Molecular Probe optimisation pour déterminer la mortalité cellulaire dans un organisme photosynthétique (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Par cytométrie en flux

Résumé

Les populations microbiennes contiennent hétérogénéité cellulaire importante, qui peut dicter le comportement global. L'analyse de la sonde moléculaire par cytométrie en flux peut déterminer états physiologiques de cellules, mais son application varie selon les espèces. Cette étude fournit un protocole de déterminer avec précision la mortalité cellulaire dans une population de cyanobactérie, sans sous-estimer ou l'enregistrement des résultats faussement positifs.

Résumé

Sous-populations microbiennes dans les études de terrain et de laboratoire ont été montré pour afficher une forte hétérogénéité dans les paramètres morphologiques et physiologiques. Déterminer l'état en temps réel d'une cellule microbienne va au-delà des catégories vivants ou morts, que les microbes peuvent exister dans un état dormant, où la division cellulaire et activités métaboliques sont réduits. Compte tenu de la nécessité pour la détection et la quantification des microbes, la cytométrie en flux (FCM) avec des sondes moléculaires fournit une méthode rapide et précise pour aider à déterminer la viabilité globale de la population. En utilisant SYTOX vert et SYTOX Orange dans le modèle cyanobactéries Microcystis aeruginosa pour détecter intégrité de la membrane, nous développons une méthode transférable pour une indication rapide de la mortalité d'une cellule unique. Les sondes moléculaires utilisés dans ce journal seront appelées acides nucléiques sondes en vert ou orange, respectivement (bien qu'il y ait d'autres produits avec excitation et d'émission des longueurs d'onde similaires qui ont un mode de actio comparablesn, nous nous référons spécifiquement à l'avant mentionné sondes). Protocoles utilisant des sondes moléculaires varient entre les espèces, qui diffèrent principalement en concentration et d'incubation fois. Suite à ce protocole défini sur M.aeruginosa la sonde d'acide nucléique vert a été optimisé à des concentrations de 0,5 pm après 30 min d'incubation et de la sonde d'acide nucléique d'orange à 1 uM après 10 min. Dans les deux sondes des concentrations inférieures à la valeur optimale déclaré conduit à une sous-déclaration des cellules avec des dommages à la membrane. Inversement, 5 uM concentrations et supérieur dans les deux sondes ont présenté un type de coloration non spécifique, par lequel les cellules «live» produit une fluorescence cible, conduisant à une sur-représentation du nombre de cellules «non viables». Les contrôles positifs (tuées par la chaleur) fournis biomasse morte testable, bien que la pertinence de génération de commande reste sujet à débat. En démontrant une séquence logique d'étapes pour optimiser les vert et orange acide sondes nucléiques Wé demonstrate comment créer un protocole qui peut être utilisé pour analyser l'état physiologique de cyanobactéries efficacement.

Introduction

La cellule est un système complexe qui répond en permanence à l'environnement par la modification des paramètres physiologiques et modifier sa fonction. La dynamique des populations des populations microbiennes isogéniques à la fois dans la nature et le laboratoire sont affectés par le développement des sous-populations, survenant même dans des conditions relativement constants environnementales ^{1 - 3.} La variabilité des communautés microbiennes naturelles se pose en raison de la nature très variable des conditions environnementales. Ces processus parfois stochastiques produisent ensuite des sous-populations qui sont très différents de la moyenne de la population. Des preuves récentes ont révélé que ces sous-populations physiologiques répondent différemment à des conditions ambiantes et peut produire des composés de signal ou des inhibiteurs qui affectent de façon spectaculaire et influent sur ​​l'ensemble de la population ^3,4.

Établir une méthode pour définir l'hétérogénéité au sein d'une population est la clé de l'ONUcompré- l'écologie des microbes dans divers environnements et est essentielle lors de la construction des connaissances des cyanobactéries indésirables, tels que le Microcystis toxiques, ce qui affecte lourdement sur ​​la sécurité humaine de l'eau. Les espèces telles que Anabaena afficher hétérogénéité morphologique en réponse aux fluctuations de l'environnement, le développement des cellules spécialisées comme hétérocystes et akinètes ^2. En revanche, les cellules de Microcystis ne présentent pas l'hétérogénéité morphologique évidente lors d'une réaction de stress. La discrimination entre les cellules viables et non viables est l'aspect le plus important de différenciation physiologique et permet une meilleure compréhension de la dynamique des populations microbiennes. Cependant, le problème conceptuel de la viabilité bactérienne elle-même reste difficile et mal caractérisé ^1,5,6.

La cytométrie en flux (FCM) est une méthode fiable et rapide d'analyse de cellules individuelles. Pour augmenter la compréhension de kiné seule cellulelogie entremise de la FCM, sondes moléculaires ont été utilisés pour distinguer un certain nombre de processus métaboliques et biochimiques ^7. Cela a conduit à une meilleure connaissance des espèces à un niveau cellulaire et de la population et à son tour aidé gestion de l'eau ^8,9. Cependant, les organismes diffèrent en termes de capture de la sonde moléculaire et efflux en raison des pores dans les murs et les pompes et les membranes cellulaires, qui ont conduit à un certain nombre de conception de la sonde moléculaire et la mise en œuvre du protocole ^6,10,11. Sondes moléculaires disponibles à des fins commerciales et de recherche sont souvent fournis avec un protocole générique qui peut être applicable à un type de cellule très différent. Il faut être très prudent dans le transfert de protocoles développés pour un type de cellule à l'autre ^6, il est donc une tâche essentielle pour optimiser sondes moléculaires efficacement avant utilisation.

Les sondes d'acide nucléique vert et orange se lient à la fois des acides doubles et nucléique simple brin avec une base minimale sélectionnezivité et sont utilisés pour évaluer l'intégrité de la membrane plasmique des cellules. La sonde d'acide nucléique vert a un signal de fluorescence de marquage cellulaire nettement améliorée par rapport aux autres sondes moléculaires, tels que les composés à base d'iodure de ^{propidium-12,} qui peut également agir comme un indicateur de la viabilité cellulaire. Le terme «viabilité cellulaire 'ici suppose que la dégradation de l'ADN se produit après la perte de l'intégrité de la membrane plasmique. Les sondes d'acide nucléique sont des colorants cyanine asymétriques avec trois charges positives et ne peuvent pas pénétrer dans les cellules avec des membranes intactes, caractérisé en vertu des concentrations, dans les deux eucaryotes et procaryotes ^{14,15 11,13} organismes. La liaison d'une sonde d'acide nucléique à des acides nucléiques peut entraîner jusqu'à une augmentation d'un facteur> 500 des émissions de fluorescence à partir de signaux endogènes dans des cellules qui ont leur intégrité membranaire compromise. Bien que sondes moléculaires tels que la sonde d'acide nucléique vert peut être un bon indicateur de la physiologie de la cellule unique, il ya un besoin to optimiser chaque sonde avec l'organisme cible prévue, que les temps d'incubation varient de 7 min - 30 min et les gammes de concentration de 0,1 uM - 0,5 pM dans des expériences Microcystis seul ^15-19.

Nous présentons ici un protocole d'optimiser les dosages de cytométrie de vert et relativement nouvelles sondes d'acide nucléique orange (qui à ce jour pas été testé sur les espèces de cyanobactéries M.aeruginosa). La méthodologie développée suivante peut alors être transféré à d'autres espèces et utilisé comme une plate-forme pour l'optimisation de protocoles dans d'autres sondes moléculaires, augmentant ainsi la compréhension des microbes et leur comportement écologique.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Préparation de la sonde moléculaire et Cytomètre de flux

1. Diluer solutions d'achat d'actions des sondes d'acide nucléique, qui sont fournis en tant que solution à 5 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à des parties d'concentrations requises ultrapure filtrée H ₂ O.
2. Stocker les sondes d'acide nucléique dans des conditions d'obscurité entre -5 ^{° C} et - 25 ^{° C} jusqu'à utilisation.
3. Allumez le cytomètre de flux et de logiciel de charge (voir tableau des Matériaux / Équipement pour les spécifications de la FCM).
4. Placez un tube à hémolyse vide (12 x 75 mm) sur la sonde d'injection d'échantillon (SIP), cliquez déboucher, puis de nouveau au ras de commencer le processus de nettoyage de la FCM.
   NOTE: Certaines étapes échantillon pour le SIP peuvent accueillir plusieurs types de tubes, y compris des microtubes. La sonde et la gaine de fluide diluant moléculaire utilisé dans l'appareil FCM est d'une qualité analytique "type 1" membrane de 0,22 um source filtré.
5. Lieuun tube à hémolyse frais avec 2 ml de ultrapure filtrée H _{2 O} sur le SIP, fixer un délai pendant 10 - 15 min et une vitesse de fluide de jeûner (ou un taux de> 66 pi / min).
6. Sélectionnez une nouvelle cellule de données, mis sur les seuils pertinents pour la fluorescence et des canaux de diffusion de la lumière pour réduire le bruit de fond et cliquez sur "Exécuter".
7. Si le total des événements par seconde ne sont pas au-dessous de la recommandation des fabricants, puis exécutez un échantillon de 2 ml de solution de décontamination pendant 2 min sur rapide et puis répétez les étapes 1.4 et 1.5.
   NOTE: S'il vous plaît vérifier les recommandations du fabricant pour FCM démarrage protocoles de nettoyage, car ils peuvent varier selon les modèles. Test des seuils spécifiques doit également être en conformité avec le modèle de la FCM que certains équipements permet à l'utilisateur d'appliquer des tensions gains aux tubes photomultiplicateurs (PMT) renforcement ou à la baisse le signal électrique enregistré par les détecteurs optiques. Le modèle FCM utilisé dans cette expément a fixé PMT de tension et utilisé un seuil de 80.000 prodiffusion lumière (FSC-H) pour exclure les particules inférieures à 2,0 um et de bruit électronique.

2. Préparation de cultures et nombre initial de cellules

1. Autoclave de 98 ml d'H ₂ ultrapure filtrée et O 2 ml de milieu de concentration d'algues (x50) dans un bêcher de 250 ml pendant 20 min à 120 ^{° C}
2. À partir d'une monoculture initiale de M.aeruginosa (PCC 7806) dans un état ​​stable à haute densité lieu 2 ml de l'échantillon dans un tube sous la SIP. Ventiler toute formation de colonies par vortex ou sonication ^{20 et} confirmer cellules réparties de façon égale par microscopie optique.
   NOTE: Une exposition excessive aux ondes ultrasonores peut conduire à la lyse des cellules et doit être utilisé avec prudence. Depuis sonication peut effondrer vésicules de gaz (que l'on trouve des espèces comme M.aeruginosa) sorties tels que la lumière de diffusion latérale (SSC-H) intensité peut devenir plus soinsitive.
3. Dans le logiciel de la FCM, sélectionner un histogramme pour enregistrer des données à partir de l'avant dispersion de la lumière (FSC-H) et configurer les spécifications de l'intrigue en cliquant sur "log" pour afficher dans une échelle logarithmique sur l'axe.
4. Dans une sortie séparée, sélectionnez un autre histogramme (axe log) pour enregistrer la fluorescence naturelle telle que l'accessoire phycocyanine photosynthétique de pigment (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), trouvé dans M.aeruginosa.
5. Utilisez une source de lumière qui peut exciter la phycocyanine et un détecteur qui peut filtrer les émissions résultant de la fluorescence.
   REMARQUE: pigment photosynthétique telle que la chlorophylle peut être excité à l'couramment utilisé 488 nm laser bleu, alors que la phycocyanine est excité de plus de 600 nm et qui ne sera détecté avec une source de lumière rouge ^21. Vérifiez avec le fabricant de cytomètres de flux pour les sources de lumière d'excitation et les spectres de détecteurs d'émission, ici à la fois un 488 nm et d'un laser 640 nm ont été utilisés avecun filtre optique 675 nm ± 12,5.
6. Pour l'enregistrement de la plus haute résolution sélectionner les paramètres les plus proches de la taille de base de l'organisme cible (10 um) et un débit relativement lent (14 pi / min).
   NOTE: Pour les meilleurs échantillons de résolution doit être exécuté selon la fabrique recommandation d'événements par seconde.
7. Avant l'acquisition de données utilisent un seuil de porte à diffusion de la lumière et / ou des signaux de fluorescence qui sont causés par le bruit de fond électronique ou les débris de l'échantillon de cellules.
8. Sélectionnez une nouvelle cellule de données, créer un nuage de densité avec le FSC-H et les paramètres SSC-H sur une échelle logarithmique et cliquez sur Exécuter.
9. Si la densité de l'échantillon conduit à un taux d'événements excessive, des étapes de dilution peuvent être prises pour augmenter la précision et la précision.
10. Sur la parcelle de densité appliquer portes de logiciels à partir de l'histogramme précédente pour exclure des signaux de diffusion de niveau bas, produites par le bruit de fond ou de débris (FSC <320000). Inversement la porte de fluorescence relative plus élevéesignaux de phycocyanine de cellules et ne comprennent que ces événements (FL4, 56.000 - 1.950.000).
11. Utilisez le nombre de cellules enregistrées dans les zones bloquées et le diviser par le volume total de l'échantillon qui a traversé la FCM, à travailler sur la façon de nombreuses cellules par ml.
    NOTE: Le modèle utilisé ici FCM a un système de pompe péristaltique commandé par microprocesseur permettant volume de l'échantillon à déterminer. Autre équipement de la FCM peut exiger une suspension de billes étalonné ou un calcul de H ₂ différences de poids O / volume pour vérifier que le volume total de l'échantillon.
12. Ajouter le volume requis de cellules pour les médias fraîchement préparés afin de commencer un cycle de croissance de lot (250.000 cellules / ml) de M.aeruginosa.
    REMARQUE: Les espèces seront différer des taux de croissance en fonction de leurs paramètres in-situ de l'environnement et de la disponibilité des nutriments, donc un cycle de lot doit être pré-enregistrée pour déterminer les phases du cycle de vie.

3. Optimsation de la sonde moléculaire et cellulaire absorption

1. Récolte moitié de la culture M.aeruginosa préparé à l'étape 2 à partir d'une phase exponentielle et l'utiliser comme un contrôle «en direct».
   Note: Les échantillons dilués à partir d'une culture de haute densité directement à une phase exponentielle peuvent affecter les résultats d'optimisation grâce morts renouvellement cellulaire, par rapport à celle de cultures inoculées à partir d'une phase initiale lag / d'induction.
2. Préparer l'autre moitié comme une «mort» contrôle en utilisant des méthodes telles que 70% d'éthanol, des échantillons de chauffage ^à 60 ° C pendant 1 heure, le paraformaldéhyde ou 4% de formaldéhyde pendant 30 min ^6,11,22. Vérifiez variations dans les échantillons microenvironnement (ex., PH).
   NOTE: Le positif, «morte» le contrôle de la chaleur tués dans M.aeruginosa se ​​distingue d'un échantillon «en direct» à travers sa baisse dans les signaux de phycocyanine. Induisant la mortalité par d'autres méthodes ne peut pas causer la même sortie et Vary en espèces.
3. Mettre en place des échantillons mixtes utilisant différents rapports «en direct» et des échantillons «mort» (par exemple, 0%, 25%, 50%, 100%).
4. Ventiler la formation de colonies par vortex ou ultrasons et contrôler le pH.
5. Sélectionner un laser 488 nm le long de détecteurs qui peuvent enregistrer fluorescence du vert (FL1, 530 ± 15 nm) et orange (FL2, 585 ± 20 nm) sondes d'acide nucléique et le laser de 640 nm pour enregistrer des signaux de phycocyanine par son détecteur respectif.
   REMARQUE: Lorsqu'il est lié à l'ADN, la sonde d'acide nucléique vert a une approximative excitation de fluorescence longueur d'onde de 504 maxima nm et une émission de 523 nm, tandis que la sonde d'acide nucléique d'orange a une longueur d'onde d'excitation de 547 nm et les émissions maxima de 570 nm. Un ion argon à 488 nm laser à l'état solide peut être utilisé pour exciter les deux sondes moléculaires, cependant, un laser vert (547 nm jusqu'à) va produire une fluorescence orange ultérieure.
6. Comme point de départ, introduire lasonde moléculaire avec les fabricants recommandé concentration à la culture 50% «en direct» et 50% «mort» et incuber dans l'obscurité.
7. Sélectionnez une nouvelle cellule de données, placez l'échantillon dans le cadre du SIP avec des seuils et les déclencheurs qui permettront de réduire le bruit de fond (FSC-H 80000).
8. Créez un nuage de densité avec le FSC-H et les paramètres SSC-H, et trois histogrammes. Un histogramme en utilisant le canal respectif de la sonde moléculaire de détecteur optique (FL1 ou 2), de détecter les émissions de phycocyanine (FL4-H) et l'autre FSC-H, le tout sur une échelle logarithmique.
9. Incuber les échantillons de M.aeruginosa avec les sondes d'acide nucléique dans l'obscurité pendant 60 min à, enregistrer dans les cellules de données séparées, à un certain nombre de points (1, 5, 10, 15, 30 et 60 min) temps.
   REMARQUE: Lors du réglage de paramètres tels que la vérification de pH avec les fabricants pour les réactions potentielles de certains produits chimiques (pour l'acide nucléique testé sondes un tampon ne peut pas contenir des phosphates ou des niveaux élevés de monovalent ou divacations prêtés, que la liaison avec l'ADN sera réduit).
10. Appliquer une porte de logiciels pour inclure uniquement les FSC-H histogramme (320.000 - 1.500.000) pour la organismes cibles taille de la cellule, dans le canal de la sonde histogramme de fluorescence respective.
    REMARQUE: Les concentrations utilisées dans ce protocole étaient de 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 et 100 um, qui peuvent être modifiées, soit en augmentant ou en diminuant le volume de l'échantillon M.aeruginosa ou une solution de stock initial de sondes nucléiques.
11. Dans le canal de la sonde de fluorescence, appliquer une autre porte de logiciels compris au plus haut sommet de l'histogramme (vert FL1-H, 240.000 - 1.650.000, orange FL2-H, 30 000 - 165 000) et par la suite porte qui sonde positive de fluorescence dans le complot de densité.
12. Exécuter les étapes 03.01 à 03.11 100% "en direct", 100% «morts» et tous les échantillons de culture mixte, en ajustant les concentrations de sonde moléculaire (par exemple x 0,1 à x 10) et / ou de la température et les niveaux de pH si nécessaire.
13. Comparer le nombre de signaux de fluorescence de sonde moléculaire positifs à la densité cellulaire d'origine des cellules «mortes» (extrait de la moitié du total FSC-H ou une culture 100% «mort») pour trouver le pourcentage total de cellules colorées avec l'acide nucléique sondes.
14. Pour ce faire, pour chaque période de temps dans chaque concentration pour trouver le protocole optimal pour le plus haut pourcentage de nucléique cellulaire sonde absorption sans produire coloration non spécifique (utiliser les moyens dans un One-Way ANOVA ou de Kruskal-Wallis analyse de la variance à un facteur, si les données sont non paramétrique).

4. Molecular Probe fluorescence discrimination

1. Pour les tests de fluorescence interférences / chevauchement de coloration cellulaire intrinsèque ou non spécifique sélectionner les données de 50% «en direct» et 50% «morts» mélangés culture et enlever toutes les portes.
2. Appliquer une porte de logiciel pour inclure uniquement le FSC-H histogramme (320.000 - 1.500.000) pour la cible organismes taille de la cellule, dans la phycocyaninecanal histogramme.
3. Porte le plus haut sommet de la phycocyanine et étiqueter comme «en direct», avec l'ajout de la plus faible pic étiquetés comme «morte».
4. Effectuez une autre étape de la porte dans le canal respectif de l'histogramme de fluorescence de sonde moléculaire, en utilisant un à la fois, les signaux «en direct» puis phycocyanine «mort» (FL4), l'enregistrement de deux longueurs d'onde moyennes.
   REMARQUE: Le mode d'induction de la mortalité dans cette expérience a été réalisée par traitement thermique, qui, en vertu de ce protocole diminue clairement signaux de phycocyanine. Autres méthodes de production de populations de cellules «mortes» peuvent produire différentes sorties dans les essais acquises.
5. Ratio des longueurs d'onde moyennes de la fluorescence moléculaire positif de la sonde («mort») et le signal intrinsèque / non spécifique («live») pour déterminer la sensibilité de protocole.
   NOTE: Pour améliorer la discrimination de fluorescence de 'live' et popul «mort»ations, augmentent la source de carbone à absorption de colorant actif dans les cellules appauvri en éléments nutritifs ou de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour améliorer la perméabilité de la paroi cellulaire et des signaux de fluorescence résultants ^6. Une rémunération limitée dans certains modèles de la FCM pour chevauchement spectral peut être effectuée par la correction par paires manipulé par l'utilisateur lors de l'acquisition de l'échantillon (des variations de tension de PMT) ou à partir d'un logiciel spécialisé post-analytique.
6. Sélectionnez le protocole optimisé où la plus grande quantité de cellules «mortes» a été souillé sans coloration d'apparition non spécifique. Si un certain nombre de tests ont des résultats similaires accepter le protocole avec la concentration et l'incubation, le meilleur temps, avec une bonne discrimination de signal de fluorescence. Suivre les instructions du fabricant pour la procédure d'arrêt cytomètre.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Prodiffusion lumière (FSC) et de la lumière de diffusion latérale (SSC) sorties à partir d'une culture discontinue M.aeruginosa en phase exponentielle fournit des informations sur la taille des cellules (de diamètre) et la granularité interne respectivement (figure 1A). FSC peut distinguer les cellules qui sont trop grands et / ou petits pour être M.aeruginosa. Cette discrimination ou ouverture de porte peuvent être faites p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

L'augmentation du nombre de publications utilisant des sondes moléculaires indique que les données fiables et informatifs peuvent être obtenus ^{5,6,8 - 15,19,22,23.} Pour l'instant il n'y a pas de tache parfaite pour la viabilité cellulaire qui peut être efficace dans toutes les espèces avec la même concentration et la durée d'incubation ^{de 6,10.} Même le même type de sonde avec des émissions de fluorescence altérées montre la nécessité d'établ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid	BD Biosciences	653155	Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µl/min.  Followed by 2 min of sheath H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	by request	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleic acid stain – 5 mM solution in DMSO