Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte

Özet

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Özet

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency¹, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Giriş

Hücrelerdeki nükleik asitlerin transfeksiyonu, bilimsel araştırma, çeşitli uygulama vardır. Örnekler (1) raportör genler, gen ekspresyonunda farklı gen elemanları rolünü incelemek için (2) protein ekspresyon plazmidleri ilgili proteini aşın ifade etmek üzere, (3) küçük bir müdahaleci RNA gen ifadesinin aşağı da içermektedir. Belirli genlerin ekspresyon seviyesi manipüle ve bu manipülasyonlar ayırıcı etkisini ölçerek, araştırmacılar, seçilen biyolojik sistemlerde gen işlevlerini ortaya çıkarabilir. Tüm transfeksiyon yöntemleri, aynı transfeksiyon verimliliği sağlar ve hatta aynı transfeksiyon yöntemi, aynı ¹ tüm hücre tiplerinin transfeksiyonu etmez. Bu nedenle, farklı transfeksiyon yöntemleri, kalsiyum fosfat yöntemi, DEAE dekstran, katyonik lipit transfeksiyon, katyonik olmayan lipit polimer, transfeksiyon, elektroporasyon ve nucleofection ^2,3 gibi geliştirilmiştir.

Makrofajlar içine Transfeksiyon bilhassa olduğunulikle zor dolayı makrofajlar (metıle) DNA ⁴ türetilen bakteriler de dahil olmak üzere yabancı maddelere karşı çok duyarlıdır profesyonel fagositler olmasından. Yabancı DNA'nın sokulması, sitokinler ve nitrik oksit ^5,6 üretimine yol açan Toll-benzeri reseptör 9 (TLR9) yolunun aktive eder. Bu aktive makrofajlar daha sonra araştırmacılar incelemek niyetinde tedaviye daha az duyarlı olabilir.

Bizim laboratuvar rutin lusiferaz raportör genleri ile RAW264.7 makrofaj hücre hattı transfects ve biz arka planda önemli ölçüde daha yüksek lusiferaz sinyal yeterince sağlam bir protokol geliştirdi, ancak makrofajlar istirahat durumuna kalması için yeterli de nazik var. Transfekte edilmiş hücrelerin davranışları IκBζ (pGL3- IκBζ) promoter bölgesini barındıran bir ateş böceği lusiferaz raportör geni ile değerlendirildi. IκBζ ekspresyonu, bakteriyel hücre duvarı bileşeni, dudak ile üst-düzenlenmektediropolyssacharide (LPS) ^7,8, ve anti-iltihabik sitokin ile baskılanmış, İnterlökin-10 (IL-10) ^8. Kuyular arasındaki transfeksiyon varyasyon hesaba katmak için, normalleştirme amacıyla Renilla lusiferaz gen (örn phRL-TK) ihtiva eden bir kontrol plasmidi-transfekte co. Açıklanan protokol DNA plazmid çeşitli transfeksiyon zamanlaması, transfeksiyon reaktifleri tipi, transfeksiyon reaktifleri ve plasmid DNA miktar dahil olmak üzere parametreler, hem de transfeksiyon reaktifi oranı test edildikten sonra optimize edilir. Bu protokolde yer alan iki transfeksiyon reaktifleri (1), bir lipid-bazlı transfeksiyon reaktifi ve (2) bir protein / poliamin bazlı transfeksiyon reaktifi bulunmaktadır.

Protokol

1. Plazmid DNA Saflaştırma

1. Üreticinin protokolüne göre bir maxiprep kiti kullanılarak plazmid DNA ekstrakte edin. TE tamponu, 500 | il yeniden süspanse plazma DNA.
2. Kloroform: Bir fenol gerçekleştirin izoamil alkol çıkarma ve izopropanol yağış kalan bakteri kirleri çıkarmak. LPS varlığı transfeksiyon ⁹ engeller.
   1. Plasmid DNA (1, pH 8: 25: 24) ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır izoamil alkol: kloroform: Fenol 500 ul ekle. Fenol Ciddi yanıklara neden olur ve ağır hasar olduğu kadar yanıklar hep hissettim değildir bu yüzden bir anestezik olduğunu. Davlumbaz izoamil çıkarma ve dikkatli kullanın: kloroform: fenol gerçekleştirin.
3. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı. Oda sıcaklığında, 10 dakika süreyle 13,000 x g'de santrifüjleyin. Yeni bir 1.5 ml'lik bir toplama tüpü içinde, üst sulu faz 350 ul aktarın.
4. Alt organik faz içeren tüp TE tamponu, 350 ul ekle. 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13,000 x g'de santrifüjleyin. Aynı 1.5 ml toplama tüpüne üst sulu faz 350 ul aktarın.
5. 3 M sodyum asetat (pH 5.2), 70 ul ilave edin ve iyice karıştırın. % 100 izopropanol, 700 ul ekle. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. 10 minat 4 ° C için 13.000 xg'de Santrifüj. Süpernatantı.
6. Pelet% 75 etanol içinde 500 ul ekle. Vorteks örnekler 4 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca 5,000 x g de karıştırılır ve santrifüjlenir için. Süpernatantı. DNA pelet olduğunu.
7. Tüpün kapağını açın ve hava 5 RT'de pelet kurulayın - 10 dk. Pelet saydam hale gelmelidir. DNA pelletini TE tamponu, 500 ul ekle. 50 ısı - 10 dakika süreyle 60 ° C'de DNA pelet çözülmesi için.
8. 260 nm (A260) ve bir spektrometre ile 280 nm (A280) absorbans ölçün. 50 ng / ul A260 değeri çarpılarak DNA konsantrasyonu hesaplayın. Calculatin DNA'nın kalitesini değerlendirmekg A260 / A280 oranı. 2.0 - yüksek kalite ile DNA 1.8 bir A260 / A280 oranı vermelidir.

2. Hücre Kültürleme ve Tohum

1. DMEM içinde kültür RAW264.7 hücreleri 37 ° C,% 5 _CO2 kuluçka makinesi içinde% 9 fetal dana serumu (DMEM /% 9 FCS) ile takviye edilmiştir. Her geçiş sırasında, bir Pasteur pipeti kullanarak sürekli pipetleme hücreleri plakadan ayırın. Passage hücreleri 2 günde, 1,5 tohum - stok olarak 10 cm doku kültürü tedavi yemeğin 2 milyon hücre. 6 hafta - hücrelerin her 5 yeni stok çözülme.
2. Transfeksiyondan bir gün, DMEM /% 9 FCS 500 ul bir hacim içinde, 24 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 200,000 hücre tohum. 37 ° C kuluçka makinesi içinde 4 saat inkübe hücreleri.
3. Transfect hücreleri ya da lipid bazlı tepkime maddesi (aşama 3.1) ya da protein / poliamin-bazlı tepkime maddesi (aşama 3.2).

3. Transfeksiyon

1. Lipid bazlı transfeksiyon:
   1. Transfeksiyon REAGEN Isınmat karanlıkta oda sıcaklığına kadar. Serum-barındırmayan ortam, DMEM /% 9 FCS, 37 ° C'ye kadar ısıtın.
   2. 1.5 ml bir tüp içinde, serum-içermeyen ortam içinde plasmid DNA, 0.5 ug ila 50 ul ekle. Sıvı yüzeyinin altında pipet ile transfeksiyon reaktifi 2 ul ekle. 6 saniye vorteksleyin.
   3. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta reaktif / DNA karışımı bırakın.
   4. 30 dakika inkübasyon sırasında, kuyudan ortamını çıkarın ve her bir oyuğa taze DMEM /% 9 FCS 250 ul ilave edin.
   5. 30 dakika sonra, reaktif / DNA karışımı, DMEM /% 9 FCS 250 ul ilave edin. Yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın.
   6. Her kuyu seyreltilmiş karışımın 300 ul ekleyin. 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatörü içinde 4 saat - 2 inkübe edin.
   7. Transfeksiyon çözüm çıkarın ve DMEM /% 9 FCS 500 ul ekleyin. Hücre uyarma önce 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatöründe 48 saat - 24 inkübe edin.
2. Protein / poliamin bazlı transfeksiyon:
   1. Isınma serum serbestorta ve 37 ° C'ye kadar, DMEM /% 9 FCS.
   2. Serum-barındırmayan ortam 18.75 ul transfeksiyon reaktifi 0.75 ul ekleyin. Vortex kısaca karıştırın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Seyreltilmiş transfekte reaktifi içine 1 ug / ul DNA 0.5 ul ekleyin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   3. 10 dakika inkübasyon sırasında, 24 oyuklu plakanın her bir mesafede ortamını çıkarın ve her bir oyuğa 250 ul taze DMEM /% 9 FCS ekleyin.
   4. 10 dakika sonra, reaktif / DNA karışımı halinde, DMEM /% 9 FCS 250 ul ilave edin.
   5. Oyuğuna seyreltildi karışımın 270 ul ekle. 4 saat - 2 37 ° C ve% 5 _CO2 inkübatörü içinde inkübe edilir.
   6. Transfeksiyon çözüm çıkarın ve DMEM /% 9 FCS 500 ul ekleyin. 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatöründe 48 saat - 24 inkübe edin.

4. Hücre Uyarım ve Lusiferaz Deneyi

1. Taze DMEM /% 9 FCS iyi 250 ul medya değiştirin.
2. 50 LPS'nin ul veya LPS + IL eklemeKuyusuna istenilen konsantrasyonlarda -10. 37 ° C'de,% 5 _CO2 kuluçka plaka dönün. 6 saat - 2 için uyarır.
3. , Aspirasyon yoluyla uyarma çözümü çıkarın buz PBS ile yıkayın ve 1x Pasif Lizis Tampon 200 ul ekleyin. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında sallayın. Pençe ve 1.5 ml tüpler lizat transferi ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüj uygulanarak hücre kalıntıları uzaklaştırılmıştır.
4. Aktarım, üreticinin protokolüne uygun olarak lusiferaz sinyallerin saptanması için beyaz, şeffaf dipli, 96 oyuklu plakaya temizlenir lizat (süpernatant) 40 ul.
5. Tüm görünür ışık spektrumu boyunca bir lüminometre ile lusiferaz sinyalini okuyun.

5. Veri Analizi

1. Her kuyudan Renilla lusiferaz değerlere göre ateşböceği lusiferaz bireysel değerleri bölerek Renilla oranı: firefly hesaplayın.
2. Tarafından iyi muamele ve Renilla oranı: firefly bölerek katlık değişime hesaplayınmuamele edilmemiş kuyunun bu.

Sonuçlar

Şekil 1, RAW264.7 iki transfeksiyon reaktifleri transfeksiyon verimini karşılaştırır. protein / poliamin bazlı transfeksiyon yaklaşık% 5 verim (Şekil 1A) ile sonuçlanırken, lipit bazlı reaktif tipik olarak yaklaşık% 25 transfeksiyon oranı vermiştir. Transfeksiyon etkinliğindeki farklılık pGL3-IκBζ promotör muhabir (Şekil 1B) ile transfekte RAW264.7 hücrelerde lusiferaz sinyaller gözlenmiştir. Bu transfekte edilmiş hücrelere LPS ilave ateşb?...

Tartışmalar

protokol sadece transfeksiyon verimliliği odaklanmak değil Burada anlatılan, ancak hücrelerin fizyolojik devletlerin verimlilik ve korunması arasında bir denge amaçlamaktadır. Özellikle, bizim prosedür transfeksiyon reaktif toksisitesini en aza indirmek ve lusiferaz sinyali maksimize başarır.

Protokolünde bir kritik adım hücrelerinin sağlıktır. Büyümüş kültürler fizyolojik değişiklikleri ve aynı zamanda ^{hücrelerin, 10} fenotip ve işlevini değiştirmek ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Life Technologies	K210007	Any maxiprep kit will work
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Life Technologies	15593-049	Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container.
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	Warm in 37°C water bath before use.
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH30396.03	Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use.
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Warm to at least room temperature before use.
XtremeGene HP DBA transfection reagent	Roche	6366236001	Warm to room temperature before use.
GeneJuice	EMD Millipore	70967	Warm to room temperature before use.
5X Passive Lysis Buffer	Promega	E1941	30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910