Микроэлектродные Руководствуясь вживления электродов в субталамического ядра крыс для долгосрочного Глубокая стимуляция мозга

Резюме

A method for implanting electrodes into the subthalamic nucleus (STN) of rats is described. Better localization of the STN was achieved by using a microrecording system. Furthermore, a stimulation set-up is presented that is characterized by long-lasting connections between the head of the animal and the stimulator.

Аннотация

Глубокая стимуляция мозга (DBS) является широко используемым и эффективной терапии в течение нескольких неврологических расстройств, таких как идиопатической болезни Паркинсона, дистонии или тремора. DBS основан на поставку электрических стимулов к конкретным глубоких анатомических структур центральной нервной системы. Тем не менее, механизмы, лежащие в действие DBS остаются загадочными. Это привело к заинтересованности в расследовании воздействие DBS в животных моделях, особенно у крыс. Как DBS является длительная терапия, исследование должно быть сосредоточено на молекулярно-генетических изменений нейронных цепей, которые происходят через несколько недель после DBS. Долгосрочный DBS у крыс является сложной задачей, потому что крысы передвигаться в их клетке, которая вызывает проблемы в соответствии в месте провод, ведущий от головы животного к стимулятора. Кроме того, целевые структуры для стимуляции мозга крыс малы и, следовательно, электроды не могут быть легко размещены в требуемом положении. Таким образом, установка для длительной Stimulaние крысах с использованием платины / иридия электроды с сопротивлением около 1 МОм был разработан для этого исследования. Электрод с этими спецификациями позволяет не только адекватной стимуляции, но и записи глубинных структур головного мозга, чтобы определить целевую область для DBS. В нашем настройки, электрод с вилкой для провода был встроен в стоматологической цемента с четырьмя винтами, обеспеченных анкерных на черепе. Провод от штекера стимулятора был защищен нержавеющей стальной пружиной. Вертлюг был подключен к цепи, чтобы предотвратить провод от запутывания. В целом, это стимуляция настройки предлагает высокую степень свободного передвижения для крысы и позволяет голову вилку, а также подключение проводов между пробкой и стимулятора, чтобы сохранить длительный силу.

Введение

Глубокая стимуляция мозга (DBS) является лечение, основанное на поставку электрических импульсов через имплантированные электроды на конкретные структуры головного мозга, таких как внутреннее бледного шара ^1, гипоталамический ядро (STN) ^{2 - 4} или вентральной промежуточного таламуса ^5. В последние два десятилетия, это лечение было установлено в качестве мощного лечебного средства для лечения болезни Паркинсона ^{1 - 4,} дистония ^{6 и} тремор ^7, а также используется для модуляции хроническая боль ^7, психические расстройства (т.е., обсессивно-компульсивное расстройство ^8, депрессия ^{9) или} неразрешимыми эпилепсии ^10,11. Кроме того, DBS может, в будущем, стать вариантом лечения для огнеупорной артериальная гипертензия ^{12 или} ортостатической гипотензии ^13.

Физиологические механизмы, лежащие в основе эффектовОБН-прежнему плохо изучены. Исследования, проведенные в наркозом грызунов предоставили понимание нейронных ответов на высокочастотной стимуляции, которые имитируют клинически прикладной DBS ^14. Тем не менее, эти исследования не только не имеют поведенческие подтверждение эффекта DBS, но и привести к значительному изменчивости в зависимости от параметров стимуляции применяется ^14.

Чтобы исследовать более лаконично поведенческие эффекты и механизмы, лежащие в основе DBS в сознании грызунов, стимуляция настройки необходимо, что соответствует требованиям. DBS в основном используется в качестве долговременной терапии (например, болезнь Паркинсона, хронической боли). Таким образом, стимуляция настройки у грызунов должен быть разработан таким образом, что блок состоит из электрода с вилкой, а также провод от клеммы к внешнему стимулятора; и это устройство должно быть легким, но нерушимая, когда фиксируется на черепе. Кроме того, свобода передвижения является необходимым условием для крыс в течение Stimulaции в течение длительного периода. Целевые структуры DBS малы; Например, у крыс, STN имеет длину 1,2 мм и объемом 0,8 мм ^3,15. Таким образом, электроды должны быть сконструированы таким образом, что ядро ​​не пораженном во время вставки и ориентации должна быть точным. В большинстве исследований, проведенных в DBS грызунов использовали знаковый основе стереотаксической вставку электрода к структуре-мишени, частота ошибок может быть относительно высокой, даже при использовании координаты в соответствии с Paxinos и Уотсоном ^16. Это приводит к большему числу животных, необходимых для достижения статистически значимого в результат.

В настоящем исследовании собой технику имплантации электродов вводится, что цели КТС с высокой точностью с помощью системы microrecording при продвижении электрода. Кроме того, система стимуляции представлена, что позволяет не только высокую степень мобильности стимулированного животного, но также гарантирует непрерывный stimulatiна с помощью безопасной фиксации стимуляции проволоки (которая защищена нержавеющей стали весной) на голову крысы.

протокол

Эксперименты на животных были одобрены Университета Вюрцбурга и правовых органов государственной власти (Нижней Франконии, номер официального утверждения: 54-2531.01-102 / 13) и выполняется в соответствии с рекомендациями для исследований в экспериментальном инсульте изучает ¹⁷ и ток-исследовательского животных: Представление В экспериментах Руководства Vivo (http://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Анестезия

1. Проверьте обезболивающий системы для обеспечения достаточного количества поставок газа (кислорода) и ИФ для длительности процедуры. Подключите головная с баром Режущий инструмент стереотаксической и поставить планку резца на -3.3 мм.
2. Включите газоснабжения (2 л / мин). Поместите крысу в коробку и закрыть верхнюю. Включите изофлуран испаритель до 3,5%.
3. Когда крыса лежачем, переключать систему таким образом, чтобы анестезирующий газ поступает в головная часть, которая крепится к панели резца.
4. Удалить РАт из коробки камеры и брить зону между ушами и глазами; с помощью ватной палочки, смоченной Jodosept ПВП, тампон бритая области, чтобы удалить любые свободные волосы.
5. Расположите крысу в головная (рис 1) и продолжить анестезию ИФ 2,5% в _O 2 (1 л / мин). Проверьте уровень анестезии, зажимая межпальцевые области. Если крыса наркозом адекватно, оборонительные рефлексы отменена (т.е., вывод подножия).
6. Монитор дыхания и ответ на стимуляцию во время процедуры и настроить испаритель по мере необходимости.
7. Применить ветеринар мазь на глаза предотвратить сухость под наркозом. Контролировать и поддерживать температуру тела при 37 ± 0,5 ° С с помощью обратной управлением системы отопления.

2. Хирургическое

1. Держите операционного поля стерильным во всей операции. После того, как surgeon's руки стерильными и операционное поле является стерильной, двигаться только сторожныLLY и помнить, чтобы не сломать стерильности. Это включает наличие также стерильное поле (т.е., стерильные водонепроницаемые драпировки), на котором можно установить вниз инструменты.
2. Вводят 0,2 мл мепивакаин подкожно в центре выбритый участок. Мепивакаин является местным анестетиком, который имеет продолжительность действия до 3 ч. Это будет способствовать дальнейшему анестезию хирургическую область.
3. Использование скальпеля, сделать срединный разрез, начиная между ушами и расширения к 2 см. Убедитесь, что надкостница (мембрана блестящие под кожу) также резаная. Expose черепа с четырьмя зажимами (рисунок 2).
4. Использование ватным тампоном, осторожно удалите надкостницы до фронтальной и сагиттальной швов не подвергаются; после этого, верный кровь ватой.
5. Определить координаты брегмы с помощью иглы фиксируется в держателе зонда, а затем отметьте кончик иглы с черным фломастером. Использование передней / кзади (AP), по средней линии / боковой(ML) и дорсовентральной (DV), привод винта, поместите кончик иглы непосредственно над брегмы.
6. Возьмите AP и показания нониуса масштаба ОД: вычесть 3,6 мм от чтения AP и 2,5 мм от чтения мл для электродов имплантации в правой STN, или добавить 2,5 мм для электродов имплантации в левую STN. Эта позиция будет отмечена красителя в фломастером после понижения кончик иглы к поверхности черепа.
7. Зажмите бормашины на большой держатель зонда на стереотаксической инструмента. Перемещение бормашины с расчетной области - то есть, в отмеченной точке на черепе. Глядя через микроскоп, просверлить отверстие (диаметром около 1 мм) через череп, пока твердая мозговая оболочка не видна (череп толщиной около 1 мм). Отвести твердую мозговую оболочку, используя микро-рассечение пинцет или стерильную иглу. Твердая является достаточно жестким, чтобы уничтожить кончик электрода.
8. Просверлите отверстие с бормашины в каждом фронтальной чешуи, а в междунарerparietal чешуя напротив электрода отверстие. Отключите держателя зонда от стереотаксической инструмента. Не сверлить на черепа шва, как венозные сосуды следовать швов под черепом.
9. Винт костного винта в каждой из пяти отверстий. Избегайте резьбы винты слишком глубоко. Для нержавеющей стали винтами (M1.6), 2-3 оборотов винта будет адекватно провести винт без давления на мозг. Число витков зависит от шага винта. Зажмите держатель зонда с электродом в микроманипулятора (рис 3).
10. Использование дисков винты AP, ОД и DV, двигаться держателя зонда с электродом, пока наконечник почти касаясь брегмы. Обратите внимание на показания нониуса масштаба AP, ОД и DV на темени. Когда показания сделаны, повысить электрода на несколько миллиметров, чтобы предотвратить электрод от соскабливания череп во время движения. Для определения координат положения, где электрод должен быть вставлен вс отверстием, добавить 3,6 мм к чтению AP и добавить (или вычесть) 2,5 мм для чтения ML.
11. Использование AP и ML привод винта, переместите электрод к расчетной позиции. В этот момент, наконечник электрода должен располагаться непосредственно над пробуренной электрода отверстие. Затем, глядя в микроскоп, снизить электрод до уровня твердой мозговой оболочки (рис 4). Этот уровень служит нулевого уровня в направлении DV. После этого аккуратно вставьте кончик электрода в мозг, глядя в микроскоп.
12. Подключите электрод штырь к разъему системы записи. Положите клетку Фарадея (или заменить его с алюминиевой фольгой) на крыс в стереотаксической инструмента (рисунок 5). Заземление стереотаксической инструмент с противовесом в комнате, в настоящее время работал в.
13. Запустите систему записи. Если возможно, использовать громкоговоритель для получения акустического сигнала разрядов / мази одиночных единиц во advancinг электрод.
14. Медленно вставить электрод в мозг путем записи электрической активности во время продвижения электрода. На глубине между 7,5 и 8,1 мм от твердой мозговой оболочки, удельная электрическая активность STN, как правило, обнаруживается (фиг.6). Типичный активность нейронов в STN характеризуется нерегулярном шаблоне стрельбы и скорострельность (средняя частота: 40,9 ± 12,9 Гц) ^18.
15. Во время записи, снизить анестезии как можно больше (например, до 0,8-1,0%); низко наркозом животных показывают четкую электрической активности мозга.
16. Тампон сторону кровь или спинномозговую жидкость, что был смещен на поверхности черепа при опускании электрода.
17. Смешайте небольшое количество зубной цемент и применять его вокруг электрода и вокруг четырех из пяти винтов с помощью небольшого шпателя (фиг.7). Пятый винт будет использоваться для фиксации провода заземления штекера,
18. Отключите электрод штифт из держателя электрода и разъемом системы записи, когда зубной цемент фиксированной.
19. Отвинтите винт, который не был зафиксирован по зубным цементом. Вставьте вилку на электрод штырь. Закрепите провод заземления штекера с пятого винта (рисунок 8).
20. Смешайте стоматологического цемента и применить его вокруг вилки. Как цемент загустеет, формировать ее вокруг вилки, чтобы сформировать крышку. Избегайте острых краев зубной цемент, которые могут нанести вред животному и удалить их при закалке (9А и B).
21. Предотвращать краев раны и закрыть их с швом спереди и сзади крышки. Лечить раны края.
22. Подключите вилку голову к проводу, который фиксируется на поворотной. Удалить крысу от стереотаксической инструмента.
23. Применение трамадола (12,5 мг / кг, внутрибрюшинно) в конце вмешательства, а затем один раз в день в течение 2-3 дней. Поместите крысу в клетку с чистой Термал поддержка, исправить поворотный на этой клетке (рис 10) и осмотрите ее внимательно в течение 1 часа.
24. Не оставляйте без присмотра животное, пока он не восстановил достаточную сознание поддерживать грудины лежачее положение. Не возвращать животное, претерпела операцию на компании других животных до полного восстановления.

3. Стимулирование

1. Определить сопротивление у животного перед стимуляцией, используя измеритель импеданса.
2. Подключить вертлюга с проволокой и пробок на другом конце провода с выхода тока и выход для провода заземления стимулятора. Подключите стимулятор с компьютером для программирования стимулятора.
3. Выберите параметры стимуляции в программе; например, параметры, используемые при болезни Паркинсона являются длительность импульса: 60 ​​мкс; частота: 130 Гц. Стимулировать крысу с увеличением амплитуды тока до дискинезия не признаются. Сокращение йе напряженность электрического поля на 10-20% ниже интенсивности, вызвавшей дискинезия или до неврологические признаки исчезают, и животное комфортно. Монофазные прямоугольные импульсы были использованы в данном исследовании.
4. После завершения эксперимента, усыпить животное с изофлураном: Отрегулируйте скорость потока isofurane или концентрации до 5% или более. Продолжайте ИФ экспозицию до 1 мин после остановки дыхания.

Результаты

Имплантация электрода в STN крысы с использованием системы записи - как представлено здесь - это эффективное и точное процедура DBS, что занимает примерно 1 час на одно животное. Эта модель является довольно незначительные процедуры: из 10 крыс, подвергнутых операции, все выжили вмешательст...

Обсуждение

Это исследование представляет собой шаг за шагом набор инструкций для имплантации монополярного электрода хронический в STN крыс. Несмотря на то, вольфрамовые электроды с низким сопротивлением часто используются для DBS ^18,19, монополярного электрода из платины / иридия (Pt / Ir), что...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pt/Ir electrode	FHC Inc.	UE	Custom-made: Specification: UEPSEGSECN1M
Plugs	GT Labortechnik (Arnstein/Germany)		Custom-made
Pin header	DISTRELEC	143-95-324	single-row, 90° 1x3 datamate, Type M80-8420342
Socket	DISTRELEC	143-95-621	single-row,straight 2 mm pole no.1x3 datamate, Type M80-8400342
Stainless steel spring	Plastics ONE	SS0102	Part-#: .120 X .156 Spring ID (mm): 3.0  Spring OD (mm): 4.0
Dental cement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707938	Liquid, 500 ml
Dental cement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707954	Powder, rose, 500g
Head screw	Hummer & Reiss	V2ADIN84 M1.6x3
Jodosept PVP	Vetoquinol		435678/E04
Mepivacain 1%	AstraZeneca		PZN03338515
Epinephrine	Sanofi-Aventis		PZN00176118
Tramadolhydrochloride	Rotexmedica		38449.00.00