분자 프로브 최적화 (광합성 생물의 세포 사망을 확인하는 방법<em&gt; Microcystis aeruginosa의</em&gt;) 유동 세포 계측법을 사용하여

요약

미생물 인구는 전체 동작을 지시 할 수있는 실질적인 세포 이질성가 포함되어 있습니다. 유동 세포 계측법을 통해 분자 프로브 분석 그러나 그것의 응용 프로그램이 종 사이에서 변화, 세포의 생리 학적 상태를 확인할 수 있습니다. 이 연구는 과소 평가하거나 거짓 긍정적 인 결과를 기록하지 않고, 정확하게 cyanobacterium 인구 내에서 세포 사망을 결정하는 프로토콜을 제공합니다.

초록

필드와 실험실 연구에서 미생물 개체군은 형태 학적 및 생리 학적 파라미터에 높은 이질성을 표시하는 것으로 나타났다. 미생물 세포 분열 및 대사 활동이 감소함으로써 휴면 상태로 존재할 수있는 균체의 실시간 상태를 결정하면, 라이브 또는 죽은 카테고리로 넘어 간다. 전체 인구의 생존을 결정하는 데 도움이 할 수있는 신속하고 정확한 방법은 분자 프로브 감지 및 미생물의 정량화에 대한 필요성, 세포 계측법 (FCM)을 흐름을 제공 감안할. 막 완전성을 검출하도록 모델에 남조류 Microcystis 녹농균을 SYTOX 그린 SYTOX 오렌지를 사용함으로써, 우리는 단일 세포 사망의 신속한 표시에 대한 방법을 개발 양도. actio의 필적 모드가 유사 여기 및 발광 파장이 다른 제품이 있지만,이 저널에서 사용 분자 프로브 (각각으로 녹색 또는 오렌지색 핵산 프로브 부른다앞이 프로브를 언급에 N, 우리는 구체적으로)를 참조하십시오. 분자 프로브를 사용하여 프로토콜 농도와 배양 시간에 주로 서로 다른 종 사이에 다릅니다. M.aeruginosa에 출발이 프로토콜에 따라 녹색 핵산 프로브는 30 배양 분, 10 분 후 1 μM에서 오렌지 핵산 프로브 후 0.5 μM의 농도에서 최적화되었습니다. 막 손상 세포의보고에서 주도 언급 최적의보다 적은 양의 프로브 농도. 반대로, 두 프로브 5 μM 농도 이상은 '생방송'세포 '는 비 생존 "세포 수의 위에 표현 선도, 대상 형광을 생성함으로써 비특이적 염색의 유형을 나타낸다. 제어 세대의 적합성이 논의 될 수 남아 있지만, 양성 대조군 (열 사망)는, 검증 가능한 죽은 바이오 매스를 제​​공했다. 녹색과 주황색 핵산 프로브 우리 드를 최적화하기위한 단계의 논리적 순서를 보여줌으로써시아 노 박테리아 효과적으로 생리 상태를 분석하는데 사용될 수있다 프로토콜을 만드는 방법 monstrate.

서문

세포는 지속적으로 생체 변수를 수정하고 그 기능을 변화시켜 환경에 반응 복잡한 시스템이다. ^{3 -} 동종 미생물 인구 자연과 실험실 모두의 인구 역학은 비교적 일정한 환경 조건 ^(1)에서 발생, 개체군의 발전에 의해 영향을받습니다. 자연 미생물 군집의 변화로 인해 환경 조건의 매우 가변적 특성으로 발생한다. 이 때로는 확률 과정​​ 이후 인구 평균에 매우 다른 소집단을 생산하고 있습니다. 최근의 증거는 이러한 생리적 개체군은 환경 조건에 다르게 반응과 크게 영향을 전체 인구의 ^{3,4에 영향을} 미치는 신호 화합물 또는 억제제를 생성 할 수 있음을 밝혔다.

집단 내 이질성을 정의하는 방법을 설정하면 해제의 열쇠입니다다양한 환경에서 미생물의 생태를 derstanding 및 heterocysts 같은 전문화 된 세포를 개발하고, 이러한 환경 변동에 대한 응답으로 형태 학적 이질성을 표시 크게 영향 인간의 물 보안에. 종 등 Anabaena와 같은 독성 Microcystis으로, 귀찮은 시아 노 박테리아의 지식을 구축 할 때 필수적이다 및 akinetes ^2. 대조적으로, Microcystis 세포 스트레스 반응 중에 명백한 형태 이질성을 표시하지 않는다. 실용적인 비 생존 세포 간의 차별 생리 분화의 가장 중요한 측면이다 미생물 개체군에 대한 이해를 허용한다. 그러나 세균의 생존 자체의 개념 문제는 어렵고 가난 ^1,5,6을 특징으로 남아있다.

유동 세포 계측법 (FCM)은 각각의 세포를 분석하는 안정적이고 빠른 방법입니다. 단일 셀의 물리 치료사에 대한 이해를 높이려면FCM의 뜻을 통해, 프로브 분자는 생화학 적 대사 과정 ^(7)의 개수를 구별하는데 사용되어왔다. 이 세포 및 인구 수준에서 종의 증가 지식을 주도 차례로 수자원 관리 ^{8,9 도움이되었습니다.} 그러나, 생물 인해 분자 프로브 설계 및 프로토콜 구현 ^6,10,11의 숫자로 이끈 세포 벽과 세포막에 구멍 펌프, 분자 프로브 흡수 및 유출의 관점에서 차이가있다. 상업 및 연구 목적을 위해 사용 가능한 분자 프로브는 종종 매우 상이한 세포 유형에 적용될 수있는 일반적인 프로토콜에 공급된다. 하나는 다른 ⁶ 하나의 세포 유형을 위해 개발 된 프로토콜을 전송하기에 매우주의해야하며, 효과적으로 사용하기 전에 분자 프로브를 최적화하기 위해 필수적인 작업은 따라서이다.

녹색과 주황색 핵산 프로브는 최소한의 기본 더블 및 단일 가닥 핵산을 모두 결합 선택의 ivity 및 세포의 세포막의 무결성을 평가하기 위해 사용된다. 녹색 핵산 프로브는 세포 생존의 지표로서 작용할 수 요오드화 프로피 듐 등의 계 화합물 ^(12)과 같은 다른 분자 프로브에 비해 현저하게 개선 된 셀 라벨 형광 신호를 갖는다. 용어 "세포 생존 '는 여기 DNA 분해가 세포막 무결성 손실 후에 발생한다고 가정. 핵산 프로브는 세 양전하와 비대칭 시아닌 염료이며, 모두 진핵 ^11,13 및 원핵 생물 ^{14, 15에,} 특징 농도에서 양막 세포를 입력 할 수 없습니다. 핵산 핵산 프로브의 결합은 멤브레인 무결성이 손상된 세포에서 내인성 신호로부터 형광 방출> 500 배 증가까지 초래할 수있다. 이러한 녹색 핵산 프로브 분자 프로브는 단일 세포 생리학의 좋은 지표가 될 수 있지만, 필요에 t 존재혼자 Microcystis 실험에서 0.5 μm의 ^{15 -} - 0.1 μM에서 30 분 및 농도 범위 - ¹⁹ 배양 시간은 7 분에서 다양대로 O, 의도 된 대상 유기체 각 프로브를 최적화 할 수 있습니다.

여기에서 우리는 녹색의 세포 측정 분석과 (날짜에 시아 노 박테리아 종 M.aeruginosa에서 테스트되지) 비교적 새로운 오렌지 핵산 프로브를 최적화하는 프로토콜을 제시한다. 다음 개발 된 방법론은 다른 종에 전송함으로써 미생물의 이해와 생태적 행동을 증가 다른 분자 프로브의 프로토콜을 최적화하기위한 플랫폼으로 사용될 수있다.

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프로토콜

분자 프로브 및 흐름 사이토 1. 준비

1. 초순수 여과하고 H ₂ O에 필요한 농도의 분취 액에 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 5 mM의 용액으로 공급 된 핵산 프로브의 원액을 희석
2. 25 ^O C까지 사용 - -5 ^O C와 사이의 어두운 조건에서 핵산 프로브를 저장합니다.
3. 사이토 흐름과 부하 소프트웨어 패키지를 켭니다 (FCM 사양 재료 / 장비의 표 참조).
4. 시료 주입 프로브 (SIP)에 빈 용혈 관 (12 X 75mm)를 놓고, FCM 청소 프로세스를 시작 다시 세척 한 후 방해를 없애기 클릭합니다.
   참고 : SIP에 대한 몇 가지 샘플 단계는 마이크로 원심 튜브를 포함하는 튜브의 여러 종류를 수용 할 수 있습니다. FCM 장치에 사용되는 프로브 분자 희석제 및 시스 유체 분석 등급 "타입 1"을 0.22 ㎛의 막 여과 소스이다.
5. 장소15 분 금식하는 유체 속도 (또는> 66 μL / 분의 유속으로) - SIP에 초순수 여과 H ₂ O 2 ㎖와 신선한 용혈 튜브, 10 시간 제한을 설정한다.
6. 배경 잡음을 줄이고 '실행'을 클릭 형광 빛 산란 채널 관련 임계 값을 넣어 새로운 데이터 셀을 선택합니다.
7. 초당 총 이벤트가 제조업체의 추천 아래에없는 경우, 빠른 2 분 동안 오염 제거 용액의 2 ml의 샘플을 실행 한 다음 1.4 및 1.5 단계를 반복합니다.
   주 :이 모델에 따라 다를 수 있기 때문에, 스타트 업 프로토콜을 청소 FCM에 대한 제조업체의 권장 사항을 확인하시기 바랍니다. 특정 임계 값에 대한 테스트는 일부 장비가 향상 또는 광 검출기에서 기록 된 전기 신호를 감소 광전자 증 튜브 (의 PMT)에 전압 이득을 적용 할 사용자를 허용하는 FCM 모델과 일치 할 필요가있다. 이 체험관에서 사용 FCM 모델, 표준은 전압의 PMT를 고정 입자보다 작은 2.0 μm의 전자 노이즈를 제외 80,000 앞으로 빛 산란 (FSC-H)의 임계 값을 사용하고있다.

