光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（<em&gt;アオコ緑膿菌</em&gt;）フローサイトメトリーを使用して

要約

微生物集団は、全体的な動作を決定することができる実質的な細胞の不均一性を、含まれています。フローサイトメトリーを介して、分子プローブ分析は、細胞の生理的状態を決定することができ、しかし、そのアプリケーションは、種間で変化します。本研究では、偽陽性の結果を過小評価または記録することなく、正確にシアノバクテリアの集団内の細胞の死亡率を決定するためのプロトコルを提供します。

要約

微生物分野での亜集団と実験室での研究は、形態学的および生理学的パラメータに高い不均一性を示すことが示されてきました。微生物が細胞分裂および代謝活性が低下していることにより休眠状態で存在することができるように微生物細胞のリアルタイムの状態を決定することは、生死のカテゴリーを超えました。微生物の検出および定量化の必要性を考えると、分子プローブを用いたフローサイトメトリー（FCM）は、集団全体の生存率を決定するのを助けるために迅速かつ正確な方法を提供します。膜の完全性を検出するためのモデルシアノバクテリアのMicrocystis aeruginosaのでSYTOX緑とSYTOXオレンジを使用することにより、我々は単一細胞死亡率の急速な適応のための譲渡方法を開発。 actioの同等のモードを有する類似の励起波長および発光波長を有する他の製品があるが、このジャーナル内で使用される分子プローブは、（それぞれ緑またはオレンジ核酸プローブと称しますnは、我々は、具体的に前面に参照）プローブを述べました。分子プローブを使用したプロトコルは濃度およびインキュベーション時間で、主に異なる、種間で変動します。 M.aeruginosaに出るこのプロトコルに続いて緑の核酸プローブは、10分後に1μMで30インキュベーションの分とオレンジの核酸プローブの後、0.5μMの濃度で最適化しました。両方のプローブで述べた最適未満の濃度は、膜の損傷による細胞の下に報告につながりました。逆に、両方のプローブで5μMの濃度と高いが「非生存」細胞数の過剰表現につながる、「ライブ」細胞が標的の蛍光を生成することにより非特異的な染色の種類を示しました。ポジティブコントロール（加熱殺菌）コントロールの生成の妥当性が議論の対象に残るものの、検証可能な死んだバイオマスを提供しました。我々はデ・緑とオレンジの核酸プローブを最適化するためのステップの論理的順序を実証することにより、効果的にシアノバクテリアの生理学的状態を分析するために使用できるプロトコルを作成する方法monstrate。

概要

細胞は常に生理的パラメータを変更し、その機能を変化させることにより環境に応答する複雑なシステムです。 ^{3 -}同質遺伝子の微生物集団の個体群動態自然の中で、実験の両方が比較的一定の環境条件下でさえ^1を発生する、亜集団の発展によって影響されます。自然の微生物群集の多様性は、環境条件の非常に可変性に起因して生じます。これら時々確率過程はその後、人口の平均に非常に異なっている部分集団を生成します。最近の証拠は、これらの生理学的な亜集団は、環境条件に異なった反応をし、劇的に影響し、全体的な人口の^{3,4に影響を与える}シグナル化合物または阻害剤を産生することができることを明らかにしました。

集団内の異質性を定義するための方法を確立することは、国連への鍵ですなどなどアナベナなどの種は異質のような特殊化した細胞を開発し、環境変動に応じて、形態学的不均一性を示す人間の水の安全保障に大きく影響を与える。有毒アオコなど、様々な環境での微生物の生態をderstandingと迷惑シアノバクテリアの知識を構築する際に不可欠ですそして、akinetes ^2。これとは対照的に、 アオコ細胞は、ストレス応答の間に明らかな形態学的な不均一性を表示しません。実行可​​能と非生存細胞との区別は、生理的分化の最も重要な側面であり、微生物の個体群動態をよりよく理解することができます。しかし、細菌の生存率そのものの概念の問題は難しいと特徴付けが乏しい^1,5,6のまま。

フローサイトメトリー（FCM）は、個々の細胞を分析の信頼性が高く、迅速な方法です。単一細胞生理の理解を高めるためにFCMスルーでれっと、分子プローブは、代謝および生化学的プロセス⁷の数を区別するために使用されてきました。これは、携帯電話や人口レベルでの種の増加の知識につながったし、今度は水資源管理^8,9を支援してきました。しかし、生物は、分子プローブ設計およびプロトコル実装^6,10,11の数につながっている携帯壁や膜中の細孔やポンプ、に分子プローブの取り込みと排出の点で異なります。商業用および研究目的のために利用可能な分子プローブは、しばしば、非常に異なる細胞型にも適用可能である一般的なプロトコルを用いて供給されています。一つは、別の⁶に一つの細胞型のために開発されたプロトコルを転送するのに非常に慎重でなければならない、それは、したがって、効果的に使用する前に分子プローブを最適化するために不可欠な作業です。

緑とオレンジの核酸プローブは、最小限のベースとのダブルと一本鎖核酸の両方に結合し選択ivityとは、細胞の原形質膜の完全性を評価するために使用されます。緑色の核酸プローブは、また、細胞生存率の指標として機能することができるヨウ化プロピジウム系化合物¹²のような他の分子プローブに比べて著しく改善された細胞標識蛍光シグナルを有します。ここで用語「細胞生存率は、「DNA分解は、原形質膜完全性の喪失後に発生することを想定しています。核酸プローブは、3つの正電荷を有する非対称シアニン色素であり、真核生物の^11,13および原核生物^14,15の両方で、特徴づけられた濃度の下で、無傷の膜を有する細胞を入力することはできません。核酸に核酸プローブの結合は、それらの膜完全性が損なわれている細胞における内因性信号からの蛍光発光の> 500倍の増加までをもたらすことができます。このような緑色の核酸プローブとして分子プローブは、単一の細胞生理学の良い指標となることができますが、必要性のトンがありますだけではアオコの実験では^{0.5μM15 -} - 0.1μMから30分であり、濃度範囲- ¹⁹インキュベーション時間は7分まで変化させてきたように、O、目的の標的生物に各プローブを最適化します。

ここでは、緑のサイトメトリーアッセイと（これまでにシアノバクテリア種M.aeruginosa上でテストされていない）比較的新しいオレンジ色の核酸プローブを最適化するためのプロトコルを提示します。次の発展の方法は、他の種に移し、それによって微生物およびそれらの生態行動の理解を増加させる他の分子プローブでプロトコルを最適化するためのプラットフォームとして使用することができます。

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プロトコル

分子プローブおよびフローサイトメーターの作製

1. 超純濾過H ₂ Oに必要な濃度のアリコートにジメチルスルホキシド（DMSO）中の5 mM溶液として供給されている核酸プローブのストック溶液を希釈
2. ^25°Cの使用まで- ^-5°Cの間の暗いところでの核酸プローブを保管してください。
3. フローサイトメーターおよびロード・ソフトウェア・パッケージ（FCM仕様のための材料/機器の表を参照）をオンにします。
4. 試料注入プローブ（SIP）の空の溶血チューブ（12×75 mm）を置いて、邪魔を除く、その後FCM洗浄プロセスを開始するためにフラッシュバックをクリックします。
   注 ：SIPのためのいくつかのサンプルステージはマイクロ遠心チューブなどのチューブのいくつかのタイプを収容することができます。 FCM装置に用いられる分子プローブの希釈剤とシース液は分析グレード「タイプ1」、0.22μmのメンブレンフィルターのソースからです。
5. 場所15分と速いために、流体の速度（または> 66マイクロリットル/分の流速） - SIPの超純フィルタリング_の H 2 O 2 mlの新鮮な溶血管は、10の時間制限を設定します。
6. 新しいデータセルを選択し、バックグラウンドノイズを低減し、「実行」をクリックする蛍光および光散乱チャネルに関連したしきい値に置きます。
7. 秒あたりの総イベントは、製造業者の推薦の下にない場合は、高速で2分間の除染液2mlのサンプルを実行して、手順1.4＆1.5を繰り返します。
   注 ：彼らはモデル間で変化させることができるよう、FCM起動クリーニングプロトコルについては、メーカーの推奨事項を確認してください。特定のしきい値のテストはまた、いくつかの機器は、ユーザは、光検出器から記録された電気信号を増強または減少する光電子増倍管（PMT）に電圧ゲインを適用することを可能にするようFCMモデルに沿ったものであることが必要です。このexperiで使用されるFCMモデルメントは、電圧のPMTを固定し、2.0ミクロンと電子ノイズよりも小さな粒子を除外80,000前方光散乱（FSC-H）のしきい値を使用しています。

文化と初期細胞数の調製

1. 120 ^O℃で20分間、250mlビーカー中で藻類メディア（X50濃度）の超高純度フィルタH ₂ Oおよび2ミリリットルのオートクレーブ98ミリリットル
2. SIPの下のチューブにサンプル2mlの高い定常状態密度代わりにM.aeruginosa（PCC 7806）の初期のモノカルチャーから。ボルテックスまたは超音波処理²⁰により任意のコロニー形成を脱凝集し、光学顕微鏡を通して均等に分散した細胞を確認します。
   注 ：超音波への過度の露出は、細胞溶解につながることができますし、注意して使用する必要があります。 （M.aeruginosaのような種に見られるような）超音波処理は、側方光散乱（SSC-H）の強度として出力をよりSEになることができるガスの小胞を折りたたむことができますので、nsitive。
3. FCMソフトウェアの中では、前方光散乱（FSC-H）からのデータを記録し、軸に対数スケールで表示するには、「ログイン」をクリックして、プロットの仕様を設定するには、ヒストグラムプロットを選択します。
4. 別の出力では、このようなアクセサリ光合成色素フィコシアニン（FL4-H、675±12.5 nm）のM.aeruginosaで見つかった、などの自然蛍光を記録する（軸をログ）別のヒストグラムを選択します。
5. フィコシアニンと得られる蛍光からの排出量をフィルタリングすることができる検出器を励起することができる光源を使用してください。
   注 ：フィコシアニンは、600 nmでオーバー励起され、唯一の赤色光源²¹で検出されるのに対し、このようなクロロフィルなどの光合成色素は、一般的に使用される488nmの青色レーザーで励起することができます。ここでは、励起光源のためのフローサイトメーターのメーカーと発光検出器のスペクトルに確認してください両方488 nmおよび640 nmのレーザーを一緒に使用されました675±12.5 nmの光学フィルタ。
6. 標的生物（10ミクロン）のコアサイズと比較的遅い流速（14μL/分）に最も近い最高の解像度を選択した設定を記録するために。
   注 ：最高の解像度のサンプルについては、1秒あたりのイベント勧告を製造しているに応じて実行する必要があります。
7. データ取得は、ゲートに電子バックグラウンドノイズまたは細胞サンプルの破片によって引き起こされる光散乱および/または蛍光シグナルをしきい値を使用する前に。
8. 新しいデータセルを選択し、ログスケールのFSC-HおよびSSC-Hのパラメータを持つ密度プロットを作成して実行]をクリックします。
9. サンプル密度が過剰イベント率につながる場合、希釈工程は、正確さと精度を高めるために取ることができます。
10. 密度プロットでは、バックグラウンドノイズやゴミ（FSC <32万）によって製造される低レベルの散乱信号を除外するために、前のヒストグラムからソフトウェアゲートを適用します。逆にゲートより高い相対蛍光フィコシアニン細胞からの信号だけでは、これらのイベント（ - 1,950,000 FL4、56000）が挙げられます。
11. ゲートされた領域に記録する細胞の数を使用し、1mlあたりどのように多くのセルを動作させるには、FCMを通過した試料の全容量で割り。
    注 ：ここで使用されるFCMモデルは、試料体積を決定することを可能にするマイクロプロセッサ制御蠕動ポンプシステムを有しています。他のFCM装置を較正ビーズ懸濁液又は全試料容量を確認するためにH _{2 O}重量/体積の差の計算を必要とするかもしれません。
12. M.aeruginosaのバッチ増殖サイクル（250,000細胞/ mlで）を開始するために新たに調製した培地に細胞の必要量を加えます。
    注 ：種はそうバッチサイクルがライフサイクルの位相を決定するために、事前に記録されるべきであるそれらのインサイチュー環境パラメータおよび栄養素利用可能性に応じて成長速度が異なるであろう。

3.のOptim分子プローブの細胞取り込みの化

1. M.aeruginosa文化の収穫の半分は対数期から、ステップ2で調製し、「ライブ」コントロールとして使用します。
   注 ：ストレート指数期に高密度培養物から希釈されたサンプルは、初期の遅れ/誘導期から接種した培養物のそれに比べて、死んだ細胞のターンオーバーを介して最適化の結果に影響を及ぼす可能性があります。
2. 1時間、パラホルムアルデヒドまたは30分^6,11,22のための4％ホルムアルデヒド^、60°Cの時に、このような70％エタノール、加熱サンプルのような方法を使って、「死んだ」コントロールとして残りの半分を準備します。サンプルの微小環境の変化（ 例えば 、pH値）を確認してください。
   注 ：M.aeruginosaで陽性、熱殺菌された、「死んだ」制御フィコシアニン信号での減少を通じ「ライブ」のサンプルとは区別されます。他の方法により死亡率を誘導することは、同じ出力を発生させません。VARます種のY。
3. 異なる比を使用して混合試料を設定する「ライブ」および「死んだ」サンプル（ 例えば 、0％、25％、50％、100％）。
4. ボルテックスまたは超音波処理によって、コロニー形成を脱凝集し、pHを確認してください。
5. 488 nmの緑色（FL1、530±15 nm）のからの蛍光を記録することができ、検出器と一緒にレーザーとオレンジ（FL2、585±20 nm）の核酸プローブとそれぞれの検出器をフィコシアニン信号を記録する640 nmのレーザーを選択します。
   注 ：DNAに結合すると、オレンジ色の核酸プローブは、570 nmで547 nmおよび放射極大励起波長を有する一方で、緑の核酸プローブは、523 nmで504 nmおよび発光最大値のおおよその蛍光励起波長を有します。 488nmのアルゴンイオン固体レーザが両方の分子プローブを励起するために使用することができる、しかし、（547ナノメートルまで）緑色レーザは、より高いオレンジ色の蛍光を生成します。
6. 出発点として、ご紹介メーカーとの分子プローブは、50％の「ライブ」50％「死んだ「文化への濃度を推奨し、暗闇の中でインキュベートします。
7. 新しいデータセルを選択し、バックグラウンドノイズ（FSC-H 80,000）削減するしきい値とトリガーとSIPの下にサンプルを配置します。
8. FSC-HおよびSSC-Hパラメータ、および3つのヒストグラムと密度プロットを作成します。フィコシアニンの排出量（FL4-H）と他のFSC-H、すべてのログスケールで検出するために、それぞれの分子プローブの光検出器チャンネル（FL1または2）、1つを使用して1つのヒストグラム。
9. 時点（1、5、10、15、30および60分）の数で、別のデータセルに記録し、最大60分間、暗闇の中で核酸プローブとM.aeruginosaのサンプルをインキュベートします。
   注 ：特定の化学物質からの潜在的な反応のために製造して例えばpHチェックなどのパラメータを調整するとき（テスト核酸ためのバッファがリン酸または一価または歌姫の高いレベルを含めることはできませんプローブDNAとの結合が減少されるように）、陽イオンを貸し。
10. それぞれの蛍光プローブチャネルヒストグラムに、セルサイズの生物標的に対して - のみFSC-Hヒストグラム（150万32万）を含むようにソフトウェアゲートを適用します。
    注意 ：このプロトコルで使用される濃度はM.aeruginosa試料または核酸プローブの初期ストック溶液の体積を増加または減少のいずれかによって変更することができ0.05、0.1、0.5、1、5、10、50および100μMでした。
11. 蛍光プローブチャネルでは、ヒストグラムの最高ピークに別の包括的なソフトウェアゲートを適用（緑FL1-H 24万 - 165万、オレンジFL2-H 30,000 - 165,000）、続いてゲートそのポジティブプローブ蛍光密度プロットに。
12. 分子プローブの濃度（例えば、x〜0.1×10）、および/または温度およびpHレベルを必要に応じて調整し、100％の「ライブ」、100％の「死んだ 'とすべての混合培養試料で3.11 - を実行して、3.1を繰り返します。
13. 核酸で染色した細胞の合計割合を見つけるために、（合計の半分のFSC-Hまたは100％ '死んだ「文化から取られた）「死んだ」細胞の元の細胞密度に正の分子プローブの蛍光シグナルの数を比較プローブ。
14. 非特異的な染色（一方向ANOVAまたはクラスカル・ウォリス検定で手段を使用を生じることなく、細胞の核酸プローブの取り込みの割合が最も高いのための最適なプロトコルを見つけるために、各濃度内の各時間帯のためにこれを行い、データは、ノンパラメトリックである場合）。

4.分子プローブの蛍光差別

1. 真性または非特異的な細胞染色からの蛍光干渉/重複のテストのために50％の「ライブ」50％「死んだ」混合培養データを選択して、すべてのゲートを脱ぎます。
2. フィコシアニンに、標的生物の細胞の大きさのために - FSC-Hヒストグラム（150万32万）にのみ含まれるようにソフトウェアゲートを適用しますチャネルヒストグラム。
3. 門「死んだ」とラベルされた最低のピークを追加した「ライブ」として最高フィコシアニンピークとラベル、。
4. 平均波長の両方を記録し、一度に一つ、「ライブ」、次に「死んだ」フィコシアニン（FL4）信号を使用して、それぞれの分子プローブの蛍光ヒストグラムチャネルにさらにゲートステップを実行します。
   注記 ：この実験では死亡率を誘導するためのモードは、このプロトコルの下で明らかにフィコシアニン信号を減少させる熱処理によって行われました。 「死んだ」細胞の集団を産生する他の方法は、取得した実行で異なる出力をもたらすことができます。
5. 比プラスの分子プローブの蛍光（ '死んだ'）および固有/非固有の信号（「ライブ」）の平均波長は、プロトコルの感度を決定します。
   注：「ライブ」と「死んだ」populの蛍光識別を改善するために、ationsは、細胞壁の透過性、得られる蛍光信号^{6を改善するために}栄養枯渇細胞又はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）で活性染色取り込みの炭素源を増加させます。スペクトル重複のためのいくつかのFCMモデルで限定補償はサンプル取得（PMT電圧が変化する）の間または後分析専用ソフトウェアからのユーザー操作ペアごとの補正によって行うことができます。
6. 「死んだ」細胞の最高額が発生非特異的な染色せずに染色された最適化されたプロトコルを選択します。テストの数は、同様の結果を持っている場合は、良好な蛍光信号識別とともに、最低濃度およびインキュベーション時間でプロトコルを受け入れます。フォローサイトメーターはシャットダウン手順のための指示を製造しています。

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結果

対数期におけるM.aeruginosaのバッチ培養からの前方光散乱（FSC）および側方光散乱（SSC）出力は、それぞれのセルの大きさ（直径）と内部粒度に関する情報（ 図1A）を提供します。 FSCはM.aeruginosaことには大きすぎるおよび/ ​​または小である細胞を識別することができます。この差別またはゲーティングはFSC出力（ 図1C）の特定...

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ディスカッション

^{15,19,22,23 -}分子プローブを使用して出版物の増加した数は、信頼性が高く、有益なデータが^5,6,8を得ることができることを示しています。まだのと同じ濃度およびインキュベーション時間^6,10を持つすべての種にわたって有効であることができる細胞の生存率には完璧な汚れがありません。変更された蛍光発光を有するプローブであっても同じタイプが正しい濃...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid	BD Biosciences	653155	Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min.  Followed by 2 min of sheath H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	by request	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO