Mikroelektrod Uzun vadeli Derin Beyin Stimülasyonu için Sıçan Subtalamik Nucleus içine elektrotlar implantasyonu Rehberli

Özet

A method for implanting electrodes into the subthalamic nucleus (STN) of rats is described. Better localization of the STN was achieved by using a microrecording system. Furthermore, a stimulation set-up is presented that is characterized by long-lasting connections between the head of the animal and the stimulator.

Özet

Derin beyin stimülasyonu (DBS) gibi idiyopatik Parkinson hastalığı, distoni veya titreme gibi çeşitli nörolojik bozukluklar için yaygın olarak kullanılan ve etkili bir tedavi yöntemidir. DBS santral sinir sisteminin belirli derin anatomik yapılara elektrik uyaranlara teslim dayanmaktadır. Ancak, DBS etkisi altında yatan mekanizmalar esrarengiz kalır. Bu, özellikle sıçanlarda hayvan modellerinde DBS etkisini araştıran bir ilgi yol açmıştır. DBS uzun vadeli bir tedavi olduğu için, araştırma DBS haftalarca sonra ortaya nöral devrelerin moleküler genetik değişiklikler odaklı olmalıdır. Sıçanlar yerinde stimülatörü hayvanın başının önde gelen tel tutarak sorunlara neden onların kafes içinde hareket nedeniyle sıçanlarda Uzun vadeli DBS zordur. Bundan başka, sıçan beyninde uyarımı için hedef yapılar küçük ve bu sebepten, elektrotlar kolayca gerekli pozisyonda yerleştirilemez. Böylece, uzun ömürlü stimula için bir set-upyaklaşık 1 M? empedansa sahip platin / iridyum elektrotlar kullanılarak sıçan edilmesi bu çalışma için geliştirilmiştir. Bu özelliklere sahip bir elektrot yeterli uyarılması aynı zamanda DBS için hedef bölgeyi tanımlamak için derin beyin yapıları kayıt sadece sağlar. Bizim set-up, tel bir fiş bir elektrot kafatası üzerine sabitlenmiş dört adet ankraj vida ile diş çimento gömülü edilmiştir. Stimülatörü fiş tel, paslanmaz çelik yay ile koruma altına alınmıştır. Bir döner Dolaşmasını tel önlemek için devresine bağlanmıştır. Genel olarak, bu uyarım set-up sıçan için ücretsiz hareketlilik yüksek derecede sunmaktadır ve uzun ömürlü gücünü korumak için baş fişi yanı sıra fişi ve stimülatör arasındaki kablo bağlantısını mümkün kılar.

Giriş

⁴ veya ventral orta talamus ^{5 -} Derin beyin stimülasyonu (DBS), iç globus pallidusta ^1, subtalamik nükleus (STN) ² gibi özel serebral yapılara yerleştirilmiş elektrotlar aracılığıyla elektrik uyarılarının teslim dayalı bir tedavi yöntemidir. Son yirmi yıl içinde, bu tedavi Parkinson hastalığı ¹ için güçlü bir tedavi aracı olarak tespit edilmiş olan ^{- 4,} distoni ⁶ ve tremor ^7, ve aynı zamanda kronik ağrı ^7, ruhsal bozukluklar (modüle etmek için kullanılır, örneğin, obsesif-kompulsif bozukluk ^8, majör depresyon ^{9) veya} dirençli epilepsi ^10,11. Ayrıca, DBS, gelecekte, refrakter arteriyel hipertansiyon ^{12 veya} ortostatik hipotansiyon ¹³ için bir tedavi seçeneği haline gelebilir.

Etkilerinin altında yatan fizyolojik mekanizmalarDBS anlaşılan kötü kalır. Anestezi kemirgenlerde çalışmalar klinik DBS ¹⁴ uygulanan taklit eden yüksek frekanslı stimülasyon sinir yanıtları içgörü sağladı. Bununla birlikte, bu çalışmalar, DBS etkisi davranışsal doğrulanmasını eksikliği değil, aynı zamanda ¹⁴ uygulanan uyarım parametrelerine bağlı olarak hatırı sayılır bir değişkenliğe yol açar.

Daha özlü bilinçli kemirgenlerde DBS davranışsal etkilerini ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için, bir uyarım set-up özel gereksinimlerini yerine getirdiğini ihtiyaç vardır. DBS, çoğunlukla uzun vadeli tedavisi olarak kullanılmaktadır (örneğin, Parkinson hastalığı, kronik ağrı). Cihaz, bir tıkaç, hem de bir dış stimülatörü tapasından bir tel ile bir elektrot ihtiva etmektedir Bu durumda, kemirgenlerde stimülasyon kurulumu tasarlanmalıdır; kafatası üzerine sabit zaman ve bu birim hafif ama kırılmaz olmalıdır. Ayrıca, dolaşım özgürlüğü stimula sırasında sıçanlar için vazgeçilmezdiruzun bir süre boyunca tion. DBS hedef yapılar küçük; Örneğin, sıçanlarda STN 1,2 mm'lik bir uzunluğa ve 0,8 mm ^3,15 arasında bir hacme sahiptir. Bu nedenle, elektrotlar çekirdeği yerleştirilmesi sırasında lezyonlu değildir ve ihtiyaçlarını hedef kesin olmak gerekirse bu tür tasarlanmış olması gerekir. Kemirgenlerde yapılan en DBS çalışmaların, hedef yapısı elektrot merkezi nokta stereotaktik ekleme kullanılan gibi, hata oranı Paxinos ve Watson'un ¹⁶ uygun koordinatlarla zaman da göreli olarak yüksek olabilir. Bu istatistiksel olarak anlamlı bir sonuca ulaşmak için gerekli olan bir hayvan, daha fazla sayıda sonuçlanır.

Bir elektrot implantasyon tekniği tanıtıldı Bu çalışmada, bu elektrot ilerleyen sırasında microrecording sistemi kullanılarak yüksek doğrulukta STN hedefliyor. Buna ek olarak, bir stimülasyon sistemi sadece uyarılan hayvan için hareketlilik yüksek derecede sağlar ama aynı zamanda sürekli bir uyanm garanti etmez sunulmuşturSıçan başkanı üzerine (bir paslanmaz çelik yayı tarafından korunan) stimülasyon tel güvenli sabitlenmesi via.

Protokol

Deneysel inme araştırma için önerilere göre ve gerçekleştirilen ¹⁷ çalışmaları ve mevcut hayvan Araştırma: Hayvan deneyleri Würzburg Üniversitesi ve yasal devlet yetkilileri (54-2531.01-102 / 13 Aşağı Franken, onay numarası): tarafından onaylanmıştır Raporlama Vivo Deneyler Rehberinde (http://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Anestezi

1. Prosedürün süresi boyunca besleme gazı (oksijen) ve izofluran yeterli miktarda sağlamak için anestezik sistemini kontrol edin. Stereotaksik enstrümanın kesici çubuğu ile Roket ucu konisi bağlayın ve -3.3 mm kesici bar koymak.
2. Besleme gazının (/ dak 2 L) açın. Bir kutunun içine sıçan yerleştirin ve üst mühür. % 3.5 izofluran buharlaştırıcı açın.
3. Sıçan yaslanmış olduğunda anestezik gaz kesici çubuğuna sabitlenir roket ucu konisi akar, böylece sistemini açmak.
4. Ra kaldırkutu odasından t ve kulakları ve gözleri arasındaki bölgeyi traş; Jodosept PVP ile ıslatılmış bir pamuk kullanarak, gevşek saç kaldırmak için traş bölgeyi sürüntü.
5. Roket ucu konisi (Şekil 1) 'de sıçan yerleştirin ve O ₂ (/ dk 1 L) içinde% 2.5 ile izofluran anestezi devam edin. Interdijital alan sıkıştırarak anestezi seviyesini kontrol edin. Sıçan yeterli anestezi ise, defansif refleksler (ayak, yani geri çekilmesini) yürürlükten kaldırılmıştır.
6. İşlem sırasında uyarılmaya solunum ve tepki izlemek ve gerektiğinde buharlaştırıcı ayarlayın.
7. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem sürün. Monitör ve bir geri besleme kontrollü ısıtma sistemi ile 37 ± 0.5 ° C 'de vücut ısısını korumak.

2. Cerrahi

1. Bütün cerrahi sırasında steril cerrahi alan tutun. Cerrahın elleri steril ve çalışma alanı steril sonra, sadece dikkatli bir şekild hareketLly ve sterilite kırmamaya hatırlıyorum. Bu aynı zamanda bir aletleri aşağı ayarlayabilirsiniz hangi steril bir alan (yani, steril su geçirmez örtüler) sahip içerir.
2. Traş alanın merkezi haline mepivakain subkutan 0.2 ml enjekte edilir. Mepivakain 3 saat kadar etki süresi olan bir lokal anesteziktir. Ayrıca, cerrahi alan uyutmak olacaktır.
3. Bir neşter kullanılarak, bir orta hat kesi kulak arasındaki başlayan ve 2 cm doğru uzanan olun. Periost (cilt altında parlak membran) da kazıma emin olun. Dört kelepçeleri (Şekil 2) ile kafatası Açığa.
4. Koronal ve sagital sütür maruz kadar pamuk kullanarak, yavaşça çıkarın periost; bundan sonra, pamuk ile kan durdurmak.
5. Bir prob tutucu sabit bir iğne kullanarak bregma koordinatlarını belirlemek ve daha sonra siyah bir keçeli kalem ile iğne ucu işaretleyin. Ön / posterior (AP) kullanarak, orta hat / yanal(ML) ve dorsoventral (DV) sürücü vida, doğrudan bregma üzerinde iğne ucu yerleştirin.
6. AP ve ML sürmeli ölçekli okumalarını atın: Sağ STN içine elektrot implantasyonu için ML okuma AP okuma 3.6 mm ve 2.5 mm çıkarmak, ya da sol STN içine elektrot implantasyonu için 2.5 mm ekleyin. Bu pozisyon kafatasının yüzeyine iğne ucu düşürdükten sonra keçeli kalem boyası ile işaretlenir.
7. Stereotaksik enstrümanın büyük prob tutucu üzerine diş matkap kelepçe. Yani, kafatası üzerinde belirgin nokta - hesaplanmış alan diş matkap taşıyın. Dura görünür oluncaya kadar mikroskop ile bakıyor, (kafatası yaklaşık 1 mm kalınlığında) kafatası yoluyla bir delik (çapı yaklaşık 1 mm) delin. Mikro-diseksiyon forseps veya steril bir iğne kullanılarak dura geri çekin. Dura elektrot ucu yok etmek için yeterli zordur.
8. Her frontal skuam diş matkap ile bir delik delin ve intelektrot deliğe erparietal squama tersi. Stereotaksik cihazdan prob tutucu çıkarın. Venöz damarlar kafatasının altında sütür aşağıdaki gibi bir kafatası sütür üzerinde sondaj etmeyin.
9. Beş deliklerin her birine bir kemik vidasını sıkın. Çok derin vida diş kaçının. Paslanmaz çelik vidalarla (M1.6) için, 2-3 yeterince beyin üzerinde baskı olmadan vida yapacak vida döner. Sarım sayısı vidanın son bağlıdır. Mikromanipülatör elektrot (Şekil 3) ile prob tutucu Kelepçe.
10. Ucu neredeyse bregma dokunmadan kadar AP, ML ve DV sürücü vida kullanarak, elektrot ile prob tutucu hareket ettirin. Bregmadan AP, ML ve DV sürmeli ölçekli okumaları unutmayın. Okumalar yapıldığında, hareket sırasında kafatası kazıma elektrot önlemek için elektroda birkaç milimetre kaldırın. Elektrot içine yerleştirilmek üzere nerede pozisyonda koordinatlarını belirlemekdelik, ML okuma 2.5 mm AP okuma 3.6 mm ekleyebilir ve eklemek (veya çıkarmak).
11. AP ve ML sürücü vidasını kullanarak hesaplanan pozisyona elektrodu taşıyın. Bu noktada, elektrot ucu açılmış elektrot deliğinin üzerine doğrudan yer olmalıdır. Ardından, mikroskop bakarak, dura (Şekil 4) seviyesine elektrodu indirin. Bu seviye DV yönde sıfır düzeyi olarak hizmet vermektedir. Bundan sonra, yavaşça mikroskop bakarak beyne elektrot ucu yerleştirin.
12. Kayıt sisteminin konnektörüne elektrot pimini takın. Bir Faraday kafesi koyun (ya da alüminyum folyo ile yerine) stereotaksik alet sıçan (Şekil 5) üzerinde. Çalışmış olan odanın denge unsuru ile stereotaksik aleti topraklayın.
13. Kayıt sistemini başlatın. Varsa, aynı zamanda advancin sırasında boşalmalar / tek birimlerin salves bir akustik sinyal elde etmek için bir hoparlörü kullanmakg elektrot.
14. Yavaşça elektrot ilerleyen sırasında elektrik aktivitesini kaydederek beyin içine elektrot yerleştirin. Dura 'dan 7.5 ila 8.1 mm'lik bir derinlikte, STN özgül elektrik aktivitesi, genellikle tespit edilebilir (Şekil 6). ^18: STN nöronların tipik faaliyeti düzensiz ateşleme deseni ve yüksek atış hızı ile karakterizedir (40.9 ± 12.9 Hz frekans demek).
15. Kayıt sırasında, (0.8-1.0% kadar, örneğin) mümkün olduğunca anestezi azaltmak; Düşük anestezi hayvanların net bir elektrik beyin aktivitesi gösterir.
16. Elektrot düşürücü zaman kafatasının yüzeyinde yerinden edildi herhangi bir kan ya da beyin omurilik sıvısı uzağa çubukla.
17. Diş çimento küçük bir miktar kadar karıştırın ve elektrot çevresinde ve küçük bir spatula (Şekil 7) kullanarak beş vida dört etrafına uygulayın. Beşinci vida tapası topraklama kablosunu sabitlemek için kullanılacak.
18. Diş çimento sabit zaman kayıt sisteminin elektrot tutucu ve konnektör gelen elektrot pimini çıkarın.
19. Diş çimento ile sabit değildi vidayı sökün. Elektrot pin fişini takın. Beşinci vida (Şekil 8) ile fişin topraklama kablosunu sabitleyin.
20. Diş çimento kadar karıştırın ve fiş etrafında uygulayın. Çimento kalınlaştırır gibi, bir kap oluşturmak için fiş etrafında kalıp. Hayvana zarar ve (Şekil 9A ve B) sertleşme sırasında bunları kaldırabilir diş çimento keskin kenarları kaçının.
21. Yara kenarları debridman ve ön ve kapak arkasında bir dikiş ile kapatın. Yara kenarları dezenfekte edin.
22. Bir döner üzerine monte edilmiştir tel baş takın. Stereotaksik aletten sıçan çıkarın.
23. 2-3 gün süreyle günde bir kez daha sonra müdahale sonunda tramadol (12,5 mg / kg, intraperitonal olarak) uygulayınız. TES temiz bir kafeste sıçan yerleştirinl desteği, bu kafeste (Şekil 10) üzerine döner düzeltmek ve 1 saat dikkatle inceleyin.
24. Sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin.

3. Uyarım

1. Bir empedans ölçer kullanılarak stimülasyon önce hayvanda direncini belirlemek.
2. Bir tel ve akım çıkışı ile telin öbür ucunda fişleri ve stimülatör zemin tel çıkışı ile döner fişini prize takınız. Stimülatörü programlamak için bir bilgisayar ile uyarıcı bağlayın.
3. Programda stimülasyon parametreleri seçin; Örneğin, Parkinson hastalığı için kullanılan parametreler darbe uzunluğu vardır: 60 mikro-sn; Frekans: 130 Hz. Diskinezi tanınan dek artan bir akım genliği ile sıçan Canlandıracak. Th azaltındiskinezi ortaya çıkardı yoğunluğu altında% 10-20 ya da nörolojik belirtiler kaybolur ve hayvan rahat olana kadar e elektrikli şiddeti. Monofazik dikdörtgen darbe bu çalışmada kullanılmıştır.
4. Deney tamamlandıktan sonra, izofluran ile hayvan euthanize:% 5 ya da daha büyük isofurane akış hızı veya konsantrasyonu ayarlayın. Durur nefes sonra 1 dakika kadar izofluran pozlama devam edin.

Sonuçlar

Bir kayıt sistemini kullanarak bir sıçan STN içine bir elektrot implante - Burada sunulan - hayvan başına yaklaşık olarak 1 saat sürer DBS etkili ve doğru bir yöntemdir. Bu model oldukça küçük bir işlemdir: cerrahiye maruz 10 sıçan üzerinden, tüm müdahale kurtuldu. Yirmi dört saat müdahalesinden sonra, her sıçanın devlet izlendi ve hiçbir hayvan şiddeti koduna göre en fazla 1 ila 3 puan elde etti. Sürekli stimülasyon dönemi (14 gün, 24 saat, bir gün) boyunca, müstakil hiçbir tel, kır...

Tartışmalar

Bu çalışma, sıçanların STN içine monopolar kronik elektrot implante için talimatlar adım adım seti sunuyor. Düşük empedanslı tungsten elektrot genellikle DBS ^18,19, platin / iridyum (Pt / ir) 1 M? Empedans olduğu kullanıldı yapılmış bir tek kutuplu elektrot için kullanılır, ancak. Pt / Ir elektrodlar da nedeniyle olumlu özellikleri, Parkinson hastalığı olan hastalarda kullanılır: minimal erozyon ²⁰ göstermekte ve herhangi bir yüksek yük yoğunlukları kullanıl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pt/Ir electrode	FHC Inc.	UE	Custom-made: Specification: UEPSEGSECN1M
Plugs	GT Labortechnik (Arnstein/Germany)		Custom-made
Pin header	DISTRELEC	143-95-324	single-row, 90° 1x3 datamate, Type M80-8420342
Socket	DISTRELEC	143-95-621	single-row,straight 2 mm pole no.1x3 datamate, Type M80-8400342
Stainless steel spring	Plastics ONE	SS0102	Part-#: .120 X .156 Spring ID (mm): 3.0  Spring OD (mm): 4.0
Dental cement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707938	Liquid, 500 ml
Dental cement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707954	Powder, rose, 500g
Head screw	Hummer & Reiss	V2ADIN84 M1.6x3
Jodosept PVP	Vetoquinol		435678/E04
Mepivacain 1%	AstraZeneca		PZN03338515
Epinephrine	Sanofi-Aventis		PZN00176118
Tramadolhydrochloride	Rotexmedica		38449.00.00