Um biorreator Novel de Cultivo de Alta Densidade de diversas comunidades microbianas

Resumo

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Resumo

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD¹ and nitrogen species^2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH₄⁺ and NO₃^- concentrations in the feed did not have an effect on NH₄⁺ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH₄⁺ feed concentration was found to be negatively related with NO₃^- removal (n=44, p=0.000) and NO₃^- feed concentration was found to be positively correlated with NO₃^- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH₄⁺, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH₄⁺ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

Introdução

Águas residuais municipais é comumente tratado com processos de lodos ativados, a fim de reduzir os sólidos em suspensão (SS), demanda biológica de oxigênio (DBO), nitrogênio orgânico e inorgânico, e teor de fósforo ^5,6. O processo de lamas activadas, um meio de tratamento de águas residuais secundário, implica a oxidação do carbono orgânico num tanque de arejamento enchida com um líquido misturado e de águas residuais recebidas microorganismo heterotrófica reciclado (vulgarmente designado por lamas activadas) ^5-7. A lixívia mista, em seguida, entra em uma relativamente grande clarificador (decantador) onde a lama liquida para facilitar a recolha, quer para ser descartado ou reciclado de volta para o tanque de arejamento, enquanto a clarificada, água residual tratada pode continuar a tratamento terciário ou desinfecção antes de ser libertado para águas receptoras ^5-7. Separação eficiente do efluente tratado e sólidos (lodo) no clarificador secundário é essencial para o bom funcionamento de um estavatewater sistema de tratamento, como qualquer lama activada continuada para além dos clarificadores irá aumentar o BOD e SS no efluente ^5-8.

Um número de processos biológicos alternativas existem para o tratamento secundário de águas residuais de, que reduzem ou eliminam a necessidade de grandes tanques de esclarecimento, incluindo o crescimento fixadas (biofilme) reactores, bioreactores de membrana (MBR), e reactores de lamas granulares. Em reactores de biofilme, a formação de biofilmes, no qual os microorganismos naturalmente agregado e anexar como uma camada sobre uma superfície sólida, permite a retenção e acumulação de biomassa, sem a necessidade de um tanque de clarificação. Biofilme reactores podem ser classificados em três tipos: reatores de leito fixo, reactores de leito fluidizado, e contactores biológicos rotativos. Reatores de leito fixo, como uma filtros biológicos e torres biológicas, utilizar uma superfície estacionária sólido crescimento ^5,6. Os reactores de leito fluidizado (FBRs) dependem da fixação de microrganismos às partículas,tais como areia, carvão activado granular (GAC), ou esferas de vidro, que são mantidas em suspensão por uma alta taxa de fluxo ascendente ^9,10. Rotação reactores biológicos dependem biofilmes formados em meios ligados a um eixo de rotação, permitindo o biofilme a ser alternadamente exposto ao ar e o líquido a ser tratado ^5,6. MBRs usar unidades de filtração de membrana, quer dentro do biorreator (configuração submersa) ou externamente através de recirculação (configuração side-stream) ^5,11. As membranas servem para conseguir uma boa separação entre a biomassa e as partículas sólidas a partir do líquido tratado ^11,12. Reactores de lamas granulares são reactores de fluxo ascendente, em que a formação de grânulos extremamente densos e bem-sedimentação de microorganismos ocorre quando são expostos a altas velocidades de fluxo ascendente de ar superficial ^13.

Como uma outra alternativa para o processo de lamas activadas, num sistema de fluxo ascendente reactor de novo, agora chamado bioreactor de alta densidade (HDBR), foi designed e construído por Vendas e Shieh (2006) para estudar remoção de DQO por lamas activadas a partir de fluxos de resíduos sintéticos em condições de baixa F / M que são conhecidos por causar a formação de lamas de decantação pobres (ou seja, de volume de lodo) ^1,7,14. O sistema utilizado HDBR modificado reactores de leito fluidizado, que consistem tipicamente de um reactor de fluxo ascendente e um tanque de reciclagem externa. Reactores de leito fluidificado estão tipicamente operado com caudais de fluxo de recirculação de alta o suficiente para manter o substrato de crescimento de biofilme suspenso, mas baixa o suficiente para que o substrato coberto-biofilme é retida. Ao contrário dos reactores de leito fluidizado, o HDBR descrito em Vendas e Shieh (2006) utilizadas taxas de fluxo relativamente baixa corrente de reciclagem a qual, juntamente com arejamento externo, impediram ruptura da zona de biomassa formada no interior do reactor ^1. Estudos posteriores demonstraram a capacidade deste projeto do reator de tratar com sucesso uma série de fluxos de nitrogênio usando nitrificantes / desnitrificadores ^3,4. Ao todo parafuso prisioneiroies a formação de, uma zona densa de biomassa estável dentro do HDBR eliminou a necessidade de um processo de / sedimentação floculação externo ^1-4.

À medida que relatamos aqui, a utilização da HDBR a crescer culturas densas também foi testado numa configuração fotobiorreactor (PBR) para o cultivo de algas. Discutimos as vantagens e desvantagens deste sistema reactor romance para o cultivo de algas e seu potencial para superar um grande obstáculo na comercialização de biocombustíveis de algas associadas a colheita de biomassa (ou seja, uma boa separação sólido-líquido ^15,16). O protocolo a seguir descreve as etapas necessárias para a montagem, arranque, a partir de amostra, e manter uma HDBR com algas como a comunidade microbiana de interesse. As variações no protocolo de inicialização e operação de culturas heterotróficas e nitrificação / desnitr também será mencionado. Por último, vantagens, desvantagens, gerais e incógnitas deste projeto do reator novela será destacado.

Protocolo

1. Assembleia Reactor

1. Dispor os componentes do reactor de acordo com o esquema na Figura 1.
   1. Coloque o reactor (R) em uma placa de mistura, adicionar uma barra de agitação para o reactor. Coloque o tanque de reciclagem (RT) ao lado da placa de agitação e o reactor de modo que a porta de efluente (topo) do reservatório é dirigida para a borda da bancada do laboratório.
   2. Coloque o recipiente de resíduos (W) por baixo da porta de efluente (topo) do tanque de reciclagem (RT). Coloque o tanque de alimentação (FT) ao lado do tanque de reciclagem (RT).
      Nota: O tanque de alimentação tem uma capacidade total de 5 L.
2. Prenda o reactor (R) contra a inclinação com um stand de tamanho adequado e grampo. Da mesma forma, assegurar o tanque de reciclagem (RT) para impedir o movimento.
3. Insira neoprene tubulação bomba peristáltica na reciclagem (Bomba A) e alimentá-cabeças (Bomba B) da bomba. Consulte a tabela de especificações de materiais para tubos adicionais. Instale as cabeças de bomba para as unidades de bomba com o provi parafusosded com as unidades de bomba.
4. Conecte tubagem da bomba A para as portas no reactor e o tanque de reciclagem. Insira a extremidade do tubo de bomba B para o tanque de alimentação e o tanque de reciclagem. Ligue a porta reactor superior ao tanque de reciclagem com tubulação. Aplicar grampos para o tubo do reactor nos portos.
   Nota: comunidades fotossintéticas podem beneficiar de iluminação artificial fornecida por lâmpadas.

2. Preparação das soluções de reserva, Soluções Influente / alimentação, e Algas Inoculante

1. Preparar a solução estoque mineral. Adicionar o seguinte a um balão volumétrico de 1 L com 500 ml de água desionizada: 200 g de bicarbonato de sódio, 40 g de fosfato monobásico de potássio, sulfato de magnésio 4 g, 4 g de cloreto férrico, cloreto de cálcio 4 g, 1 g de cloreto de cobre, 1 g de cobalto hexa-hidrato de cloreto de, 1 g de hexa-hidrato de cloreto de níquel, 1 g de sulfato de zinco hepta-hidratado. Adicionar um adicional de 400 ml de água deionizada. Agite vigorosamente para incentivar a dissolução de sais. Seguindo Dissolução de sais, adicionar água desionizada para levar o volume total da solução para 1 L.
2. Prepare a solução de amônia. Em um balão volumétrico de 1 L, dissolve-se 38.214 g de cloreto de amónio em aproximadamente 900 ml de água desionizada. Após dissolução, adicionar água desionizada para levar o volume total até 1.000 ml.
   Nota: 1 ml de solução de estoque diluído para 1 L produz uma 10 ^mg L-1 _NH4 ⁺ -N solução.
3. Preparar a solução de nitrato. Em um balão volumétrico de 1 L, dissolve-se 72,413 g de nitrato de potássio em cerca de 900 ml de água desionizada. Após dissolução, adicionar água desionizada para levar o volume total até 1.000 ml.
   Nota: 1 ml de solução de estoque diluído para 1 L produz uma 10 ^mg L-1 _NO 3 ^- -N solução.
4. Prepare solução de alimentação / afluente. Para fazer uma solução de alimentação contendo 20 ^mg L-1 ⁺ -N NH ₄ e 20 ^mg L-1 _NO 3 ^- -N, dilui-se 2 ml de umasolução estoque mmonia e 2 ml de solução de nitrato ao volume total de 1 L. Antes da diluição, adicionar 0,5 ml de solução mineral / L de solução a ser feita. Prepare 5 L de influente no total para o arranque do reactor.
5. Prepara-se o inoculante algas.
   1. Recolher um volume grande (pelo menos de 10 L) de água a partir de uma massa de água que contém algas, tais como uma corrente ou tanque. Permitir que as algas para resolver, deixando as amostras de água em repouso por 24 horas.
   2. Decantar e rejeitar o claro (não contendo algas) de água na parte superior das amostras, deixando uma suspensão de algas concentrada dentro dos frascos de amostras. Combinar a suspensão de algas a partir de todas as amostras em um recipiente e repetir a sedimentação e passos de decantação.
   3. Medir a biomassa no interior da amostra concentrada.
      1. Seca-se um filtro de papel sob vácuo (filtro de vácuo de 0,45 um MCE) de alumínio e pesar barco O / N em um forno que tenha sido definido a 103 ° C Depois de arrefecimento num exsicador durante 30 min à TA medir a combined massa do filtro e pesar barco.
      2. Filtro de vácuo 20 ml de suspensão concentrada de algas e devolver o filtro e pesar barco para forno para secar S / N.
      3. Medir a massa combinada do filtro e pesar barco. Calcula-se a densidade de biomassa no interior da amostra concentrada.
         Nota: O volume total da amostra de água que os investigadores terá de recolher dependerá da massa de água fonte.

3. Sementeira e iniciando o Reactor

1. Adicionar 750 ml de solução de alimentação para o reactor. Encha o tanque de reciclagem com 500 ml de solução de alimentação.
2. Usar uma pipeta longa para adicionar suavemente uma suspensão inoculante contendo 1,5 g de algas perto da parte inferior do reactor. Permitir que o inoculo para assentar no fundo do reactor, assegurar esta por observação visual, antes de prosseguir para o próximo passo.
3. Uma vez que as células se instalaram, retire os grampos de tubo e ligue Bomba A a uma taxa de fluxo lento (10 revolutioNS min ^-1 / 38 mL min ^-1). Ar preso no tubo vai ser expelida para dentro do reactor.
   Nota: A adição de 750 ml para o reactor vai prevenir qualquer biomassa perturbado pela bomba de deixar o reactor. Espremer o tubo para assegurar que todo o ar foi expulso.
4. Gradualmente adicionar solução de alimentação para o tanque de reciclagem, como a solução é bombeada para dentro do reactor. Continuar a adição até que tanto o reactor e o tanque de reciclagem são no capacidade de efluentes e começa a sair do tanque de reciclagem através do topo da porta.
   Nota: O volume da solução de alimentação para ser adicionado ao tanque de reciclagem irá variar com o volume de inoculante adicionado ao reactor.
5. Verter a solução de alimentação remanescente no tanque de alimentação.
6. Defina a bomba de reciclagem (Bomba A) a 19 rotações ^min -1, estabelecendo uma taxa de fluxo de reciclagem de 72,5 ml ^min -1. Observar as algas para loft começar a partir do fundo do reactor. Usando as gradações no reactor, determinar o bi algasaltura zona omass. Assegure-se que a altura é constante antes de prosseguir para o próximo passo.
7. Ligue a placa de mistura a uma velocidade muito baixa; uma configuração de 1 ou 2 é apropriado para iniciar. O bar mistura irá ajudar na lofting biomassa mais longe, mas mistura agressiva fará com que as algas para deixar o reator, insira o tanque de reciclagem, e deixar no efluente. Ajuste a velocidade de mistura em uma configuração necessárias para estabelecer uma fronteira clara algas no interior do reactor (Figura 2A); a zona de biomassa de algas deve ser de aproximadamente de 10-15 cm de altura.
8. Comece a bomba de alimentação depois de observar uma clara fronteira entre o plugue de algas e do fluido reactor. Definir a bomba a 25 rotações min ^-1, estabelecendo uma taxa de fluxo de 1,5 ml min ^-1. Observe a saída de fluido do reactor a porta de efluentes devido à gravidade e deslocamento causado pela corrente influente de entrada.

4. Colheita e Análise

1. Realizar atividades de coleta de amostras priou para a manutenção do sistema de reactor. Coletar 20 ml de amostras de efluentes e influentes diária. Coletar amostras de efluentes de dentro do tanque de reciclagem. Coletar amostras influentes diretamente do tanque de alimentação.
2. Amostras de filtro a vácuo para remover os sólidos antes do armazenamento e análise suspensa.
3. Armazenar o influente e amostras de efluente à temperatura de -20 ° C até análise posterior. Limitar o número de ciclos de descongelamento congelamento as amostras são submetidas a. Se necessário, as amostras podem ser divididas em alíquotas para manter a integridade da amostra.
4. Realizar a análise da amostra de nitrato, nitrito e amônia, utilizando técnicas convencionais ^17.
   Nota: Os autores utilizaram Ion Chromatography (IC) para produzir os resultados aqui apresentados. Consulte a tabela de Materiais para a especificação.

Resultados

O HDBR foi usada para cultivar algas ao longo de várias proporções de concentrações de amônia e nitrato influente, mantendo um teor de nitrogênio total na ração a 40 mg -NL ^-1. Influente e amostras de efluentes foram tomados diariamente; amostras de densidade de biomassa foram tomadas no início e no final de cada condição. O reactor necessário em média 3-5 dias para atingir o equilíbrio de estado estacionário, após as condições foram alteradas. Ao longo de um vasto leque de condições infl...

Discussão

Esta secção irá começar com uma discussão sobre variações de protocolo necessárias para lidar com possíveis problemas operacionais, bem como a utilização de diferentes comunidades microbianas. Os pontos fortes deste projeto do reator será discutido, incluindo a capacidade de governar o controle de fluxo de oxigênio ea formação de flocos de alta densidade no interior do reactor. Os desafios actuais e possíveis vias de investigação também serão mencionados.

Protocolo de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aeration stone	Alita	AS-3015C
Aerator	Top Fin	Air-1000
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Anion analysis column	Shodex	IC SI-52 4E
Beaker (600 ml)	Corning Pyrex	1000-600	Used as mixing vessel (MV). Addition of hose barbs at the bottom and 500 ml levels. Outside diameter of hose barbs 3/8".
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C5670
Cation analysis column	Shodex	IC YS-50
Cobalt chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C8661
Copper chloride	Sigma Aldrich	222011
Ferric chloride	Sigma Aldrich	157740
Filter (vacuum)	Fisherbrand	09-719-2E	0.45 μm membrane filter, MCE, 47 mm diameter
Graduated cylinder (1,000 ml)	Corning Pyrex	3025-1L	Used as reactor vessel (R). Addition of hose barbs at bottom, 500 ml, and 1 L levels. Outside diameter of hose barbs 3/8".
HPLC/IC	Shimadzu	Prominence
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Masterflex L/S variable speed drive	Masterflex	07553-50	Drive for recycle and feed pumps (2 needed)
Nickel chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	N6136
Potassium nitrate	Sigma Aldrich	P8291
(Monobasic) Potassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
Pump head	Masterflex	07018-20	Recycle pump head
Pump head	Masterflex	07013-20	Feed pump head
Pump tubing	Masterflex	6404-18	Recycle pump tubing
Pump tubing	Masterflex	6404-13	Feed pump tubing
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z0251