Molecular Sonda Optimización para determinar la mortalidad celular en una fotosintética Organismo (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Usando citometría de flujo

Resumen

Las poblaciones microbianas contienen heterogeneidad celular sustancial, que puede dictar el comportamiento general. Análisis de la sonda molecular a través de citometría de flujo puede determinar estados fisiológicos de las células, sin embargo su aplicación varía entre las especies. Este estudio proporciona un protocolo para determinar con precisión la mortalidad celular dentro de una población cianobacteria, sin menospreciar o grabación de resultados falsos positivos.

Resumen

Subpoblaciones microbianos en los estudios de campo y de laboratorio se ha demostrado que mostrar una alta heterogeneidad en los parámetros morfológicos y fisiológicos. Determinar el estado en tiempo real de una célula microbiana va más allá de las categorías vivos o muertos, como los microbios pueden existir en un estado latente, en el que la división celular y las actividades metabólicas se reducen. Teniendo en cuenta la necesidad de detección y cuantificación de los microbios, citometría de flujo (FCM) con sondas moleculares proporciona un método rápido y preciso para ayudar a determinar la viabilidad global de la población. Mediante el uso de SYTOX verde y SYTOX naranja en el modelo de cianobacterias Microcystis aeruginosa para detectar la integridad de membrana, desarrollamos un método transferible para la indicación rápida de la mortalidad de células individuales. Las sondas moleculares utilizados en esta revista se hará referencia a sondas de ácido nucleico como verde o naranja, respectivamente (aunque hay otros productos con longitudes de onda de excitación y emisión similares que tienen unos modos comparables de action, nos referimos específicamente a la palestra mencionó sondas). Protocolos utilizando sondas moleculares varían entre especies, que difieren principalmente en la concentración y el tiempo de incubación. Siguiendo este protocolo establecido en M. aeruginosa la sonda de ácido nucleico verde se optimizó en concentraciones de 0,5 M después de 30 minutos de incubación y la sonda de ácido nucleico naranja en 1 M después de 10 min. En ambas sondas concentraciones inferiores a la óptima indicado conducido a un bajo notificación de células con daño de la membrana. Por el contrario, 5 M concentraciones y superior en ambas sondas mostraron un tipo de tinción no específica, mediante el cual las células 'en vivo' producen una fluorescencia de destino, lo que lleva a una representación más del número de células "no viables". Los controles positivos (con el calor mató), siempre biomasa muerta comprobable, aunque la adecuación de la generación de control sigue siendo objeto de debate. Al demostrar una secuencia lógica de pasos para la optimización de las sondas de ácido nucleico verde y naranja de nosotrosmonstrate cómo crear un protocolo que se puede utilizar para analizar el estado fisiológico de cianobacterias con eficacia.

Introducción

La célula es un sistema complejo, que responde constantemente con el medio ambiente mediante la modificación de parámetros fisiológicos y alterar su función. La dinámica poblacional de las poblaciones microbianas isogénicas tanto en la naturaleza y el laboratorio se ven afectados por el desarrollo de las subpoblaciones, ocurriendo incluso en relativamente constantes las condiciones ambientales ^{1 - 3.} La variabilidad de las comunidades microbianas naturales surge debido a la naturaleza altamente variable de condiciones ambientales. Estos procesos estocásticos veces posteriormente producen subpoblaciones que son muy diferentes a la media de la población. La evidencia reciente ha revelado que estas subpoblaciones fisiológicos responden de manera diferente a las condiciones ambientales y pueden producir compuestos de señal o inhibidores que afectan e influyen en el ^3,4 de la población general de forma espectacular.

El establecimiento de un método para definir la heterogeneidad dentro de una población es clave para la ONUcomprensión de la ecología de microbios en distintos ambientes y es esencial en la construcción de conocimiento de cianobacterias molestia, como la Microcystis tóxico, lo que afecta en gran medida de la seguridad del agua humana. Especies como Anabaena mostrar la heterogeneidad morfológica en respuesta a las fluctuaciones ambientales, el desarrollo de las células especializadas como heterocistos y acinetas ^2. En contraste, las células Microcystis no se muestran heterogeneidad morfológica evidente durante una respuesta de estrés. La discriminación entre células viables y no viables es el aspecto más importante de la diferenciación fisiológica y permite una mejor comprensión de la dinámica de la población microbiana. Sin embargo, el problema conceptual de la viabilidad bacteriana en sí sigue siendo difícil y mal caracterizado ^1,5,6.

La citometría de flujo (FCM) es un método fiable y rápida de analizar las células individuales. Para aumentar la comprensión de la única fisio celularlogía a través de FCM, sondas moleculares se han utilizado para distinguir una serie de procesos metabólicos y bioquímicos ^7. Esto ha llevado a un mayor conocimiento de las especies a nivel celular y la población y, a su vez ayudó a la gestión de los recursos hídricos ^8,9. Sin embargo, los organismos difieren en cuanto a la captación de la sonda molecular y flujo de salida debido a los poros y las bombas en las paredes celulares y membranas, que han conducido a una serie de diseño de la sonda molecular y la aplicación del protocolo ^6,10,11. Sondas moleculares disponibles para propósitos comerciales y de investigación se suministran a menudo con un protocolo genérico que puede ser aplicable a un tipo de célula muy diferente. Hay que ser muy prudente en la transferencia de los protocolos desarrollados para un tipo de célula a otro ^6, por lo tanto, es una tarea esencial para optimizar sondas moleculares con eficacia antes de su uso.

Las sondas de ácido nucleico verde y naranja se unen a los dos ácidos nucleicos de cadena dobles e individuales con la base mínima seleccioneivity y se utilizan para evaluar la integridad de la membrana plasmática de las células. La sonda de ácido nucleico verde tiene una señal de fluorescencia etiquetado celular notablemente mejorado en comparación con otras sondas moleculares, tales como compuestos a base de yoduro de propidio ^{12, que} también puede actuar como un indicador de la viabilidad celular. El término "viabilidad celular 'aquí presupone que la degradación del ADN se produce después de la pérdida de la integridad de la membrana plasmática. Las sondas de ácidos nucleicos son tintes de cianina asimétrica con tres cargas positivas y no pueden entrar en las células con membranas intactas bajo concentraciones caracterizadas, en ambas eucariotas y procariotas ^{14,15 11,13} organismos. La unión de una sonda de ácido nucleico a los ácidos nucleicos puede resultar en un aumento de hasta tapa> 500 de emisiones de fluorescencia a partir de señales endógenas en las células que tienen su integridad de la membrana comprometida. Aunque sondas moleculares, tales como la sonda de ácido nucleico verde puede ser un buen indicador de la fisiología de células individuales, hay una necesidad de to optimizar cada sonda con el organismo objetivo pretendido, como los tiempos de incubación han variado de 7 min - 30 min y rangos de concentración de 0,1 M - 0,5 M en experimentos Microcystis solo ^{15 - 19.}

Aquí se presenta un protocolo para optimizar los ensayos de citometría de verde y las relativamente nuevas sondas de ácidos nucleicos naranja (que hasta la fecha no ha probado en las especies de cianobacterias M. aeruginosa). La siguiente metodología desarrollada puede entonces ser transferido a otras especies y se utiliza como una plataforma para la optimización de protocolos en otras sondas moleculares, aumentando con ello la comprensión de los microbios y su comportamiento ecológico.

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Protocolo

1. Preparación de la sonda Molecular y citómetro de flujo

1. Diluir las soluciones madre de las sondas de ácido nucleico, que se suministran en forma de solución 5 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) a alícuotas de las concentraciones requeridas en ultrapura filtrada _H2O
2. Guarde las sondas de ácido nucleico en condiciones de oscuridad entre -5 ^{° C y} - 25 ^{° C} hasta su uso.
3. Encienda el citómetro de flujo y el paquete de software de carga (ver tabla de Materiales / Equipo para especificaciones FCM).
4. Coloque un tubo de hemólisis vacía (12 x 75 mm) en la sonda de inyección de muestra (SIP), haga clic en destapar y luego de vuelta al ras para iniciar el proceso de limpieza FCM.
   NOTA: Algunas etapas de la muestra para el SIP puede acomodar varios tipos de tubos, incluyendo tubos de microcentrífuga. El diluyente de la sonda y la vaina de fluido molecular utilizado en el aparato FCM es de una calidad analítica "tipo 1" 0,22 micras membrana fuente filtrada.
5. Lugarun tubo de hemólisis fresca con 2 ml de ultrapura H _{2 O} filtrada en la SIP, establece un límite de tiempo para el 10 - 15 min y una velocidad de fluido a ayunar (o un caudal de> 66 l / min).
6. Seleccione una nueva celda de datos, se puso umbrales relevantes para fluorescencia y canales de dispersión de luz para reducir el ruido de fondo y haga clic en "Ejecutar".
7. Si los eventos totales por segundo no están por debajo de la recomendación de los fabricantes, a continuación, ejecutar una muestra de 2 ml de solución descontaminante durante 2 minutos en el rápido y luego repita los pasos 1.4 y 1.5.
   NOTA: Por favor, consulte las recomendaciones del fabricante para la FCM puesta en marcha de protocolos de limpieza, ya que pueden variar entre modelos. Pruebas de umbrales específicos también tiene que estar en línea con el modelo FCM como algunos equipos permite al usuario aplicar voltajes ganancias a los tubos fotomultiplicadores (PMT) mejorando o disminuyendo la señal eléctrica registrada por los detectores ópticos. El modelo utilizado en este FCM experición ha fijado PMT tensión y se utiliza un umbral de 80.000 dispersión frontal de luz (FSC-H) para excluir partículas menores de 2.0 micras y ruido electrónico.

2. Preparación de las Culturas y recuento de células iniciales

1. Autoclave 98 ml de ultrapura filtrada H ₂ O y 2 ml de medio de algas (concentración x50) en un vaso de 250 ml durante 20 minutos a 120 ^{° C}
2. Desde un monocultivo inicial de M. aeruginosa (PCC 7806) en un lugar de alta densidad constante estado 2 ml de la muestra en un tubo debajo de la SIP. Desglosar cualquier formación de colonias por agitación o sonicación ²⁰ y confirme células uniformemente dispersadas a través de microscopía de luz.
   NOTA: La exposición excesiva a las ondas ultrasónicas puede conducir a la lisis celular y debe usarse con precaución. Desde sonicación puede colapsar vesículas de gas (como se encuentra en especies como M. aeruginosa) salidas como la luz de dispersión lateral (SSC-H) intensidad puede ser más en sínsitive.
3. Dentro del software FCM, seleccionar un histograma para registrar los datos de dispersión de la luz hacia adelante (FSC-H) y configurar las especificaciones de la trama haciendo clic en "log" para ver en una escala logarítmica en el eje.
4. En una salida independiente, seleccione otro histograma (log eje) para registrar la fluorescencia natural como la ficocianina accesorio pigmento fotosintético (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), que se encuentra en M. aeruginosa.
5. Utilice una fuente de luz que puede excitar ficocianina y un detector que puede filtrar las emisiones de la fluorescencia resultante.
   NOTA: pigmento fotosintético como la clorofila puede ser excitado con el comúnmente utilizado 488 nm láser azul, mientras que la ficocianina se excita más de 600 nm y sólo se detecta con una fuente de luz roja ^21. Consulte con el fabricante citómetros de flujo para fuentes de luz de excitación y los espectros de detectores de emisión, aquí tanto un 488 nm y un láser de 640 nm se utiliza junto con unaun filtro óptico de 675 nm ± 12,5.
6. Para la grabación de los selectos configuración más alta resolución más cercanos al tamaño del núcleo del organismo objetivo (10 micras) y un caudal relativamente lento (14 l / min).
   NOTA: Para obtener los mejores muestras resolución debe ejecutarse de acuerdo con las manufacturas recomendación de eventos por segundo.
7. Antes de la adquisición de datos utilizan un umbral de puerta de la luz de dispersión y / o señales de fluorescencia que son causadas por el ruido de fondo electrónica o escombros muestra celular.
8. Seleccione una nueva celda de datos, cree una parcela densidad con parámetros SSC-H FSC-H y en una escala logarítmica y en Ejecutar.
9. Si la densidad de la muestra lleva a una tasa de eventos excesivo, pasos de dilución se pueden tomar para aumentar la exactitud y precisión.
10. En la parcela de densidad aplicar puertas de software desde el histograma anterior para excluir señales de dispersión de nivel bajo, producidas por el ruido de fondo o desechos (FSC <320.000). A la inversa puerta de la mayor fluorescencia relativaseñales ficocianina de células y sólo incluyen estos eventos (FL4, 56000 - 1.950.000).
11. Utilice el número de células registradas en las zonas cerradas y se divide por el volumen total de la muestra que ha pasado a través de la FCM, de averiguar cómo muchas células por ml.
    NOTA: El modelo FCM usada aquí tiene un sistema de bomba peristáltica controlada por microprocesador que permite un volumen de muestra que se determine. Otros equipos FCM puede requerir una suspensión de perlas calibrado o un cálculo de H ₂ diferencias de peso O / volumen para verificar el volumen total de la muestra.
12. Añadir el volumen necesario de las células a los medios recién preparados con el fin de iniciar un ciclo de crecimiento por lotes (250.000 células / ml) de M. aeruginosa.
    NOTA: Las especies difieren en las tasas de crecimiento en función de sus parámetros de entorno in situ y la disponibilidad de nutrientes, por lo que un ciclo de lote debe ser pre-registrado para determinar las fases del ciclo de vida.

3. Optimzación de Molecular Probe captación celular

1. Medio de la cosecha de la cultura M. aeruginosa preparado en el paso 2 desde una fase exponencial y utilizar como un control "en vivo".
   Nota: Las muestras diluidas partir de un cultivo de alta densidad directamente a una fase exponencial pueden afectar los resultados de optimización a través de la renovación celular muerto, en comparación con la de los cultivos inoculados a partir de una fase inicial lag / inducción.
2. Preparar la otra mitad como control "muerto" mediante el uso de métodos tales como etanol 70%, las muestras de calefacción a 60 ^{° C durante} 1 hr, paraformaldehído o 4% de formaldehído durante 30 min ^6,11,22. Compruebe variaciones en el microambiente muestras (por ejemplo., Ph).
   NOTA: El,, control positivo muertos por calor "muerto" en M. aeruginosa se ​​distingue de una muestra "en vivo" a través de su disminución en señales ficocianina. Inducir la mortalidad por otros métodos no puede causar la misma salida y Vary en especie.
3. Establecer muestras mixtas utilizando diferentes proporciones de "en vivo" y las muestras de 'muertos' (por ejemplo, 0%, 25%, 50%, 100%).
4. Desglosar la formación de colonias por agitación o sonicación y comprobar el pH.
5. Seleccionar un láser de 488 nm junto con detectores que pueden registrar la fluorescencia de la verde (FL1, 530 ± 15 nm) y naranja (FL2, 585 ± 20 nm) sondas de ácido nucleico y el láser 640 nm para grabar señales de ficocianina través de su respectivo detector.
   NOTA: Cuando se une al ADN, la sonda de ácido nucleico verde tiene una longitud de onda de excitación de fluorescencia aproximada de 504 nm y máximos de emisión de 523 nm, mientras que la sonda de ácido nucleico naranja tiene una longitud de onda de excitación de 547 nm y las emisiones máximas de 570 nm. Un ion argón láser de estado sólido 488 nm se puede emplear para excitar ambas sondas moleculares, sin embargo, un láser verde (547 nm hasta) producirá una fluorescencia naranja superior.
6. Como punto de partida, la introducción de lasonda molecular con los fabricantes recomienda la concentración a la cultura "muerta" 50% "en vivo" y el 50% y se incuba en la oscuridad.
7. Seleccione una nueva celda de datos, coloque la muestra bajo el SIP con umbrales y disparadores que reduzcan el ruido de fondo (FSC-H 80000).
8. Crear una parcela densidad con parámetros SSC-H FSC-H y, y tres histogramas. Un histograma utilizando la sonda molecular canal detector óptico respectivo (FL1 o 2), uno para detectar las emisiones de ficocianina (FL4-H) y el otro FSC-H, todo en una escala logarítmica.
9. Incubar las muestras de M. aeruginosa con las sondas de ácido nucleico en la oscuridad durante hasta 60 min, la grabación en las células de datos separados, en un número de puntos de tiempo (1, 5, 10, 15, 30 y 60 min).
   NOTA: Al ajustar parámetros como la verificación de pH con fabrica para las reacciones potenciales de ciertos productos químicos (por el ácido nucleico probado sondas un buffer no puede contener fosfatos o altos niveles de monovalente o divacationes prestados, como la unión con el ADN se reducirá).
10. Aplique una puerta software para incluir sólo el histograma FSC-H (320.000 - 1.500.000) para el objetivo organismos tamaño de la celda, en la respectiva sonda de fluorescencia canal histograma.
    NOTA: Las concentraciones utilizadas en este protocolo fueron 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 y 100 mM, que pueden ser alterados por ya sea aumentando o disminuyendo el volumen de la muestra M. aeruginosa o solución madre inicial de sondas nucleicos.
11. En el canal de la sonda de fluorescencia, aplique otra puerta software incluido con el pico más alto en el histograma (verde FL1-H, 240.000 - 1.650.000, naranja FL2-H, 30000 - 165000) y, posteriormente, puerta que la sonda positiva de fluorescencia en la trama de densidad.
12. Ejecutar los pasos 3.1 a 3.11, con, 100% y todas las muestras de cultivo mixtos "muertas" 100% "en vivo", el ajuste de las concentraciones de sondas moleculares (por ejemplo x 0.1 x 10 a) y / o la temperatura y los niveles de pH de ser necesario.
13. Comparar el número de señales de fluorescencia sonda molecular positivos a la densidad celular original de células muertas "(tomado de la mitad del total FSC-H o un cultivo de 100%" muerto ") para encontrar el porcentaje total de células teñidas con el ácido nucleico sondas.
14. Haga esto para cada período de tiempo dentro de cada concentración para encontrar el protocolo óptimo para el mayor porcentaje de nucleico celular sonda de absorción sin producir tinción no específica (utilice los medios en un ANOVA de un factor o Prueba de Kruskal-Wallis, si los datos son no paramétrico).

4. Molecular sonda de fluorescencia Discriminación

1. Para la prueba de fluorescencia interferencia / superposición de tinción celular intrínseca o no específica seleccionar los datos de cultivo de 50% 'en vivo' y el 50% 'muertas' mezclados y quitar todas las puertas.
2. Aplique una puerta software para incluir sólo el histograma FSC-H (320.000 - 1.500.000) para el objetivo Microorganismos tamaño de la celda, en la ficocianinahistograma canal.
3. Puerta de la cumbre más alta ficocianina y etiqueta como "en vivo", con la adición del pico más bajo etiquetado como "muerto".
4. Realizar un paso más en la puerta de canal respectivo histograma de fluorescencia de la sonda molecular, utilizando uno a la vez, el "en vivo" y, a continuación ficocianina "muerto" (FL4) señales, registrando ambas longitudes de onda medias.
   NOTA: El modo para inducir la mortalidad en este experimento se llevó a cabo por tratamiento térmico, que bajo este protocolo disminuye claramente señales ficocianina. Otros métodos de producción de las poblaciones de células muertas pueden producir diferentes resultados en las carreras adquiridos.
5. Relación de las longitudes de onda media de la fluorescencia positiva molecular sonda ("muerto") y la señal intrínseca / no específica ("en vivo") para determinar la sensibilidad de protocolo.
   NOTA: Para mejorar la discriminación de fluorescencia de "en vivo" y Población "muerto"ciones, aumentan la fuente de carbono a la absorción de la mancha activa en las células de nutrientes agotados o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para mejorar la permeabilidad de la pared celular y señales de ⁶ fluorescencia resultante. Compensación limitada en algunos modelos FCM para solapamiento espectral se puede realizar mediante la corrección pairwise-manipulado usuario durante la adquisición de la muestra (cambios de voltaje PMT) o de software especializado post-analítica.
6. Seleccione el protocolo optimizado, donde la mayor cantidad de células muertas '' se ha manchado sin la ocurrencia de tinción no específica. Si un número de prueba tiene resultados similares aceptar el protocolo con la concentración y el tiempo de incubación más bajo, junto con una buena discriminación de la señal de fluorescencia. Siga las instrucciones del fabricante para el procedimiento de apagado citómetro.

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Resultados

Dispersión frontal de luz (FSC) y salidas de luz lateral de dispersión (SSC) a partir de un cultivo discontinuo M. aeruginosa en fase exponencial proporciona información sobre el tamaño celular (diámetro) y granularidad interna, respectivamente (Figura 1). FSC puede discriminar las células que son demasiado grandes y / o pequeños para ser M. aeruginosa. Esta discriminación o compuerta se puede hacer mediante los datos de refinación entre determ...

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Discusión

El aumento del número de publicaciones utilizando sondas moleculares indican que los datos fiables e informativas se pueden obtener ^{5,6,8 - 15,19,22,23.} Hasta el momento no hay ninguna mancha perfecta para la viabilidad celular que puede ser eficaz en todas las especies con la misma concentración y tiempo de incubación ^6,10. Incluso el mismo tipo de sonda con emisiones de fluorescencia alteradas muestra una necesidad de establecer la concentración y tiempo de incubación c...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid	BD Biosciences	653155	Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min.  Followed by 2 min of sheath H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	by request	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO