Молекулярная зонд Оптимизация для определения клеток смертности в фотосинтезирующих организмов (<em&gt; Microcystis палочки</em&gt;), Используя проточной цитометрии

Резюме

Микробные популяции содержат значительное гетерогенность клеток, которые могут диктовать общее поведение. Анализ молекулярной зонд через проточной цитометрии можно определить физиологические состояния клеток, однако его применение зависит от вида. Это исследование обеспечивает протокол точно определить сотовый смертности в популяции цианобактерии, не преуменьшая или записи ложные положительные результаты.

Аннотация

Микробные субпопуляции в полевых и лабораторных исследований было показано, проявлять высокую неоднородность в морфологических и физиологических параметров. Определение в реальном времени состояния микробной клетке выходит за пределы живые или мертвые категорий, как микробы могут существовать в неактивном состоянии, в котором деление клеток и метаболические активности уменьшаются. Учитывая необходимость выявления и количественного определения микробов, проточной цитометрии (FCM) с молекулярными зондами обеспечивает быстрое и точный метод для определения общей жизнеспособности населения. При использовании Sytox зеленый и оранжевый Sytox в модельном цианобактерий Microcystis палочка для обнаружения целостности мембраны, мы разрабатываем передаче метод для быстрого указанием смертности одного элемента. Молекулярные зонды, используемые в этом журнале будет называться зеленым или оранжевым зондов нуклеиновых кислот соответственно (хотя существуют и другие продукты, обладающие аналогичными возбуждения и излучения длин волн, которые имеют сравнимую режимы Actioп, мы специально относятся к выше упомянутых зондов). Протоколы, использующие молекулярных зондов варьироваться между видами, отличаясь в основном в концентрации и инкубационных раз. После этого протокола, установленного на M.aeruginosa зеленый зонд нуклеиновой кислоты была оптимизирована при концентрации 0,5 мкМ после 30 мин инкубации и оранжевой зондом нуклеиновой кислоты в концентрации 1 мкМ, после 10 мин. В обоих зондов концентрации менее, чем указано оптимального привело к отчетности в соответствии с клеток с повреждением мембран. Наоборот, 5 мкМ концентрации и выше в обоих зондов выставлены тип неспецифической окрашивания, в результате чего "живые" клетки, полученные целевой флуоресценции, что приводит к более представления "нежизнеспособных" количества клеток. Положительные контроли (тепловые убитых) при условии, проверяемые мертвую биомассу, хотя целесообразность выработки управления остается предметом обсуждения. Демонстрируя логическую последовательность шагов для оптимизации зеленый и оранжевый зондов нуклеиновых кислот мы, деmonstrate как создать протокол, который может быть использован для эффективного анализа цианобактерий физиологическое состояние.

Введение

Ячейка представляет собой сложную систему, которая постоянно реагирует на окружающую среду, изменяя физиологические параметры и изменения ее функции. Динамика численности населения изогенных микробных как в природе, и лабораторных зависят от развития субпопуляций, происходящих даже в относительно постоянных условиях окружающей среды ^{1 - 3.} Изменчивость природных микробных сообществ возникает из-за весьма переменной природе условий окружающей среды. Эти иногда стохастические процессы впоследствии производить субпопуляции, которые очень отличаются в среднем населения. Последние данные показали, что эти физиологические субпопуляции по-разному реагируют на условия окружающей среды и может производить соединения сигнальных или ингибиторы, которые существенно повлиять и влияют на общее ^3,4 населения.

Создание метода для определения неоднородность в популяции является ключом к ООНderstanding экологию микробов в различных средах и имеет важное значение при создании знания ложных цианобактерий, например, токсического Microcystis, который воздействует в основном на безопасности человека воды. видов, таких как Anabaena отображения морфологическую неоднородность в ответ изменений окружающей среды, разработки специализированных клеток, таких как heterocysts и akinetes ^2. В отличие от этого, Microcystis клетки не проявляют очевидную неоднородность морфологического во время стрессовой реакции. Различение жизнеспособных и нежизнеспособных клеток является наиболее важным аспектом физиологической дифференциации и позволяет лучше понять динамику микробных популяций. Однако, концептуальная проблема самой бактериальной жизнеспособности остается сложной и плохо характеризуется ^1,5,6.

Проточная цитометрия (FCM) является надежным и быстрым методом анализа отдельных клеток. Для более глубокого понимания одного физио клетоктупой через FCM, молекулярных зондов были использованы, чтобы отличить ряд метаболических и биохимических процессов ^7. Это привело к увеличению знания о видах на клеточном и населения уровне и, в свою очередь помогло управление водными ресурсами ^8,9. Однако, организмы отличаются по молекулярной поглощения зонда и оттока из-за поры и насосов в клеточных стенок и мембран, которые привели к ряду молекулярного дизайна зонда и реализации протокола ^6,10,11. Молекулярные зонды доступны для коммерческих и научных целей часто поставляются с общим протоколом, который может быть применим к очень разного типа клеток. Надо быть очень осторожным в передаче протоколов, разработанных для одного типа клеток в другой ^6, поэтому важной задачей для оптимизации молекулярных зондов эффективно перед использованием.

Зеленые и оранжевые зонды нуклеиновых кислот связываются с обеих двухместных и одноместных мель нуклеиновых кислот с минимальной базой выберитеivity и используются для оценки целостности плазматической мембране клеток. Зеленый зонд нуклеиновой кислоты имеет значительно улучшенные сигнала флуоресценции мечения клеток по сравнению с другими молекулярных зондов, таких как пропидийиодидом основе соединений ^12, которые могут также действовать в качестве индикатора клеточной жизнеспособности. Термин «Жизнеспособность клеток" здесь подразумевает, что деградация ДНК происходит после потери целостности мембраны плазмы. Зонды нуклеиновых кислот несимметричные цианиновые красители с тремя положительными зарядами и не может проникать в клетки с неповрежденными мембранами под характеризующихся концентрации, в обоих эукариот ^11,13 и ^14,15 прокариотических организмов. Связывание зонда нуклеиновой кислоты нуклеиновых кислот может привести к до> 500-кратному увеличению выбросов флуоресценции эндогенных сигналов в клетках, которые имеют их целостность мембраны под угрозу. Хотя молекулярных зондов, таких как зеленый зондом нуклеиновой кислоты может быть хорошим индикатором одной физиологии клеток, существует необходимость тО оптимизировать каждый зонд с намеченной целевой организма, а время инкубации менялись от 7 мин - 30 мин и концентрации колеблется от 0,1 мкМ - 0,5 мкм Microcystis экспериментов одна ^{15 - 19.}

Здесь мы приводим протокол, чтобы оптимизировать цитометрии анализы зеленый и относительно новые оранжевые зонды нуклеиновых кислот (которые на сегодняшний день не были проверены на цианобактерий вида M.aeruginosa). Ниже развиты методика может быть передана на другие виды и использовали в качестве платформы для оптимизации протоколов в других молекулярных зондов, тем самым увеличивая понимание микробов и их экологического поведения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка Molecular Probe и проточной цитометрии

1. Развести исходные растворы зондов нуклеиновых кислот, которые поставляются в 5 мМ раствора в диметилсульфоксид (ДМСО) в аликвоты требуемой концентрации в сверхчистой фильтруют _H 2 O.
2. Храните зондов нуклеиновых кислот в темных условиях между -5 ^{° С} и - 25 ^{° С} до использования.
3. Включите цитометра и программного обеспечения нагрузки пакета (см таблицу материалов / Оборудование для спецификации ТСМ).
4. Поместите пустую трубу гемолиза (12 х 75 мм) на инъекции образца зонда (SIP), нажмите прочистить, а затем обратно на одном уровне, чтобы начать процесс очистки FCM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые примеры этапы для SIP может вместить несколько типов труб, включая микропробирок. Молекулярная разбавитель зонда и оболочки жидкости, используемый в устройстве FCM от аналитического сорта "типа 1" 0,22 мкм мембранный источника фильтрованной.
5. Местосвежий гемолиз трубка с 2 мл сверхчистой фильтрованной _H 2 O на SIP, установить лимит времени для 10 - 15 мин и текучей скоростью быстро (или скорости потока> 66 мкл / мин).
6. Выберите новую ячейку данных, положить на соответствующих пороговых значений для флуоресценции и рассеяния света каналов, чтобы уменьшить фоновый шум и нажмите «Выполнить».
7. Если общая сумма событий в секунду не ниже рекомендации производителя, и, затем запустить 2 мл образец обеззараживания раствора в течение 2 мин на быстрый и повторите шаги 1.4 & 1.5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, проверьте рекомендации изготовителя по ТСМ запуска очистки протоколы, так как они могут варьироваться в зависимости от модели. Тестирование для конкретных порогов также должен быть в соответствии с моделью ТСМ, как некоторое оборудование позволяет пользователю применять напряжений выгоды для фотоэлектронных трубок (ФЭУ) повышение или уменьшение электрического сигнала, записанного от оптических детекторов. ТСМ модель, используемая в этой экспериментовния зафиксировала ФЭУ напряжения и используется порог 80000 вперед рассеяния света (FSC-H), чтобы исключить частицы меньше, чем 2,0 мкм и электронным шума.

2. Подготовка культур и начальных кровяных клеток

1. Автоклав 98 мл сверхчистой фильтруют _H 2 O и 2 мл водорослей СМИ (концентрация x50) в 250 мл стакане в течение 20 мин при 120 ^{о С.}
2. Из первоначального монокультуры M.aeruginosa (PCC 7806) в высоком стационарном плотности месте 2 мл образца в трубке под SIP. Обеспечить представление какое-либо образование колоний встряхиванием или обработкой ультразвуком ²⁰ и подтвердите равномерно распределены клетки через световой микроскопии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное воздействие ультразвуковых волн может привести к лизису клеток и должны быть использованы с осторожностью. С ультразвуком может рухнуть газа пузырьки (как найти в таких видов, как M.aeruginosa) выходов, таких как сторона рассеяния света (SSC-H) интенсивность может стать более себеУчитывать регистр.
3. В программном обеспечении ТСМ, выберите гистограммы участок для записи данных из рассеяния вперед свет (FSC-H) и настроить параметры сюжет, нажав "войти", чтобы посмотреть в логарифмической шкале по оси.
4. В отдельный выход, выберите другой гистограмму (войти ось), чтобы записать природного флуоресценции, такие как принадлежность фотосинтетических пигментов фикоцианина (FL4-H, 675 ± 12,5 нм), найденной в M.aeruginosa.
5. Используйте источник света, который может возбуждать фикоцианин и детектор, который может фильтровать выбросы из полученного флуоресценции.
   Примечание: фотосинтетических пигментов, таких как хлорофилл может возбуждаться с обычно используемой длине волны 488 нм синим лазером, тогда как фикоцианина возбуждается более 600 нм и будут обнаружены только с красным ^{источника} 21 света. Проконсультируйтесь с производителем цитометров для источников света возбуждения и спектров детекторов излучения, тут и 488 нм и 640 нм лазера были использованы наряду с675 ± 12,5 нм оптический фильтр.
6. Для записи избранных настроек, наиболее близких к основной размер организма-мишени (10 мкм) и с относительно низкой скоростью потока (14 мкл / мин) с самым высоким разрешением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения наилучших образцов разрешением должен работать в соответствии с рекомендацией производит событий в секунду.
7. Прежде, чем приобрести данные использовать порог ворот из рассеяния света и / или флуоресцентных сигналов, которые вызваны электронной фонового шума или образца клеток мусора.
8. Выберите новую ячейку данных, создать плотность участок с FSC-H и параметров SSC-H на логарифмической шкале и выберите пункт Выполнить.
9. Если плотность образца приводит к чрезмерному скоростью событий, шаги разведение могут быть приняты для повышения точности и точности.
10. На участке плотности применяются программные ворота от предыдущего гистограммы, чтобы исключить сигналы низкого уровня рассеяния, произведенные фонового шума и мусора (FSC <320,000). Наоборот, чем выше ворот относительная флуоресценциификоцианин сигналы от клеток и включают в себя только эти события (FL4, 56000 - 1,950,000).
11. Используйте количество клеток, записанных в закрытых районах и разделить его на общий объем образца, который прошел через ТСМ, чтобы работать, как много клеток на мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ТСМ модель используется здесь имеет микропроцессорный блок управления системы перистальтического насоса, позволяющий объем выборки будет определен. Другое оборудование ТСМ может потребовать калиброванный шарик суспензии или расчет H ₂ различия веса O / громкость, чтобы проверить общий объем выборки.
12. Добавить необходимый объем клеток свежеприготовленных СМИ, чтобы начать цикл роста партия (250000 клеток / мл) M.aeruginosa.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вид будет отличаться темпов роста в зависимости от их в месте параметров окружающей среды и питательных веществ, наличии так производственного цикла должна быть предварительно записанных для определения фазы жизненного цикла.

3. Оптимзация Molecular Probe сотовый Поглощение

1. Урожай половина культуры M.aeruginosa полученного на стадии 2 из экспоненциальной фазе и использовать как "живой" контроль.
   Примечание: Образцы, разбавленные с высокой плотностью культуры прямо к экспоненциальной фазе может повлиять на результаты оптимизации через оборота мертвые клетки, по сравнению с культурами, привитых от начальной латентной фазы / индукции.
2. Приготовьте другую половину как «мертвый» управления с помощью методов, таких как 70% этанола, образцы нагревании при 60 ^{° С} в течение 1 ч, параформальдегид или 4% формальдегиде в течение 30 мин ^6,11,22. Проверьте изменения в микросреде образцов (например., Ph).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Позитивная, убитых нагреванием, "мертвых" контроль в M.aeruginosa отличается от "живой" образца через его снижения в фикоцианина сигналов. Стимулирование смертности другими методами, не может привести к такой же вывод и VARу видами.
3. Настройка смешанные образцы, используя различные соотношения "живой" и "мертвой" образцы (например, 0%, 25%, 50%, 100%).
4. Обеспечить представление образование колоний встряхиванием или обработкой ультразвуком и проверить рН.
5. Выберите 488 нм лазер наряду детекторов, которые могут записывать флуоресценции от зеленого (FL1, 530 ± 15 нм) и оранжевые (fL2, 585 ± 20 нм) зондов нуклеиновых кислот и 640 нм лазера для записи сигналов через фикоцианин соответствующей детектора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При связывается с ДНК, зеленый зонд нуклеиновой кислоты имеет приблизительную длину волны возбуждения флуоресценции 504 нм и эмиссии максимумов 523 нм, в то время как оранжевый зонд нуклеиновой кислоты имеет длину волны возбуждения 547 нм и эмиссии максимумов 570 нм. Аргоновый ионный лазер твердотельного лазера 488 нм могут быть использованы для возбуждения как молекулярных зондов, однако, зеленый лазер (до 547 нм) будет производить более высокую оранжевый флуоресценции.
6. В качестве отправной точки, ввестимолекулярный зонд с производителями рекомендуется концентрацию в 50% "живой" и 50% «мертвый» культуры и инкубировать в темноте.
7. Выберите новую ячейку данных, поместить образец в соответствии с SIP с порогами и триггеров, которые позволят уменьшить фоновый шум (FSC-H 80000).
8. Создать плотности участок с FSC-H и параметров SSC-H, и три гистограммы. Один гистограмма с помощью соответствующего датчика молекулярной оптический детектор канал (FL1 или 2), чтобы обнаружить выбросы фикоцианин (FL4-H), а другая FSC-H, все на логарифмической шкале.
9. Инкубируйте образцы M.aeruginosa с зондами нуклеиновых кислот в темноте в течение до 60 мин, записи в отдельных ячейках данных, в ряде временных точек (1, 5, 10, 15, 30 и 60 мин).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При регулировке параметров, таких как проверка рН с производителями для потенциальных реакций от некоторых химических веществ (для тестируемой нуклеиновой кислоты зондов буфер не может содержать фосфаты или высокие уровни моновалентному или дивыкредитов, предоставленных катионы, а связывание с ДНК будет снижена).
10. Применить программное обеспечение ворота включают только FSC-H гистограммы (320,000 - 1,500,000) для нецелевых организмов размер клетки, в соответствующей гистограммы канала флуоресценции зонда.
    Примечание: Концентрации, используемые в этом протоколе было 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 и 100 мкМ, которые могут быть изменены, увеличивая или уменьшая объем образца M.aeruginosa или начального исходного раствора нуклеиновых зондов.
11. В канале зонда флуоресценции, нанесите еще один всеобъемлющий программный ворота на самый высокий пик на гистограмме (зеленый FL1-H, 240000 - 1,650,000, оранжевый FL2-H, 30000 - 165000), а затем ворота, которые положительно зонд флуоресценции в плотности участка.
12. Выполнить шаги 3.1 - 3.11 со 100% "живых", 100% "мертвых" и всех смешанных образцов культуры, регулируя молекулярные концентрации зонда (например х 0,1 х 10 в) и / или температуры и уровня рН в случае необходимости.
13. Сравните число положительных сигналов флуоресценции молекулярной зонд к оригинальной плотности клеток «мертвых» клеток (взято из половины общего FSC-H или 100% «мертвый» культуры), чтобы найти общий процент клеток, окрашенных с нуклеиновой кислотой зонды.
14. Делайте это в течение каждого периода времени, в течение каждой концентрации, чтобы найти оптимальный протокол для наибольший процент поглощения зонда клеток нуклеиновой без получения неспецифического окрашивания (использовать средства в односторонний ANOVA или Крускала-Уоллиса-дисперсионного анализа, если данные непараметрической).

4. Молекулярный зонд флуоресценции Дискриминация

1. Для тестирования флуоресценции вмешательства / перекрытия от окрашивания внутренней или неспецифической клеточной выбрать 50% "живые" и 50% "мертвых" смешанные данные культуры и снять все ворота.
2. Применить программного ворота включают только FSC-H гистограммы (320,000 - 1,500,000) для нецелевых организмов размер клетки, в фикоцианинаГистограмма канала.
3. Ворота самый высокий пик фикоцианин и этикетки, как "живой", с добавлением низкой пика помечены как "мертвым".
4. Выполните следующий шаг ворота в соответствующей молекулярной гистограммы канала флуоресценции зонда, используя по одному, тем "живой", а затем "мертвых" фикоцианин (FL4) сигналы, записи двух средних длин волн.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Режим для индукции смертность в этом эксперименте было сделано с помощью термической обработки, которая при этом протокол явно уменьшается фикоцианин сигналы. Другие способы получения населением «мертвых» клеток может давать разные выходы в приобретенных трасс.
5. Коэффициент средние длины волн положительной молекулярной флуоресценции зонда («мертвый») и внутренней / неспецифической сигнала («живой») для определения чувствительности протокола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения флуоресценции дискриминации "живой" и "мертвой" Пополь-димости увеличить источник углерода для активного поглощения питательных пятно в обедненный клеток или этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), чтобы улучшить проницаемость клеточной стенки и в результате сигналов флуоресценции ^6. Общество с ограниченной компенсации в некоторых моделях ТСМ для спектрального перекрытия могут быть выполнены пользователем манипулировать попарно коррекции во время сбора образца (изменение напряжения ФЭУ) или пост-аналитического специализированного программного обеспечения.
6. Выберите оптимизированный протокол, в котором наибольшее количество «мертвых» клеток, окрашенных без возникновения неспецифического окрашивания. Если количество теста имеют аналогичные результаты принимать протокол с низкой концентрацией и инкубации времени, наряду с хорошей дискриминации сигналов флуоресценции. Последующие инструкции производителя для процедуры цитометра отключения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Вперед рассеяние света (FSC) и бокового рассеивания света (SSC) выходы из партии культуры M.aeruginosa в экспоненциальной фазе обеспечивает информацию о размере клеток (диаметр) и внутренней детализации соответственно (рис 1а). FSC может различать клетки, которые сл...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Увеличение числа публикаций с использованием молекулярных зондов указывает, что надежные и информативные данные могут быть получены ^{5,6,8 - 15,19,22,23.} Пока еще нет идеально пятно для жизнеспособности клеток, которые могут быть эффективными во всех видах с той же концентра?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid	BD Biosciences	653155	Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min.  Followed by 2 min of sheath H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	by request	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO