Трансфекции клеток RAW264.7 с люциферазы гена

Резюме

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Аннотация

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency¹, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Введение

Трансфекция нуклеиновых кислот в клетках имеет разнообразный применение в научных исследованиях. Примеры включают в себя (1) гены репортер изучить роль различных элементов гена в экспрессии генов, (2) экспрессии белка плазмиды что экспрессия белка интерес, и (3) малых интерферирующих РНК подавляют экспрессию генов. Путем манипулирования уровня экспрессии отдельных генов и измерения перепада эффект таких манипуляций, исследователи могут вывести генные функции в выбранных биологических системах. Не все методы трансфекции обеспечивают те же эффективности трансфекции, и даже тот же метод трансфекции не трансфекции клеток всех типов в равной степени ^1. Следовательно, различные методы трансфекции были разработаны такие как фосфат кальция методом, DEAE декстран, катионный липид трансфекции катионным, без липидов полимерной трансфекции, электропорации, и nucleofection ^2,3.

Трансфекции в макрофагов ESPEбенно трудно из-за того, что макрофаги профессиональные фагоциты, которые очень чувствительны к посторонних материалов, включая бактерии, полученных (метилированный) ДНК ^4. Введение чужеродной ДНК активирует Toll-подобный рецептор 9 (TLR9) путь, ведущий к продукции цитокинов и азотной окиси ^5,6. Эти активированные макрофаги могут затем быть менее чувствителен к лечению, что исследователи намерены изучить.

Наша лаборатория постоянно transfects в RAW264.7 линию макрофагов клеток с люциферазных генов-репортеров, и мы разработали протокол, который достаточно прочный, чтобы люциферазы сигнал значительно выше, чем фон, но и достаточно мягкий для макрофагов оставаться на их состоянии покоя. Поведение трансфицированных клеток оценивали с помощью светлячка-репортерного гена люциферазы, несущим промоторную область IκBζ (pGL3- IκBζ). Выражение IκBζ активируется бактериальной компонента клеточной стенки губыopolyssacharide (ЛПС) ^7,8, и подавляется в противовоспалительного цитокина, интерлейкин-10 (ИЛ-10) ^8. Для учета изменения трансфекции среди скважин, мы сотрудничаем трансфекции управления плазмиды, содержащей ген люциферазы Renilla (например, phRL-TK) для целей нормализации. Протокол, описанный оптимизирован после тестирования различных параметров, включая сроки трансфекции, типа реагентов трансфекции, количества реагентов трансфекции и плазмидной ДНК, а также соотношение реагента для трансфекции плазмидной ДНК. Два трансфекции реагенты, включенные в этот протокол: (1) на основе липидов трансфекции реагента и (2) белок / полиамин на основе реагента для трансфекции.

протокол

1. Очистка плазмидной ДНК

1. Извлечение ДНК плазмиды с использованием набора maxiprep в соответствии с протоколом производителя. Ресуспендируют плазмидной ДНК в 500 мкл ТЕ-буфера.
2. Выполните фенол: хлороформ: изоамиловый спиртовой экстракции и изопропанол осадков для удаления остаточных загрязняющих веществ бактериальных. Наличие LPS препятствует трансфекции ^9.
   1. Добавить 500 мкл фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1, рН 8) с плазмидной ДНК и энергично встряхивают в течение 15 сек. Фенол вызывает ожоги кожи и обезболивающее, так ожоги не всегда чувствовал, пока не серьезный ущерб. Выполните фенол: извлечение изоамиловый в вытяжном шкафу и соблюдайте осторожность: хлороформ.
3. Выдержите смесь в течение 5 мин при комнатной температуре. Центрифуга при 13000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Передача 350 мкл верхней водной фазы в новую 1,5 мл пробирку.
4. Добавить 350 мкл ТЕ-буфера в пробирку, которая содержит нижнюю органическую фазу, Встряхивать в течение 15 сек. Центрифуга при 13000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Передача 350 мкл верхней водной фазы в той же 1,5 мл пробирку.
5. Добавить 70 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и хорошо перемешать. Добавить 700 мкл 100% изопропанола. Все хорошо перемешать и инкубировать 10 мин при комнатной температуре. Центрифуга при 13000 мкг в течение 10 MiNaT 4 ° C. Удалить супернатант.
6. Добавить 500 мкл 75% этанола в гранулах. Образцы перемешивают, чтобы смешивать и центрифуге при 5000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант. ДНК в осадке.
7. Открыть крышку пробирки и просушить на воздухе осадок при КТ в течение 5 - 10 мин. Осадок должен стать прозрачным. Добавить 500 мкл ТЕ-буфера для ресуспендирования осадка ДНК. Нагревают при 50 - 60 ° С в течение 10 мин, чтобы растворить осадок ДНК.
8. Измеряют поглощение при 260 нм (А260) и 280 нм (А280) с помощью спектрометра. Рассчитать концентрацию ДНК путем умножения значения A260 от 50 нг / мкл. Оценить качество ДНК calculatinг отношение А260 / А280. ДНК с высоким качеством должен дать соотношение A260 / A280 1,8 - 2,0.

2. культивирования клеток и посев

1. Культура RAW264.7 клетки в DMEM с добавлением 9% фетальной телячьей сыворотки (DMEM / 9% FCS) в 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе. Во время каждого прохода, открепления клеток от пластины непрерывным отбором с использованием пипетки Пастера. Прохождение клетки каждые 2 дня, и семя 1,5 - 2 миллионов клеток на 10 см для культуры ткани, обработанной блюдо как акции. Оттепель новый запас клеток каждые 5 - 6 недель.
2. В день трансфекции, семена 200000 клеток на лунку в 24-луночного планшета в объеме 500 мкл DMEM / 9% FCS. Инкубируйте клетки в течение 4 ч в 37 ° C инкубаторе.
3. Трансфекции клетки либо с липидной основе реагента (шаг 3.1) или белок / полиамин на основе реагента (шаг 3.2).

3. Трансфекция

1. На основе липидов трансфекции:
   1. Разминка трансфекции ReageNт до комнатной температуры в темноте. Разминка бессывороточной среды DMEM и / 9% ФТС до 37 ° C.
   2. Добавить 0,5 мкг плазмидной ДНК в 50 мкл бессывороточной среды в 1,5 мл пробирку. Добавьте 2 мкл реагента для трансфекции с кончика пипетки ниже поверхности жидкости. Вихрь в течение 6 сек.
   3. Оставьте смесь реагентов / ДНК в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин.
   4. Во время 30-минутной инкубации, извлеките носитель из колодца и добавить 250 мкл свежей DMEM / 9% FCS в каждую лунку.
   5. Через 30 мин добавляют 250 мкл DMEM / 9% FCS к смеси реагент / ДНК. Все хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
   6. Добавить 300 мкл разбавленной смеси в каждую лунку. Выдержите в течение 2 - 4 часов в 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе.
   7. Удалить трансфекции решение и добавить 500 мкл DMEM / 9% FCS. Инкубировать в течение 24 - 48 ч в 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе до стимуляции клеток.
2. Белок / полиамин на основе трансфекции:
   1. Разминка бессывороточнаясредний и DMEM / 9% FCS до 37 ° С.
   2. Добавить 0,75 мкл реагента для трансфекции 18,75 мкл бессывороточной среды. Кратко Vortex перемешать. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить 0,5 мкл 1 мкг / мкл ДНК в разбавленном трансфицированных реагента. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
   3. В 10-минутной инкубации, удалить носитель из каждой лунки 24-луночного планшета и добавить 250 мкл свежей DMEM / 9% FCS в каждую лунку.
   4. Через 10 мин добавляют 250 мкл DMEM / 9% FCS в смеси реагентов / ДНК.
   5. Добавить 270 мкл разбавленной смеси в скважине. Выдержите в 37 ° С и 5% СО ₂ инкубатора для 2 - 4 ч.
   6. Удалить трансфекции решение и добавить 500 мкл DMEM / 9% FCS. Выдержите в течение 24 - 48 часов в 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе.

4. Стимулирование и сотовый анализа люциферазы

1. Замените СМИ в хорошо 250 мкл свежей DMEM / 9% FCS.
2. Добавить 50 мкл LPS LPS или IL +-10 В требуемых концентрациях до колодца. Возвращение пластины в 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе. Стимулируют для 2 - 6 ч.
3. Удалить стимуляции решение стремлением, промыть холодной ледяной PBS и добавьте 200 мкл 1x Пассивный лизирующего буфера. Rock при комнатной температуре в течение 30 мин. Собрать и передачи лизат в 1,5 мл пробирки и удалить клеточного дебриса путем центрифугирования при 20000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
4. Передача 40 мкл очищенного лизата (надосадочной) в белом, прозрачным дном 96-луночного планшета для определения люциферазы сигналов в соответствии с протоколом производителя.
5. Читайте люциферазы сигнал с люминометре по всей видимом спектре света.

5. Анализ данных

1. Рассчитывают соотношение светлячка: Renilla путем деления отдельные значения люциферазы светлячка значениями Renilla люциферазы из каждой лунки.
2. Рассчитайте изменение раза путем деления светлячка: Renilla соотношение лечить хорошочто необработанной скважины.

Результаты

Рисунок 1 сравнивает эффективность трансфекции двух реагентов трансфекции в RAW264.7. На основе липидов реагент обычно дает около 25%, а скорость трансфекции белка / полиамин на основе трансфекции в результате около 5% эффективности (фиг.1А). Разница в эффективности трансфе?...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, не только сосредоточиться на эффективности трансфекции, но стремится найти баланс между эффективностью и сохранения физиологических состояний клеток. В частности, наша процедура удается свести к минимуму токсичность трансфекции реагента и максимизации лю?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Life Technologies	K210007	Any maxiprep kit will work
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Life Technologies	15593-049	Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container.
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal bovine serum	Thermo Scientific	SH30396.03	Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use.
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Warm to at least room temperature before use.
XtremeGene HP DBA transfection reagent	Roche	6366236001	Warm to room temperature before use.
GeneJuice	EMD Millipore	70967	Warm to room temperature before use.
5x Passive Lysis Buffer	Promega	E1941	30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910