Un biorreactor Novela de alta densidad de cultivo de diversas comunidades microbianas

Resumen

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Resumen

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD¹ and nitrogen species^2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH₄⁺ and NO₃^- concentrations in the feed did not have an effect on NH₄⁺ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH₄⁺ feed concentration was found to be negatively related with NO₃^- removal (n=44, p=0.000) and NO₃^- feed concentration was found to be positively correlated with NO₃^- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH₄⁺, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH₄⁺ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

Introducción

Las aguas residuales municipales se trata comúnmente con los procesos de lodos activados con el fin de reducir los sólidos en suspensión (SS), demanda biológica de oxígeno (DBO), de nitrógeno orgánico e inorgánico, y contenido de fósforo ^5,6. El proceso de lodos activados, un medio de tratamiento secundario de aguas residuales, implica la oxidación del carbono orgánico en un tanque de aireación lleno de un licor mixto de las aguas residuales de entrada y de microorganismos heterótrofos reciclado (comúnmente conocida como lodo activado) ^5-7. El licor mixto entra entonces en un relativamente grande clarificador (tanque de sedimentación), donde el lodo se asienta para la recolección más fácil, ya sea ser eliminados o reciclados de nuevo al tanque de aireación, mientras que el, aguas residuales tratadas aclarado puede seguir un tratamiento terciario o desinfección antes de ser liberado en aguas receptoras ^5-7. La separación eficiente de las aguas residuales tratadas y los sólidos (lodos) en el clarificador secundario es esencial para la función apropiada de una erasistema de tratamiento de tewater, como cualquier lodos activados continuar más allá de los clarificadores aumentará la DBO y SS en el efluente ^5-8.

Un número de procesos biológicos alternativos existe para el tratamiento secundario de las aguas residuales, que reducen o eliminan la necesidad de grandes tanques de clarificación, incluyendo el crecimiento adjunto (biofilm) reactores, biorreactores de membrana (MBR), y los reactores de lodo granular. En los reactores de biopelículas, la formación de biopelículas, en el que los microorganismos de forma natural agregada y adjuntar como una capa sobre una superficie sólida, permite la retención de biomasa y acumulación sin la necesidad de un tanque de clarificación. Reactores de biopelícula se pueden clasificar en tres tipos: reactores de lecho empacado, reactores de lecho fluidizado, y contactores biológicos rotatorios. Los reactores de lecho Almuerzos, tales como un filtro de escurrimiento y torres biológicas, utilizan una superficie de un sólido crecimiento estacionario ^5,6. Los reactores de lecho fluidizado (FBR) dependen de la fijación de los microorganismos a las partículas,tales como arena, carbón activado granular (GAC), o cuentas de vidrio, que se mantienen en suspensión por una alta tasa de flujo ascendente ^9,10. Rotación de reactores biológicos dependen de biopelículas formadas en los medios de comunicación adjuntos a un eje de rotación que permiten la biopelícula para ser alternativamente expuestas al aire y el líquido se está tratando ^5,6. MBR utilizan unidades de filtración de membrana, ya sea dentro del biorreactor (configuración sumergido) o externamente a través de recirculación (configuración corriente lateral) ^5,11. Las membranas sirven para lograr una buena separación de la biomasa y las partículas sólidas del líquido tratado ^11,12. Reactores de lodo granular son reactores de flujo ascendente en el que la formación de gránulos extremadamente densas y bien de sedimentación de los microorganismos se produce cuando están expuestos a alta flujo ascendente de aire superficial velocidades ^13.

Como otra alternativa al proceso de lodos activados, un sistema de reactor de flujo ascendente novela, que ahora se llama un biorreactor de alta densidad (HDBR), fue designed y construido por Ventas y Shieh (2006) para estudiar la eliminación de DQO por lodos activados de las corrientes de residuos sintéticos en bajas condiciones de F / M que se sabe que causan la formación de lodos de decantación pobres (es decir, aumento de volumen de lodos) ^1,7,14. El sistema utilizado HDBR modificado reactores de lecho fluidizado que normalmente consisten en un reactor de flujo ascendente y un depósito de reciclaje externo. Reactores de lecho fluidizado se suelen funcionar con velocidades de flujo corriente de reciclo suficientemente alta para mantener el sustrato de crecimiento de biopelículas en suspensión pero bajas lo suficiente para que se retiene el sustrato biofilm-cubierto. A diferencia de reactores de lecho fluidizado, el HDBR describe en Sales y Shieh (2006) utilizó relativamente bajas tasas de flujo corriente de reciclo que, junto con aireación externo, impedían la interrupción de la zona de biomasa formada dentro del reactor ^1. Estudios posteriores han demostrado la capacidad de este diseño del reactor para tratar con éxito una serie de flujos de nitrógeno mediante nitrificación / bacterias desnitrificantes ^3,4. En todo espárragoIES formación de una zona de biomasa densa estable dentro del HDBR eliminó la necesidad de un proceso / sedimentación floculación externa ^{a 1-4.}

Como se presenta aquí, el uso de la HDBR para crecer cultivos densos también se ha probado en un fotobiorreactor (PBR) de configuración para el cultivo de algas. Se discuten las ventajas e inconvenientes de este novedoso sistema de reactor para el cultivo de algas y su potencial para superar un gran obstáculo en la comercialización de biocombustibles de algas asociadas con la biomasa de cosecha (es decir, una buena separación sólido-líquido ^15,16). El siguiente protocolo describe los pasos necesarios para montar, puesta en marcha, muestra a partir, y mantener un HDBR con algas como la comunidad microbiana de interés. También se mencionan las variaciones en el protocolo de puesta en marcha y funcionamiento de las culturas heterótrofos y nitrificantes / desnitrificantes. Por último, las ventajas generales, desventajas, y las incógnitas de esta novela diseño del reactor se resaltarán.

Protocolo

1. Asamblea Reactor

1. Colocar los componentes del reactor de acuerdo con el esquema de la Figura 1.
   1. Coloque el reactor (R) en una placa de mezcla, añadir una barra de agitación en el reactor. Coloque el depósito de reciclado (RT) al lado de la placa de agitación y el reactor de manera que el puerto efluente (parte superior) del depósito se dirige hacia el borde de la mesa de laboratorio.
   2. Colocar el contenedor de residuos (W) por debajo del puerto efluente (parte superior) del depósito de reciclado (RT). Coloque el tanque de alimentación (FT) al lado del depósito de reciclado (RT).
      Nota: El tanque de alimentación tiene una capacidad total de 5 L.
2. Asegure el reactor (R) en contra de inflexión con un stand de tamaño adecuado y la abrazadera. Del mismo modo, asegurar el depósito de reciclado (RT) para evitar el movimiento.
3. Inserte neopreno tubo de la bomba peristáltica en el reciclaje (bomba A) y alimentar cabezas (bomba B) de la bomba. Consulte la tabla de Materiales para las especificaciones de tubos adicionales. Instale los cabezales de bomba en las unidades de bombeo con la provi tornillosded con las unidades de bombeo.
4. Conectar la tubería de la bomba de A a los puertos en el reactor y el depósito de reciclado. Inserte el extremo de la tubería de la bomba B en el tanque de alimentación y el depósito de reciclado. Conecte el puerto del reactor superior al depósito de reciclaje con el tubo. Aplicar las abrazaderas a la tubería en los puertos del reactor.
   Nota: Las comunidades fotosintéticas pueden beneficiarse de la iluminación artificial proporcionada por lámparas.

2. Preparación de las soluciones de archivo, Soluciones influente / piensos y algas inoculante

1. Preparar la solución mineral de valores. Añadir lo siguiente a un matraz aforado de 1 L con 500 ml de agua desionizada: 200 g de bicarbonato de sodio, 40 g de fosfato monobásico de potasio, 4 g de sulfato de magnesio, 4 g de cloruro férrico, 4 g de cloruro de calcio, 1 g de cloruro de cobre, 1 g de cobalto hexahidrato de cloruro, 1 g de hexahidrato de cloruro de níquel, 1 g de sulfato de zinc heptahidratado. Añadir un adicional de 400 ml de agua desionizada. Agitar enérgicamente para fomentar la disolución de sales. Siguiendo dissolución de sales, añadir agua desionizada para llevar el volumen total de solución a 1 L.
2. Prepare la solución de amoníaco de valores. En un matraz aforado de 1 L, se disuelven 38.214 gramos de cloruro de amonio en aproximadamente 900 ml de agua desionizada. Después de la disolución, agregue agua desionizada para llevar el volumen total de hasta 1.000 ml.
   NOTA: 1 ml de solución madre diluidos a 1 L se obtiene un 10 mg L ^-1 NH ₄ ⁺ -N solución.
3. Preparar la solución de nitrato de valores. En un matraz aforado de 1 L, se disuelven 72,413 g de nitrato de potasio en aproximadamente 900 ml de agua desionizada. Después de la disolución, agregue agua desionizada para llevar el volumen total de hasta 1.000 ml.
   Nota: 1 ml de solución madre diluidos a 1 L se obtiene un 10 mg L ^-1 NO ₃ ^- -N solución.
4. Preparar la solución de alimentación / influente. Para hacer una solución de alimentación que contiene 20 mg L ^-1 NH ₄ ⁺ N y 20 mg L ^-1 NO ₃ ^- -N, diluir 2 ml de unammonia solución madre y 2 ml de solución de nitrato a volumen total de 1 litro. Antes de la dilución, añadir 0,5 ml de solución mineral / L de solución que está siendo hecho. Preparar 5 L de influente en total para poner en marcha el reactor.
5. Preparar el inoculante algas.
   1. Reunir un gran volumen (al menos 10 L) de agua de un cuerpo de agua que contiene algas, tales como una corriente o estanque. Permita que las algas se asiente dejando las muestras de agua en reposo durante 24 horas.
   2. Decantar y desechar el claro (no-algas que contiene) de agua en la parte superior de las muestras, dejando una suspensión de algas concentrado dentro de las botellas de muestra. Combinar la suspensión de algas de todas las muestras en un recipiente y repetir el asentamiento y los pasos de decantación.
   3. Mida la biomasa dentro de la muestra concentrada.
      1. Secar un filtro de vacío de papel (filtro de vacío 0,45 micras MCE) y aluminio pesan barco O / N en un horno que ha sido ajustado a 103 ° C Después de enfriamiento en un desecador durante 30 min a TA medir la combined masa del filtro y pesar barco.
      2. Filtro de vacío de 20 ml de suspensión concentrada de algas y regresar el filtro y pesan barco al horno para secar O / N.
      3. Medir la masa combinada del filtro y pesar barco. Calcular la densidad de la biomasa dentro de la muestra concentrada.
         Nota: El volumen total de la muestra de agua que necesitan los investigadores para recolectar dependerá de la masa de agua de origen.

3. Siembra e inicio del Reactor

1. Añadir 750 ml de solución de alimentación al reactor. Llenar el depósito de reciclaje con 500 ml de solución de alimentación.
2. Utilice una pipeta larga para agregar suavemente una suspensión inóculo que contiene 1,5 g de algas cerca de la parte inferior del reactor. Permitir que el inóculo a asentarse en el fondo del reactor, a asegurar esto por observación visual, antes de proceder al siguiente paso.
3. Una vez que las células se han asentado, retire las abrazaderas del tubo y encienda la bomba A a una velocidad de flujo lento (10 revolutions min ^{-1 / 38} ml min ^-1). El aire atrapado en el tubo será expulsado en el reactor.
   Nota: La adición de 750 ml al reactor evitará que cualquier biomasa perturbado por la bomba de salir del reactor. Apriete el tubo para asegurar que todo el aire ha sido expulsado.
4. Gradualmente añadir solución de alimentación al tanque de reciclaje como la solución se bombea en el reactor. Continuar la adición hasta que tanto el reactor y el depósito de reciclado están en capacidad y se inicia de efluentes para salir del depósito de reciclado a través del puerto superior.
   Nota: El volumen de la solución de alimentación que se añaden al tanque de reciclaje variará con el volumen de la inoculante añadido al reactor.
5. Verter la solución de alimentación restante en el tanque de alimentación.
6. Ajuste la bomba de reciclaje (bomba A) a 19 revoluciones min ^-1, estableciendo un caudal de reciclaje de 72,5 ml min ^-1. Tenga en cuenta las algas comienzan a desván de la parte inferior del reactor. Utilizando las gradaciones en el reactor, determine la bi algasaltura de la zona omass. Asegúrese de que la altura es constante antes de proceder al siguiente paso.
7. Encienda la placa mezcladora a velocidad muy baja; un valor de 1 o 2 es apropiado para comenzar. La barra de mezcla ayudará a lofting biomasa más lejos, pero mezclado agresivo hará que las algas que abandonar el reactor, introduzca el depósito de reciclado, y dejar en el efluente. Ajuste de mezcla de velocidad en un entorno necesario para establecer una frontera clara algas dentro del reactor (Figura 2); la zona de la biomasa de algas debe ser de aproximadamente 10-15 cm de altura.
8. Inicie la bomba de alimentación después de observar un límite claro entre el enchufe de algas y el líquido del reactor. Ajuste la bomba a 25 revoluciones min ^-1, estableciendo un caudal de 1,5 ml min ^-1. Observe la salida de fluido del reactor el puerto de efluentes debido a la gravedad y el desplazamiento causado por la corriente influente entrante.