문화 및 초기 세포 수의 2. 준비

1. 120 ^O ℃에서 20 분 동안 250 mL의 비커에 조류 미디어 (50 배 농도)의 초순수 여과 H ₂ O 2 ml를 압력솥 ​​98 ml의
2. SIP에서 튜브에 높은 정상 상태 밀도 장소 샘플 2 ㎖에 M.aeruginosa (7806 PCC)의 초기 단일 문화에서. 소용돌이로 교반 또는 초음파 ^(20)에 의한 콜로니 형성을들을 분해하고 광학 현미경을 통해 균등하게 분산 된 세포를 확인합니다.
   참고 : 초음파에 과도한 노출은 세포 용해가 발생할 수 있습니다주의를 요합니다. 이러한 측면 빛의 산란으로 출력 (M.aeruginosa 같은 종에서 발견) 초음파 가스 소포를 축소 할 수 있기 때문에 (SSC-H)의 강도는 그 자체로 더 될 수 있습니다nsitive.
3. FCM 소프트웨어 내에서 앞으로 빛 산란 (FSC-H)의 데이터를 기록하고 축에 로그 스케일에서 볼 수 "로그"를 클릭하여 플롯 사양을 구성 할 수있는 히스토그램 플롯을 선택합니다.
4. 별도의 출력, 이러한 M.aeruginosa에있는 액세서리 광합성 색소 피코시 아닌 (FL4-H, 675 ± 12.5 ㎚), 천연 형광을 기록 (축 로그) 다른 히스토그램을 선택합니다.
5. 피코시 아닌 그 결과 형광에서 배출량을 필터링 할 수 있습니다 탐지기를 자극 할 수있는 광원을 사용합니다.
   참고 : 피코시 아닌은 600 nm의 이상 흥분 만 빨간색 광원 ^(21)과 감지 반면 광합성 색소는 엽록소로, 일반적으로 사용되는 488 nm의 청색 레이저와 흥분이 될 수 있습니다. 여기 광원의 흐름 세포 계측기 제조 업체 및 방출 검출기의 스펙트럼, 여기에 모두 488 nm에서 640 nm의 레이저로 체크와 함께 사용되었다675 ± 12.5 nm의 광학 필터.
6. 대상 유기체 (10 μm의)과 상대적으로 느린 유속 (/ 분 14 μL)의 코어 크기에 가장 가까운 가장 높은 해상도 설정을 선택를 기록하십시오.
   참고 : 최고 해상도 샘플의 경우는 초당 이벤트의 추천을 생산에 따라 실행해야합니다.
7. 취득 데이터 게이트 밖으로 빛의 산란 및 / 또는 형광 신호 임계 값을 사용하기 전에 전자 배경 잡음 또는 세포 샘플 파편에 의해 발생되는.
8. 새로운 데이터 셀을 선택 로그 스케일에 FSC-H와 SSC-H 매개 변수와 밀도 플롯을 작성하고 실행을 클릭합니다.
9. 샘플 밀도가 과도 이벤트 레이트에 이르게되면 희석 단계는 정확도와 정밀도를 증가시키기위한 조치가 취해질 수있다.
10. 밀도 플롯에 배경 소음이나 파편 (FSC <320,000)에 의해 생성 된 낮은 수준의 산란 신호를 제외하기 이전 히스토그램에서 소프트웨어 게이트를 적용합니다. 상대적으로 높은 형광 반대로 게이트피코시 아닌 세포들로부터의 신호 만이 이벤트 (- 1,950,000 FL4, 56,000)을 포함한다.
11. 용액 당 얼마나 많은 셀을 작동하는, 게이트 영역에 기록 셀의 개수를 사용하여 FCM 통과 한 시료의 총 부피로 나눈다.
    주 : 여기에서 사용 FCM 모델은 샘플 량을 판별 할 수 있도록 마이크로 프로세서 제어 연동 펌프 시스템이있다. 기타 FCM 장비는 교정 비드 정지 또는 전체 샘플 볼륨을 확인하기 위해 H ₂ O의 중량 / 부피의 차이의 계산을 필요로 할 수있다.
12. M.aeruginosa의 배치 성장주기 (250,000 세포 / ml)을 시작하기 위해 신선하게 제조 된 미디어에 필요한 세포의 볼륨.
    주 : 종 그렇게 배치주기가 라이프 사이클 단계를 결정하는 사전 - 기록해야 그들의 시츄 환경 파라미터 및 영양소 이용 가능성에 따라 성장 속도에 차이가된다.

3. Optim을분자 프로브 세포 흡수 화

1. M.aeruginosa 문화의 수확 절반 지수 단계에서 2 단계에서 제조 및 '라이브'컨트롤로 사용합니다.
   주 : 직선 상에 지수 고밀도 배양 물에서 희석 된 샘플은 초기 지연 / 위상으로부터 유도 접종 배양 물에 비해, 사균 회전율을 통해 최적화 결과에 영향을 미칠 수있다.
2. 30 분 ^6,11,22 1 시간, 파라 포름 알데히드 또는 4 % 포름 알데히드 60 ^℃로 방법을 다음과 같은 70 % 에탄올, 가열 샘플을 사용하여 '죽은'컨트롤로 나머지 절반을 준비합니다. 샘플의 미세 환경의 변화 (예., 산도)를 확인합니다.
   참고 : M.aeruginosa에 긍정적 인, 열 사망, '죽은'컨트롤 피코시 아닌 신호에서의 감소를 통해 '라이브'샘플과 구별된다. 다른 방법으로 사망률을 유도하는 것은 동일한 출력을 일으키지 않습니다 및 VAR 것종 Y.
3. 다른 혼합 비율을 이용하여 시료를 설정 '라이브'와 '죽음의 샘플 (예를 들어, 0 %, 25 %, 50 %, 100 %).
4. 소용돌이로 교반 또는 초음파에 의해 콜로니 형성을들을 분해하여 pH를 확인합니다.
5. 각각의 검출기를 통해 피코시 아닌 신호를 기록하는 488 나노 미터 녹색에서 형광을 기록 할 수있는 검출기와 함께 레이저 (FL1, 530 ± 15 ㎚), 오렌지 (FL2, 585 ± 20 ㎚) 핵산 프로브 및 640 nm의 레이저를 선택합니다.
   주 : DNA에 결합하면 오렌지 핵산 프로브가 570 내지 547 nm에서 방출 최대의 여기 파장을 갖는 반면, 녹색 핵산 프로브는, 523 내지 504 nm의 발광 최대치의 대략 형광 여기 파장을 갖는다. 488 nm의 아르곤 이온 고체 레이저가 모두 분자 프로브를 여기 시키는데 사용될 수 있지만, (547 nm의 최대)가 그린 레이저 높은 오렌지색 형광을 생성 할 것이다.
6. 출발점으로서, 소개제조 업체와 분자 프로브는 50 % '라이브'50 % '죽은'문화 농도를 권장하고 어둠 속에서 부화.
7. 새로운 데이터 셀을 선택 배경 잡음 (FSC-H 80,000)를 줄일 수 임계 값 및 트리거와 SIP에서 샘플을 놓습니다.
8. FSC-H와 SSC-H 매개 변수 및 3 개의 막대 그래프와 밀도 플롯을 작성합니다. 각각의 분자 프로브 광 검출 채널 (FL1 또는 2), 피코시 아닌 한 배출량 (FL4-H) 및 로그 스케일에 다른 FSC-H 모두를 감지를 사용하여 한 히스토그램.
9. 시점 (1, 5, 10, 15, 30 및 60 분)의 전화 번호, 개별 데이터 셀에 기록하는, 최대 60 분간 어둠 속에서 핵산 프로브 M.aeruginosa의 샘플을 배양한다.
   참고 : 특정 화학 물질의 잠재적 인 반응에 제조와 같은 산도 검사 등의 매개 변수를 조정할 때 (시험 핵산에 대한 버퍼가 인산염 또는 일가 또는 디바의 높은 수준을 포함 할 수 없습니다 프로브빌려준 양이온, DNA와 결합이 감소 될 것이다).
10. 각각의 형광 프로브 채널 히스토그램으로, 셀 크기를 유기체 대상에 대한 - 소프트웨어 게이트는 FSC-H의 히스토그램 (1,500,000 320,000)를 포함에 적용됩니다.
    주 :이 프로토콜에서 사용되는 농도의 증가 또는 M.aeruginosa 샘플 또는 핵산 프로브의 초기 재고 용액 부피의 감소 중 하나에 의해 변경 될 수 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 및 100 μM이었다.
11. 형광 프로브 채널에서 가장 높은 히스토그램의 피크 (- 1,650,000, 오렌지 FL2-H, 30,000 - 녹색 FL1-H, 240,000 165,000)에 다른 포괄적 인 소프트웨어 게이트를 적용하고 이후에 게이트 그 밀도 플롯에 긍정적 인 프로브의 형광.
12. 분자 프로브 농도 (예 : X 0.1 X 10) 및 / 또는 온도와 산도 수준 필요한 경우 조정, 100 % "라이브", 100 % '죽은'모든 혼합 배양 샘플 3.11 - 실행 3.1 단계를 반복합니다.
<리> 핵산으로 염색 된 세포의 총 분율을 찾기 위해 (반 총 FSC-H 또는 100 % '죽은'배양에서 촬영) "죽은"셀 원래 셀 밀도에 긍정적 분자 프로브 형광 신호의 수를 비교하여 프로브.
13. 비특이적 염색 (편도 ANOVA 또는 분산 크루스 칼 - 월리스 일방향 분석 수단을 사용하여 제조없이 세포 핵산 프로브 흡수의 최대 백분율에 대한 최적의 프로토콜을 찾기 위해 각각의 농도에서 각각의 시간 기간 동안 이렇게 데이터) 비모수 경우.

