Microelectrodos guiada implantación de electrodos en el Subtalámico Núcleo de ratas de largo plazo estimulación cerebral profunda

Resumen

A method for implanting electrodes into the subthalamic nucleus (STN) of rats is described. Better localization of the STN was achieved by using a microrecording system. Furthermore, a stimulation set-up is presented that is characterized by long-lasting connections between the head of the animal and the stimulator.

Resumen

La estimulación cerebral profunda (DBS) es una terapia ampliamente utilizado y efectivo para varios trastornos neurológicos, como la enfermedad, la distonía o temblor de Parkinson idiopática. DBS se basa en el suministro de estímulos eléctricos a lo profundo estructuras anatómicas específicas del sistema nervioso central. Sin embargo, los mecanismos subyacentes el efecto de DBS siguen siendo enigmática. Esto ha dado lugar a un interés en investigar el impacto de DBS en modelos animales, especialmente en las ratas. Como DBS es un tratamiento a largo plazo, la investigación debe centrarse en los cambios moleculares genéticos de los circuitos neuronales que se producen varias semanas después de DBS. A largo plazo DBS en ratas es un reto porque las ratas se mueven alrededor de su jaula, lo que causa problemas en mantener en su lugar el cable que va desde la cabeza del animal al estimulador. Además, las estructuras diana para la estimulación en el cerebro de rata son pequeñas y por lo tanto los electrodos no pueden ser fácilmente colocados en la posición requerida. Así, una puesta a punto para larga duración STIMULAción de ratas utilizando electrodos de platino / iridio con una impedancia de aproximadamente 1 MW fue desarrollado para este estudio. Un electrodo con estas especificaciones permite no sólo la estimulación adecuada, sino también la grabación de las estructuras cerebrales profundos para identificar el área objetivo para DBS. En nuestra puesta a punto, un electrodo con un enchufe para el cable se ha incrustado en el cemento dental con cuatro tornillos de anclaje garantizados en el cráneo. El cable desde el enchufe para el estimulador estaba protegido por un resorte de acero inoxidable. A giratoria se conecta al circuito para evitar que el alambre se enrede. En general, esta estimulación configuración ofrece un alto grado de movilidad libre para la rata y permite que el tapón de cabeza, así como la conexión del cable entre el enchufe y el estimulador, para retener la fuerza de larga duración.

Introducción

La estimulación cerebral profunda (DBS) es un tratamiento basado en la entrega de los impulsos eléctricos a través de electrodos implantados en las estructuras cerebrales específicas, tales como el globo pálido interno globus ^1, el núcleo subtalámico (STN) ^2-4 o el tálamo ventral intermedio ^5. En las dos últimas décadas, este tratamiento se ha establecido como una herramienta terapéutica potente para la enfermedad de Parkinson ^{1 - 4,} distonía ⁶ y el temblor ^7, y también se utiliza para modular el dolor crónico ^7, trastornos psiquiátricos (por ejemplo, trastorno obsesivo-compulsivo ^8, depresión mayor ^{9) o} epilepsia intratable ^10,11. Además, DBS podría, en un futuro, convertirse en una opción de tratamiento para la hipertensión arterial refractaria ^{12 o} hipotensión ortostática ^13.

Los mecanismos fisiológicos que subyacen a los efectosde DBS siguen siendo poco conocidos. Los estudios realizados en roedores anestesiados han proporcionado información sobre las respuestas neuronales a la estimulación de alta frecuencia que imitan clínicamente aplica DBS ^14. Sin embargo, estos estudios no sólo carecen de corroboración del comportamiento del efecto DBS, pero también dan lugar a una considerable variabilidad en función de los parámetros de estimulación aplicada ^14.

Para investigar más concisa los efectos conductuales y mecanismos subyacentes de DBS en roedores conscientes, se necesita una estimulación configuración que cumple con los requisitos específicos. DBS se utiliza principalmente como un tratamiento a largo plazo (por ejemplo, enfermedad de Parkinson, el dolor crónico). Por lo tanto, la estimulación configuración en roedores debe ser diseñado de modo que la unidad consta de un electrodo con un enchufe, así como un cable desde el enchufe a un estimulador externo; y esta unidad debe ser ligero pero irrompible cuando se fija en el cráneo. Por otra parte, la libertad de movimiento es indispensable para ratas durante STIMULAción durante un período prolongado. Las estructuras diana de DBS son pequeñas; Por ejemplo, el STN en ratas tiene una longitud de 1,2 mm y un volumen de 0,8 mm ^3,15. Por lo tanto, los electrodos deben estar diseñados de tal manera que el núcleo no está lesionada durante la inserción y la orientación necesidades para ser precisos. Como la mayoría de los estudios llevados a cabo en roedores DBS han utilizado señal basada en la inserción estereotáxica del electrodo a la estructura de destino, la tasa de error puede ser relativamente alta, incluso cuando se utilizan las coordenadas de acuerdo con Paxinos y Watson ^16. Esto se traduce en un mayor número de animales necesarios para llegar a un resultado estadísticamente significativo.

En el presente estudio se introduce una técnica de implantación de electrodos, que se dirige a la STN con gran precisión mediante el uso de un sistema microrregistro mientras se avanza en el electrodo. Además, un sistema de estimulación se presenta que no sólo permite un alto grado de movilidad para el animal estimulado pero también garantiza stimulati continuaen medio de una fijación segura del cable de estimulación (que está protegida por un resorte de acero inoxidable) en la cabeza de la rata.

Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por la Universidad de Würzburg y las autoridades estatales legales (Baja Franconia, número de homologación: 54-2531.01-102 / 13) y realizado de acuerdo con las recomendaciones para la investigación en el accidente cerebrovascular experimental estudia ¹⁷ y la corriente de Investigación de Animales: Notificación de En Vivo Directrices Experimentos (http://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Anestesia

1. Compruebe el sistema de anestesia para garantizar cantidades adecuadas de suministro de gas (oxígeno) y el isoflurano durante la duración del procedimiento. Conecte el cono de nariz con la barra incisivo del instrumento estereotáxico y poner la barra de incisión en -3.3 mm.
2. Encienda el suministro de gas (2 l / min). Coloque la rata en una caja y sellar la parte superior. Encienda el vaporizador isoflurano al 3,5%.
3. Cuando la rata es reclinada, conmutar el sistema de modo que el gas anestésico fluye hacia el cono de nariz que se fija a la barra de incisión.
4. Retire la rat de la cámara de caja y afeitar el área entre las orejas y los ojos; utilizando un bastoncillo de algodón empapado con Jodosept PVP, limpiar la zona afeitada para quitar cualquier pelo suelto.
5. Coloque la rata en el cono de nariz (Figura 1) y continuar la anestesia con isoflurano 2,5% en O ₂ (1 L / min). Compruebe el nivel de anestesia pellizcando la zona interdigital. Si la rata se anestesia adecuada, los reflejos defensivos son abolidos (es decir, la retirada de los pies).
6. Monitorear la respiración y la respuesta a la estimulación durante el procedimiento y ajustar el vaporizador según sea necesario.
7. Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Controlar y mantener la temperatura corporal a 37 ± 0,5 ° C por un sistema de calefacción de retroalimentación controlada.

2. Cirugía

1. Mantenga el campo quirúrgico estéril durante toda la cirugía. Una vez que las manos del cirujano son estériles y el campo operatorio es estéril, mover sólo carefully y recordar para no romper la esterilidad. Esto incluye tener también un campo estéril (es decir, cortinas impermeables estériles) en el que uno puede establecer instrumentos.
2. Inyectar 0,2 ml por vía subcutánea en la mepivacaína el centro de la zona afeitada. La mepivacaína es un anestésico local que tiene una duración de acción de hasta 3 hr. Será más anestesiar el área quirúrgica.
3. Usando un bisturí, hacer una incisión en la línea media de inicio entre las orejas y se extiende hacia 2 cm. Asegúrese de que el periostio (membrana brillante bajo la piel) también se realiza una incisión. Exponer el cráneo con cuatro abrazaderas (Figura 2).
4. El uso de un bastoncillo de algodón, retire suavemente el periostio hasta que se exponen las suturas coronal y sagital; a partir de entonces, restañar la sangre con un algodón.
5. Determinar las coordenadas del bregma utilizando una aguja fijada en un soporte de la sonda, y luego marcar la punta de la aguja con un rotulador negro. Utilizando el anterior / posterior (AP), la línea media / lateral(ML) y los tornillos (DV) de accionamiento dorsoventral, coloque la punta de la aguja directamente sobre el bregma.
6. Tome la AP y ML lecturas de la escala vernier: restar 3,6 mm de la lectura AP y 2,5 mm de la lectura ML para la implantación de electrodos en el STN derecha, o añadir 2,5 mm para la implantación de electrodos en el STN izquierda. Esta posición estará marcado por el tinte del rotulador después de bajar la punta de la aguja a la superficie del cráneo.
7. Sujete el taladro dental en el soporte de la sonda grande del instrumento estereotáxico. Mueva el taladro dental a la superficie calculada - es decir, el punto marcado en el cráneo. Mirando a través del microscopio, perforar un agujero (diámetro de aproximadamente 1 mm) a través del cráneo hasta la duramadre es visible (el cráneo es de aproximadamente 1 mm de espesor). Repliegue la duramadre utilizando pinzas de micro-disección o una aguja estéril. La duramadre es lo suficientemente fuerte como para destruir la punta del electrodo.
8. Perforar un agujero con el taladro dental en cada escama frontal, y en el interparietal squama opuesta al agujero electrodo. Desconecte el titular de la sonda del instrumento estereotáxico. No taladre en una sutura del cráneo como vasos venosos siguen las suturas bajo el cráneo.
9. Atornillar un tornillo de hueso en cada uno de los cinco agujeros. Evite enhebrar los tornillos en las zonas profundas. Para tornillos de acero inoxidable (M1.6), 2-3 vueltas de tuerca llevará a cabo de manera adecuada el tornillo sin poner presión sobre el cerebro. El número de vueltas dependerá del paso del tornillo. Fije el soporte de la sonda con el electrodo en el micromanipulador (Figura 3).
10. Utilizando los tornillos de la unidad de AP, ML y DV, mueva el soporte de la sonda con el electrodo hasta que la punta está casi tocando el bregma. Tenga en cuenta las lecturas de la escala vernier AP, ML y DV en el bregma. Cuando se realizan las lecturas, elevar el electrodo de unos pocos milímetros para evitar que el electrodo de raspar el cráneo durante el movimiento. Para determinar las coordenadas de la posición en la que el electrodo tiene que ser insertado enal agujero, añada 3,6 mm a la lectura AP y añadir (o restar) 2,5 mm a la lectura ML.
11. Con los tornillos de accionamiento AP y ML, mover el electrodo a la posición calculada. En este punto, la punta del electrodo debe estar situado directamente sobre el agujero perforado electrodo. Entonces, mirando a través del microscopio, bajar el electrodo al nivel de la duramadre (Figura 4). Este nivel sirve como nivel cero en la dirección DV. A partir de entonces, inserte suavemente la punta del electrodo en el cerebro mirando a través del microscopio.
12. Conectar el pasador de electrodo al conector del sistema de grabación. Ponga una jaula de Faraday (o sustituirlo con papel de aluminio) sobre la rata en el instrumento estereotáxico (Figura 5). Conecte a tierra el instrumento estereotáxica con el contrapeso de la habitación que se está trabajando en.
13. Inicie el sistema de grabación. Si está disponible, también utilizar un altavoz para obtener una señal acústica de las descargas / bálsamos de unidades individuales durante advancing electrodo.
14. Lentamente insertar el electrodo en el cerebro mediante el registro de la actividad eléctrica durante el avance del electrodo. A una profundidad de entre 7,5 y 8,1 mm desde la duramadre, la actividad eléctrica específica de la STN es generalmente detectable (Figura 6). ^18: La actividad típica de neuronas en el STN se caracteriza por un patrón de disparo irregular y una alta tasa de disparo (40,9 ± 12,9 Hz de frecuencia media).
15. Durante la grabación, la anestesia reducir tanto como sea posible (por ejemplo, a 0,8 a 1,0%); animales anestesiados con bajas muestran una actividad cerebral eléctrica más clara.
16. Hisopo basura cualquier sangre o líquido cefalorraquídeo que se desplaza en la superficie del cráneo al bajar el electrodo.
17. Mezcle una pequeña cantidad de cemento dental y aplicarlo alrededor del electrodo y alrededor de cuatro de los cinco tornillos con una pequeña espátula (Figura 7). El quinto tornillo se utiliza para fijar el cable a tierra de la clavija.
18. Desconectar el pasador de electrodo de la pinza portaelectrodos y el conector del sistema de grabación cuando el cemento dental es fijo.
19. Aflojar el tornillo que no se fija con cemento dental. Ponga el tapón en el pasador de electrodo. Fije el cable de tierra de la clavija con el quinto tornillo (Figura 8).
20. Mezcle cemento dental y aplicarlo alrededor del tapón. Como el cemento se espesa, moldearla alrededor del tapón para formar una tapa. Evite los bordes afilados del cemento dental que puede dañar al animal y eliminarlos durante el endurecimiento (Figura 9A y B).
21. Desbride bordes de la herida y cerca de ellos con una sutura en la parte delantera y detrás de la tapa. Desinfectar los bordes de la herida.
22. Conecte el enchufe de la cabeza al cable que se fija sobre un pivote. Retire la rata del instrumento estereotáxico.
23. Aplicar tramadol (12,5 mg / kg, por vía intraperitoneal) en el final de la intervención y luego una vez al día durante 2-3 días. Coloque la rata en una jaula limpia con Thermal apoyo, fijar la pieza giratoria en esta jaula (Figura 10) e inspeccione cuidadosamente durante 1 hora.
24. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que se ha sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere totalmente.

3. Estimulación

1. Determinar la resistencia en el animal antes de la estimulación utilizando un medidor de impedancia.
2. Conectar el enchufe del eslabón giratorio con un alambre y los tapones en el otro extremo del alambre con la salida de corriente y la salida para el cable de tierra del estimulador. Conecte el estimulador con un ordenador con el fin de programar el estimulador.
3. Elija los parámetros de estimulación en el programa; por ejemplo, los parámetros utilizados en la enfermedad de Parkinson son la longitud de pulso: 60 microsegundos; Frecuencia: 130 Hz. Estimular la rata con una amplitud de la corriente cada vez mayor hasta que se reconocen discinesia. Reducir ªe intensidad eléctrica en un 10-20% por debajo de la intensidad que provocó discinesia o hasta que desaparezcan los signos neurológicos y el animal es cómodo. Pulsos rectangulares monofásicos se utilizaron en este estudio.
4. Después de completar el experimento, la eutanasia a los animales con isoflurano: Ajuste el caudal isofurane o concentración de 5% o más. Continúa la exposición isoflurano hasta 1 minuto después de la respiración se detiene.

Resultados

La implantación de un electrodo dentro de la STN de una rata utilizando un sistema de grabación - tal como se presenta aquí - es un procedimiento eficaz y preciso para DBS que tarda aproximadamente 1 hr por animal. Este modelo es un procedimiento bastante menor: de cada 10 ratas sometidas a cirugía, todos sobrevivieron a la intervención. Veinticuatro horas después de la intervención, el estado de cada rata se monitorizó y ningún animal logra más de 1 de 3 puntos según el código de gravedad. Durante el perío...

Discusión

Este estudio presenta un conjunto paso a paso las instrucciones para la implantación de un electrodo monopolar crónica en el STN de ratas. Aunque electrodos de tungsteno con baja impedancia se utilizan a menudo para DBS ^18,19, un electrodo monopolar de platino / iridio (Pt / Ir) fue empleado que tenía una impedancia de aproximadamente 1 MW. Electrodos de Pt / Ir también se utilizan en pacientes con la enfermedad de Parkinson debido a sus propiedades favorables: demuestran la erosión mínima ^20...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pt/Ir electrode	FHC Inc.	UE	Custom-made: Specification: UEPSEGSECN1M
Plugs	GT Labortechnik (Arnstein/Germany)		Custom-made
Pin header	DISTRELEC	143-95-324	single-row, 90° 1x3 datamate, Type M80-8420342
Socket	DISTRELEC	143-95-621	single-row,straight 2 mm pole no.1 x 3 datamate, Type M80-8400342
Stainless steel spring	Plastics ONE	SS0102	Part-#: .120 X .156 Spring ID (mm): 3.0  Spring OD (mm): 4.0
Dental cement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707938	Liquid, 500 ml
Dental cement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707954	Powder, rose, 500 g
Head screw	Hummer & Reiss	V2ADIN84 M1.6x3
Jodosept PVP	Vetoquinol		435678/E04
Mepivacain 1%	AstraZeneca		PZN03338515
Epinephrine	Sanofi-Aventis		PZN00176118
Tramadolhydrochloride	Rotexmedica		38449.00.00