多様な用途を有します。例としては、遺伝子発現をダウンレギュレートする遺伝子発現の異なる遺伝子エレメントの役割を研究するために、（2）タンパク質発現プラスミドを、目的のタンパク質を過剰発現し、（3）低分子干渉RNA（1）レポーター遺伝子を含みます。特定の遺伝子の発現レベルを操作すると、そのような操作の差動効果を測定することによって、研究者は、選択された生物学的系における遺伝子の機能を推定することができます。必ずしもすべてのトランスフェクション方法は、同じトランスフェクション効率を提供し、さらに同一のトランスフェクション法は^、1に等しく、すべての細胞型をトランスフェクトしません。従って、異なるトランスフェクション方法は、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン、カチオン性脂質トランスフェクション、カチオン性非脂質性ポリマートランスフェクション、エレクトロポレーション、およびヌクレオ^2,3として開発されてきました。

マクロファージへのトランスフェクションはESPEですによるマクロファージが（メチル化）DNA ⁴由来の細菌を含む異物に非常に敏感であるプロの食細胞であるという事実にインターネット上の下記URLで難しいです。外来DNAの導入は、サイトカインおよび一酸化窒素^5,6の産生をもたらすToll様受容体9（TLR9）経路を活性化します。これらの活性化マクロファージはその後、研究者が検討する予定治療にあまり応答することができます。

私たちの研究室では、日常的に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子とのRAW264.7マクロファージ細胞株をトランスフェクトし、我々は、バックグラウンドよりも有意に高いルシフェラーゼシグナルを有するのに十分な堅牢であるプロトコルを開発するだけでなく、それらの休止状態のままにするマクロファージのための十分な穏やかいます。トランスフェクトされた細胞の挙動をIκBζ（pGL3-IκBζ）のプロモーター領域を保有するホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子で評価しました。 IκBζ発現は、細菌の細胞壁成分のリップによってアップレギュレートされます^{opolyssacharide（LPS）7,8、}および抗炎症性サイトカインによって下方制御、インターロイキン^{10（IL-10）8。}井戸の中で、トランスフェクションの変動を考慮するために、我々は、正規化のためにウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ 例えば、phRL-TK）を含む対照プラスミドを同時トランスフェクト。記述されたプロトコルは、トランスフェクションのタイミング、トランスフェクション試薬の種類、トランスフェクション試薬のプラスミドDNAの量、ならびにプラスミドDNAのトランスフェクション試薬の比を含む種々のパラメータをテストした後に最適化されます。このプロトコルに含まれる2つのトランスフェクション試薬（1）脂質ベースのトランスフェクション試薬と、（2）タンパク質/ポリアミン系トランスフェクション試薬です。

プロトコル

1.プラスミドDNA精製

1. 製造業者のプロトコルに従ってマキシプレップキットを用いてプラスミドDNAを抽出します。 TE緩衝液500μl中に再懸濁プラスミドDNA。
2. クロロホルム：フェノールを実行イソアミルアルコール抽出およびイソプロパノール沈殿残留細菌の汚染物質を除去します。 LPSの存在は、トランスフェクション⁹に干渉する。
   1. プラスミドDNAを、15秒間激しく振る：クロロホルム：イソアミルアルコール（1、pHが8〜25：24）500μlのフェノールを加えます。フェノールは重篤な皮膚の薬傷の原因となり、重大な損傷があるまで火傷を常に感じていないように麻酔薬です。クロロホルム：フェノール行うドラフト中イソアミル抽出をし、注意してください。
3. RTで5分間混合物をインキュベートします。室温で10分間、13,000×gで遠心分離します。新しい1.5 mlのコレクションチューブに上部の水相の350μlのを転送します。
4. 下の有機相を含むチューブにTE緩衝液350μlのを追加。 15秒間激しく振ります。室温で5分間、13,000×gで遠心分離します。同じ1.5ミリリットルのコレクションチューブに上層の水相の350μlのを転送します。
5. 3M酢酸ナトリウム（pH5.2）の70μLを加え、よく混ぜます。 100％イソプロパノール700μlのを追加します。よく混ぜ、室温で10分間インキュベートします。 10 minat 4℃で13,000×gで遠心分離します。上清を取り除きます。
6. ペレットに75％エタノールを500μlを追加します。ボルテックスのサンプルを4℃で5分間、5,000×gで混合し、遠心分離します。上清を取り除きます。 DNAはペレットです。
7. チューブの蓋を開け、空気が5室温でペレットを乾燥さ - 10分。ペレットは半透明になるはずです。 DNAペレットを再懸濁するためにTE緩衝液500μlのを追加します。 DNAペレットを溶解する10分間60℃ - 50で加熱。
8. 分光計で260 nmの（A260）および280nm（A280）での吸光度を測定します。 50 ng /μLでによってA260の値を乗​​算することにより、DNAの濃度を計算します。 calculatinによるDNAの品質を評価G A260 / A280比。 2.0 - 高品質のDNAが1.8のA260 / A280比を与える必要があります。

2.細胞培養と播種

1. DMEM中で培養RAW264.7細胞を、37℃、5％CO ₂インキュベーター中で9％ウシ胎仔血清（DMEM / 9％FCS）を補充しました。各通過の間に、パスツールピペットを用いて連続ピペットでプレートから細胞を剥離。継代細胞2日ごと、および1.5シード - ストックとして10cmの組織培養処理皿に2万個の細胞を。 6週間 - すべての5個の新株を解凍します。
2. トランスフェクションの日に、DMEM / 9％FCSの500μlの容量で24ウェルプレートにウェル当たり200,000細胞を播種します。 37℃のインキュベーター内で4時間、細胞をインキュベートします。
3. いずれかの脂質ベースの試薬（ステップ3.1）、またはタンパク質/ポリアミン系試薬（ステップ3.2）で細胞をトランスフェクト。

3.トランスフェクション

1. 脂質ベースのトランスフェクション：
   1. トランスフェクションreagenウォームアップ暗所でRTに対するT。 37°Cまでの無血清培地およびDMEM / 9％FCSをウォームアップ。
   2. 1.5mlチューブに無血清培地のプラスミドDNA0.5μgの50μlを添加します。液体の表面下のピペットチップでトランスフェクション試薬の2μlを添加します。 6秒間ボルテックス。
   3. 室温で30分間、暗所での試薬/ DNA混合物を残します。
   4. 30分間のインキュベーションの間、ウェルから培地を除去し、各ウェルに新鮮なDMEM / 9％FCSの250μlを添加します。
   5. 30分後、試薬/ DNA混合物にDMEM / 9％FCSの250μlを添加します。ピペッティングによりよく混ぜます。
   6. 各ウェルに希釈した混合物の300μlを添加します。 37℃、5％CO ₂インキュベーター内で4時間2 -インキュベートします。
   7. トランスフェクション溶液を除去し、DMEM / 9％FCSの500μlを添加します。細胞刺激の前に37℃、5％CO ₂インキュベーター内で48時間- 24インキュベートします。
2. タンパク質/ポリアミンベースのトランスフェクション：
   1. ウォームアップ無血清培地と37℃のDMEMは/ 9％FCS。
   2. 無血清培地の18.75μlにトランスフェクション試薬の0.75μlを添加します。渦は簡単に混合します。室温で5分間インキュベートします。希釈されたトランスフェクトされた試薬に1μgの/μlのDNAの0.5μlを添加します。室温で10分間インキュベートします。
   3. 10分間のインキュベーションの間、24ウェルプレートの各ウェルから培地を除去し、各ウェルに250μlの新鮮なDMEM / 9％FCSを加えます。
   4. 10分後、試薬/ DNA混合物にDMEM / 9％FCSの250μlを添加します。
   5. ウェルに希釈した混合物の270μlを添加します。 4時間2 - 37℃、5％CO ₂インキュベーター中でインキュベートします。
   6. トランスフェクション溶液を除去し、DMEM / 9％FCSの500μlを添加します。 37℃、5％CO ₂インキュベーター中で48時間- 24インキュベートします。

4.細胞の刺激とルシフェラーゼアッセイ

1. 新鮮なDMEM / 9％FCS250μlのとよく内のメディアを交換してください。
2. LPSまたはLPS + ILの50μLを追加ウェルに所望の濃度で-10。 37℃、5％CO _{2のインキュベーター}にプレートを返します。 6時間 - 2のために刺激します。
3. 、吸引により刺激溶液を除去し、氷冷PBSで洗浄し、1×受動溶解緩衝液200μlを添加します。室温で30分間ロック。スクレイプ1.5 mlチューブに溶解物を移し、4℃で10分間20,000×gで遠心分離することにより細胞残屑を除去します。
4. 製造業者のプロトコルに従って、ルシフェラーゼシグナルの決意は白、透明底の96ウェルプレートへの転送清澄化ライセート（上清）の40μlのを。
5. 全可視光スペクトル全体のルミノメーターでルシフェラーゼシグナルを読みます。

5.データ解析

1. 各ウェルからのウミシイタケルシフェラーゼの値でホタルルシフェラーゼの個々の値を分割してウミシイタケ比：ホタルを計算します。
2. によって十分に治療のウミシイタケ比：ホタルを分割して倍の変化を計算未処理ウェルのこと。

結果

図1は、RAW264.7における2つのトランスフェクション試薬のトランスフェクション効率を比較します。タンパク質/ポリアミンベースのトランスフェクションは、約5％の効率（ 図1A）をもたらした脂質ベースの試薬 ​​は、典型的には約25％のトランスフェクション率を与えました。トランスフェクション効率の差ものpGL3-IκBζプロモーターレポーター（ 図1B）

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、単独でトランスフェクション効率に焦点を当てたが、細胞の生理的状態の効率と保全のバランスを取ることを目的としません。具体的には、私たちの手順は、トランスフェクション試薬の毒性を最小化し、ルシフェラーゼシグナルを最大化することに成功しています。

プロトコルにおける一つの重要なステップは、細胞の健康状態です。?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Life Technologies	K210007	Any maxiprep kit will work
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Life Technologies	15593-049	Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container.
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	Warm in 37°C water bath before use.
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH30396.03	Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use.
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Warm to at least room temperature before use.
XtremeGene HP DBA transfection reagent	Roche	6366236001	Warm to room temperature before use.
GeneJuice	EMD Millipore	70967	Warm to room temperature before use.
5X Passive Lysis Buffer	Promega	E1941	30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910