4. 분자 프로브 형광 차별

1. 고유 또는 비 특정 세포 염색에서 형광 간섭 / 중복의 테스트를 위해 50 % '라이브'50 % '죽은'혼합 문화의 데이터를 선택하고 모든 게이트를 벗어.
2. 만 FSC-H의 히스토그램 (320,000 - 1,500,000)를 포함하는 소프트웨어 게이트를 적용 대상에 대한 것은 피코시 아닌으로, 셀 크기를 유기체채널 히스토그램.
3. 게이트 '죽은'으로 표시된 가장 낮은 피크의 추가와 함께 '라이브'로 가장 높은 피코시 아닌 피크와 레이블.
4. 평균 파장을 모두 기록, '라이브'다음 '죽은'피코시 아닌 (FL4) 신호를 한 번에 이용하여, 각각의 분자 프로브 형광 히스토그램 채널에 상기 게이트 공정을 수행한다.
   주 :이 실험에서 사망률을 유발 모드는이 프로토콜에 따라 명확 피코시 아닌 신호를 감소 열처리에 의해 이루어졌다. '죽은'세포의 생산 인구의 다른 방법은 획득 한 실행에서 서로 다른 출력을 얻을 수 있습니다.
5. 비 긍정적 인 분자 프로브의 형광 ( '죽은') 및 고유 / 비 특정 신호 ( '라이브')의 평균 파장은 프로토콜의 감도를 결정합니다.
   주 : '라이브'와 '죽은'과 짧은 여행의 형광 차별을 개선하기 위해관리 포인트는 세포벽 투과성이 얻어진 형광 신호 ^(6)를 개선하기 위해 영양분 고갈 된 세포 또는 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)에서 활성 얼룩 흡수에 탄소원을 증가시킨다. 스펙트럼 중첩 일부 FCM 모델 한정 보상 샘플 수집 (PMT 전압 변화) 동안 또는 사후 분석 전문 소프트웨어에서 사용자 조작 페어 보정에 의해 수행 될 수있다.
6. '죽은'세포의 최고 금액이 발생 비특이적 얼룩없이 염색 된 최적화 된 프로토콜을 선택합니다. 테스트의 숫자가있는 경우 비슷한 결과가 좋은 형광 신호 차별과 함께 가장 낮은 농도와 배양 시간 프로토콜을 받아들입니다. 팔로우는 사이토 종료 절차에 대한 지침을 제조하고 있습니다.

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결과

지수 상에 M.aeruginosa 배치 문화에서 앞으로 빛 산란 (FSC)와 측면 빛 산란 (SSC) 출력은 각각 셀 크기 (직경) 및 내부 단위에 대한 정보 (그림 1A)를 제공합니다. FSC는 M.aeruginosa하기에는 너무 큰 및 / 또는 작은 세포를 구별 할 수있다. 이 차별 또는 게이팅은 FSC 출력 (도 1C)의 소정 포인트 사이의 데이터에 의해 정제 할 수있다. 빨간색 광원?...

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토론

^{15,19,22,23 -} 분자 프로브를 사용하여 출판물의 증가 숫자는 믿을 수 있고 정보 데이터는 ^5,6,8를 얻을 수 있음을 나타냅니다. 아직 같은 농도 및 배양 시간 ^6,10 모든 종에 걸쳐 효과적 일 수있다 세포 생존에 대한 완벽한 얼룩은 없습니다. 변경된 형광 방출과 프로브의 같은 종류가 정확한 농도와 항온 처리 시간 (표 1 및 3)을 확립 할 필요를 나타낸다. 이 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid	BD Biosciences	653155	Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min.  Followed by 2 min of sheath H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	by request	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO