Microeletrodos guiada implantação de eletrodos no subtalâmica Núcleo de Ratos por longo prazo Estimulação Profunda do Cérebro

Resumo

A method for implanting electrodes into the subthalamic nucleus (STN) of rats is described. Better localization of the STN was achieved by using a microrecording system. Furthermore, a stimulation set-up is presented that is characterized by long-lasting connections between the head of the animal and the stimulator.

Resumo

A estimulação cerebral profunda (DBS) é uma terapia eficaz e amplamente utilizado para várias perturbações neurológicas, tais como doença, distonia ou tremor de Parkinson idiopática. DBS é baseada na entrega de estímulos eléctricos a estruturas anatómicas específicas profundos do sistema nervoso central. No entanto, os mecanismos subjacentes ao efeito de DBS permanecem enigmáticos. Isto levou a um interesse na investigação do impacto de DBS em modelos animais, especialmente em ratos. Como DBS é uma terapia de longo prazo, a investigação deve ser centrada em mudanças genético-moleculares dos circuitos neurais que ocorrem várias semanas após o DBS. A longo prazo em ratos DBS é um desafio porque os ratos mover nas suas gaiolas, o que causa problemas em manter em lugar de fios que conduz a partir da cabeça do animal para o estimulador. Além disso, as estruturas alvo para a estimulação do cérebro do rato são pequenas e, portanto, os eléctrodos não podem ser facilmente colocados na posição desejada. Assim, um set-up para a estimulação de longa duraçãoção de ratos por meio de eletrodos de platina / irídio com uma impedância de cerca de 1 MQ foi desenvolvido para este estudo. Um eletrodo com estas especificações permite não só a estimulação adequada, mas também a gravação de estruturas cerebrais profundas para identificar a área alvo para DBS. No nosso set-up, um eletrodo com um conector para o cabo foi incorporado no cimento dental com quatro parafusos de fixação garantidos para o crânio. O fio da tomada ao estimulador foi protegido por uma mola de aço inoxidável. Um giratória foi ligado ao circuito para impedir que o fio fique emaranhada. No geral, esta estimulação set-up oferece um elevado grau de mobilidade livre para o rato e permite que o bujão de cabeça, bem como a ligação do fio entre o bujão e o estimulador, para reter a força de longa duração.

Introdução

A estimulação cerebral profunda (DBS) é um tratamento baseado na entrega de impulsos elétricos através de eletrodos implantados nas estruturas cerebrais específicas, tais como o globo pálido interno Globus ^{1, o} núcleo subtalâmico (STN) ^2-4 ou o tálamo ventral intermediário ^5. Nas últimas duas décadas, este tratamento foi estabelecida como uma poderosa ferramenta terapêutica para a doença de Parkinson ^{1 - 4,} distonia ⁶ e tremor ^7, e também é usado para modular a dor crónica ^7, distúrbios psiquiátricos (isto é, o transtorno obsessivo-compulsivo ^8, depressão maior ^{9) ou} epilepsia refratária ^10,11. Além disso, DBS pode, no futuro, tornar-se uma opção de tratamento para a hipertensão arterial refratária ^{12 ou} hipotensão ortostática ^13.

Os mecanismos fisiológicos subjacentes aos efeitosde DBS permanecem pouco compreendidos. Estudos em roedores anestesiados forneceram uma visão sobre respostas neurais a estimulação de alta frequência que imitam clinicamente aplicado DBS ^14. No entanto, estes estudos não só falta comprovação do efeito comportamental DBS, mas também resultar em variabilidade considerável dependendo dos parâmetros de estimulação aplicado ^14.

Para investigar de forma mais concisa os efeitos comportamentais e os mecanismos subjacentes da DBS em roedores conscientes, uma estimulação set-up é necessário que preencha os requisitos específicos. DBS é usado principalmente como uma terapia a longo prazo (por exemplo, doença de Parkinson, a dor crónica). Assim, a estimulação set-up em roedores deve ser concebido de modo a que a unidade é constituída por um eléctrodo com um tampão, bem como um fio a partir da ficha para um estimulador externo; e esta unidade deve ser leve, mas inquebrável quando fixada no crânio. Além disso, a liberdade de circulação é indispensável para ratos durante stimulação durante um período prolongado. As estruturas alvo de DBS são pequenos; por exemplo, a STN em ratos tem um comprimento de 1,2 mm e um volume de 0,8 mm ^3,15. Portanto, os eléctrodos devem ser concebidos de tal modo que o núcleo está não lesionado durante a inserção e necessidades direccionamento para ser mais preciso. Como a maioria dos estudos realizados em roedores DBS ter usado marco baseado estereotáxica de inserção do eléctrodo para a estrutura de alvo, a taxa de erro pode ser relativamente alta, mesmo quando se utiliza as coordenadas de acordo com Paxinos e Watson ^16. Isso resulta em um maior número de animais necessários para chegar a um resultado estatisticamente significativo.

No presente estudo, de uma técnica de implantação de eléctrodo é introduzido, o que tem como alvo STN com alta precisão utilizando um sistema de microrecording durante o avanço do eléctrodo. Além disso, um sistema de estimulação que é apresentada não só permitir um elevado grau de mobilidade para o animal, mas também garante estimulada stimulati contínuana via fixação segura do fio de estimulação (que é protegida por uma mola de aço inoxidável) no cabeçote do rato.

Protocolo

As experiências com animais foram aprovados pela Universidade de Würzburg e as autoridades estaduais legais (Lower Franconia, número de aprovação: 54-2531.01-102 / 13) e realizada de acordo com as recomendações para a investigação em curso experimental estuda ¹⁷ ea corrente de Pesquisa Animal: Relatório de Em Diretrizes experimentos in vivo (http://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Anestesia

1. Verificar o sistema de anestésico para assegurar quantidades adequadas de abastecimento de gás (oxigénio) e isoflurano para a duração do processo. Conecte o nosecone com a barra incisivo do instrumento estereotáxico e colocar o bar incisivo em -3.3 mm.
2. Ligar o fornecimento de gás (2 L / min). Coloque o rato em uma caixa e selar o topo. Ligue o vaporizador isoflurano a 3,5%.
3. Quando o rato é reclinada, comutar o sistema de modo que o gás flui para o anestésico cone de protecção, que está fixado à barra de incisivo.
4. Remover o rat da câmara de caixa e raspar a área entre as orelhas e os olhos; usando um cotonete embebido com Jodosept PVP, limpe a área raspada para remover qualquer cabelo solto.
5. Colocar o rato no nariz cónico (Figura 1) e continuar a anestesia com isoflurano 2,5% em O ₂ (1 L / min). Verifique o nível de anestesia por beliscar a área interdigital. Se o rato é anestesiado adequadamente, os reflexos defensivos são suprimidos (isto é, retirada do pé).
6. Monitorar a respiração e a resposta à estimulação durante o procedimento e ajustar o vaporizador conforme necessário.
7. Aplicar veterinário pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia. Monitorizar e manter a temperatura corporal a 37 ± 0,5 ° C por um sistema de aquecimento controlado por realimentação.

2. Cirurgia

1. Mantenha o campo cirúrgico esterilizado durante toda a cirurgia. Uma vez que as mãos do cirurgião são estéreis eo campo operacional é estéril, mover apenas carefully e lembre-se para não quebrar a esterilidade. Isso inclui ter também um campo estéril (ou seja, cortinas impermeáveis ​​estéreis), no qual se pode definir para baixo instrumentos.
2. Injectar 0,2 mL de mepivacaína subcutaneamente no centro da área rapada. Mepivacaína é um anestésico local, que tem uma duração de acção de até 3 horas. Ele vai anestesiar ainda mais a área cirúrgica.
3. Utilizando um bisturi, fazer uma incisão na linha média a partir entre as orelhas e estendendo-se para 2 cm. Assegurar que o periósteo (membrana brilhante sob a pele) também é incisado. Expor o crânio com quatro grampos (Figura 2).
4. Usando um cotonete, remova cuidadosamente o periósteo, até as suturas coronal e sagital são expostos; depois disso, estancar o sangue com lã de algodão.
5. Determinar as coordenadas da bregma, utilizando uma agulha fixada num suporte da sonda, e em seguida, marcar a ponta da agulha com uma caneta de feltro preto. Utilizando o anterior / posterior (AP), da linha média / lateral,(ML) e dorsoventrais parafusos (DV) da unidade, posicione a ponta da agulha diretamente sobre o bregma.
6. Aqui o AP e ML leituras escala vernier: subtrair 3.6 mm a partir da leitura do AP e 2,5 mm a partir da leitura mL para implantação eléctrodo na STN direito, ou adicionar 2.5 mm para implantação eléctrodo na STN esquerda. Esta posição será marcada pelo corante da caneta com ponta de feltro após a diminuição da ponta da agulha para a superfície do crânio.
7. Prenda a broca de dentista para o titular grande sonda do instrumento estereotáxico. Mova a broca de dentista para a área calculada - ou seja, o ponto marcado no crânio. Olhando através do microscópio, um furo (diâmetro cerca de 1 mm) através do crânio até que a dura-máter é visível (o crânio é de cerca de 1 mm de espessura). Retrair a dura usando uma pinça micro-dissecação ou uma agulha estéril. A dura-máter é resistente o suficiente para destruir a ponta do eletrodo.
8. Perfurar um furo com a broca de dentista em cada escama frontal, e no interparietal oposto squama para o buraco eletrodo. Desligue o suporte da sonda do instrumento estereotáxico. Não faça uma sutura no crânio como vasos venosos siga as suturas sob o crânio.
9. Parafuso de uma parafuso de osso em cada um dos cinco furos. Evite enfiar os parafusos muito profundo. Para parafusos de aço inoxidável (M1.6), 2-3 voltas do parafuso vai realizar adequadamente o parafuso sem colocar pressão sobre o cérebro. O número de espiras vai depender do passo do parafuso. Prender o suporte da sonda com o eléctrodo na micromanipulador (Figura 3).
10. Utilizando os parafusos de accionamento AP, ML e DV, mover o suporte de sonda com o eléctrodo até que a ponta está quase a tocar a bregma. Observe as leituras de escala vernier AP, ML e DV no bregma. Quando as leituras são feitas, elevar o eléctrodo de alguns milímetros para impedir o eléctrodo de raspagem do crânio durante o movimento. Para determinar as coordenadas da posição em que o eléctrodo tem de ser inserido empara o buraco, adicionar 3,6 mm para a leitura AP e adicionar (ou subtrair) 2,5 mm para a leitura ML.
11. Usando os parafusos AP e ML unidade, mova o eletrodo para a posição calculada. Neste ponto, a ponta do eléctrodo deve estar situado directamente sobre o orifício perfurado eléctrodo. Em seguida, olhando através do microscópio, diminuir o eléctrodo ao nível da dura-máter (Figura 4). Este nível serve como nível zero na direção DV. Em seguida, inserir suavemente a ponta do eléctrodo no cérebro, olhando através do microscópio.
12. Ligue o pino de eléctrodo para a peça de ligação do sistema de gravação. Coloque uma gaiola de Faraday (ou substitui-la com uma folha de alumínio) sobre o rato do instrumento estereotáxico na (Figura 5). Aterrar o instrumento estereotáxico com o contrapeso da sala que está sendo trabalhado em.
13. Inicie o sistema de gravação. Se disponível, use também um alto-falante para obter um sinal acústico de descargas / salves de unidades individuais durante advancing do eletrodo.
14. Insira lentamente o eletrodo dentro do cérebro, registrando a atividade elétrica durante o avanço do eletrodo. A uma profundidade de entre 7,5 e 8,1 mm a partir da dura-máter, a actividade eléctrica específica do STN é geralmente detectável (Figura 6). A atividade típica de neurônios no STN é caracterizado por um padrão de disparo irregular e uma taxa de disparo de alta (média de frequência: 40,9 ± 12,9 Hz) ^18.
15. Durante a gravação, a anestesia reduzir, tanto quanto possível (por exemplo, de 0,8-1,0%); animais de baixa anestesiados mostram uma atividade cerebral elétrica mais clara.
16. Pincelar fora qualquer sangue ou fluido cerebrospinal que foi deslocado para a superfície do crânio durante a descida do eléctrodo.
17. Misturar-se uma pequena quantidade de cimento dentário e aplicá-lo em torno do eléctrodo e cerca de quatro dos cinco parafusos usando uma pequena espátula (Figura 7). O quinto parafuso será usado para fixar o fio de aterramento do plugue.
18. Desligue o eléctrodo a partir do pino de suporte do eléctrodo e do conector do sistema de gravação, quando o cimento dental é fixo.
19. Solte o parafuso que não foi fixado pelo cimento dental. Coloque a ficha sobre o pino do eléctrodo. Fixe o fio de aterramento do plugue com o quinto parafuso (Figura 8).
20. Misture cimento dental e aplicá-lo ao redor da vela. Como o cimento engrossa, moldá-lo ao redor da vela para formar um tampão. Evitar arestas vivas do cimento dental que pode prejudicar o animal e removê-los durante o endurecimento (Figura 9A e B).
21. Debride bordas da ferida e fechá-los com um fio de sutura na frente e por trás da tampa. Desinfectar as bordas da ferida.
22. Ligue a ficha de cabeça para o fio que é fixo em um giro. Remover o rato do instrumento estereotáxico.
23. Aplicar tramadol (12,5 mg / kg, por via intraperitoneal) no final da intervenção e, em seguida, uma vez por dia durante 2-3 dias. Coloque o rato em uma gaiola limpa com thermal apoio, corrigir o giro sobre esta gaiola (Figura 10) e inspecioná-lo cuidadosamente durante 1 h.
24. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que totalmente recuperado.

3. Estimulação

1. Determinar a resistência no animal antes da estimulação usando um medidor de impedância.
2. Ligue a ficha da peça giratória com um arame e as fichas na outra extremidade do fio com a corrente de saída e a saída para o fio de terra do estimulador. Ligue o estimulador com um computador a fim de programar o estimulador.
3. Escolha os parâmetros de estimulação no programa; por exemplo, os parâmetros usados ​​na doença de Parkinson são o comprimento do pulso: 60 ms; freqüência: 130 Hz. Estimular o rato com um aumento da amplitude da corrente até discinesia são reconhecidos. Reduzir the intensidade elétrica em 10-20% abaixo da intensidade que provocou discinesia ou até sinais neurológicos desaparecem eo animal está confortável. Pulsos rectangulares monofásicas foram utilizados neste estudo.
4. Depois de concluir o experimento, a eutanásia do animal com isoflurano: Ajustar o fluxo isofurane ou concentração de 5% ou mais. Continue exposição isoflurano até 1 min após a respiração pára.

Resultados

Implantação de um eletrodo na STN de um rato usando um sistema de gravação - como aqui apresentados - é um procedimento eficaz e preciso para DBS que demora cerca de 1 hora por animal. Este modelo é um procedimento bastante menor: de 10 ratos submetidos à cirurgia, todos sobreviveram a intervenção. Vinte e quatro horas após a intervenção, o estado de cada rato foi monitorizada e nenhum animal conseguiu mais do que 1 de 3 pontos de acordo com o código de gravidade. Durante o período de estimulação contín...

Discussão

Este estudo apresenta um conjunto passo-a-passo de instruções para a implantação de um eletrodo monopolar crônico na STN de ratos. Apesar de eléctrodos de tungsténio com baixa impedância são frequentemente utilizados para DBS ^18,19, um eletrodo monopolar de platina / irídio (Pt / Ir) foi empregada que tinha uma impedância de cerca de 1 MQ. Eléctrodos de Pt / Ir são também utilizados em doentes com doença de Parkinson devido às suas propriedades favoráveis: eles demonstram erosão mínim...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pt/Ir electrode	FHC Inc.	UE	Custom-made: Specification: UEPSEGSECN1M
Plugs	GT Labortechnik (Arnstein/Germany)		Custom-made
Pin header	DISTRELEC	143-95-324	single-row, 90° 1x3 datamate, Type M80-8420342
Socket	DISTRELEC	143-95-621	single-row,straight 2 mm pole no.1x3 datamate, Type M80-8400342
Stainless steel spring	Plastics ONE	SS0102	Part-#: .120 X .156 Spring ID (mm): 3.0  Spring OD (mm): 4.0
Dental cement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707938	Liquid, 500 ml
Dental cement/Paladur	Heraeus Kulzer	64707954	Powder, rose, 500g
Head screw	Hummer & Reiss	V2ADIN84 M1.6x3
Jodosept PVP	Vetoquinol		435678/E04
Mepivacain 1%	AstraZeneca		PZN03338515
Epinephrine	Sanofi-Aventis		PZN00176118
Tramadolhydrochloride	Rotexmedica		38449.00.00