4. Recolección y Análisis

1. Llevar a cabo actividades de recogida de muestras prio para realizar tareas de mantenimiento en el sistema de reactor. Recoger 20 ml de muestras de efluentes y afluentes diaria. Recoger muestras de efluentes desde dentro del depósito de reciclado. Recoger muestras del influente directamente desde el tanque de alimentación.
2. Muestras de filtros de vacío para eliminar los sólidos antes de su almacenamiento y análisis suspendidos.
3. Guarde el afluente y efluente muestras a -20 ° C hasta su posterior análisis. Limite el número de ciclos de congelación y descongelación muestras son sometidos. Si es necesario, las muestras se pueden dividir en alícuotas para mantener la integridad de la muestra.
4. Llevar a cabo análisis de muestras para el nitrato, nitrito y amoníaco utilizando técnicas estándar ^17.
   Nota: Los autores utilizaron la cromatografía iónica (IC) para producir los resultados que se presentan en este documento. Consulte la tabla de Materiales para la especificación.

Resultados

El HDBR se utilizó para cultivar algas lo largo de varias proporciones de las concentraciones de amoníaco y nitrato influente, mientras se mantiene un contenido de nitrógeno total en la alimentación a 40 mg -NL ^-1. Afluente y efluente muestras fueron tomadas a diario; muestras de densidad de biomasa fueron tomadas al principio y al final de cada condición. El reactor tuvo un promedio de 3-5 días para alcanzar el equilibrio de estado estacionario después se cambiaron las condiciones. Más de una amplia ...

Discusión

En esta sección se iniciará con una discusión de las variaciones de protocolo necesarios para hacer frente a posibles problemas operativos, así como el uso de diferentes comunidades microbianas. Se discutirán los puntos fuertes de este diseño del reactor, incluyendo la capacidad para gobernar el control de flujo de oxígeno y la formación de flóculos de alta densidad dentro del reactor. También se mencionan los desafíos actuales y las posibles vías de investigación.

Protocolo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aeration stone	Alita	AS-3015C
Aerator	Top Fin	Air-1000
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Anion analysis column	Shodex	IC SI-52 4E
Beaker (600 ml)	Corning Pyrex	1000-600	Used as mixing vessel (MV). Addition of hose barbs at the bottom and 500 ml levels. Outside diameter of hose barbs 3/8".
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C5670
Cation analysis column	Shodex	IC YS-50
Cobalt chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C8661
Copper chloride	Sigma Aldrich	222011
Ferric chloride	Sigma Aldrich	157740
Filter (vacuum)	Fisherbrand	09-719-2E	0.45 μm membrane filter, MCE, 47 mm diameter
Graduated cylinder (1,000 ml)	Corning Pyrex	3025-1L	Used as reactor vessel (R). Addition of hose barbs at bottom, 500 ml, and 1 L levels. Outside diameter of hose barbs 3/8".
HPLC/IC	Shimadzu	Prominence
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Masterflex L/S variable speed drive	Masterflex	07553-50	Drive for recycle and feed pumps (2 needed)
Nickel chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	N6136
Potassium nitrate	Sigma Aldrich	P8291
(Monobasic) Potassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
Pump head	Masterflex	07018-20	Recycle pump head
Pump head	Masterflex	07013-20	Feed pump head
Pump tubing	Masterflex	6404-18	Recycle pump tubing
Pump tubing	Masterflex	6404-13	Feed pump tubing
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z0251