多様な微生物群集の高密度栽培のための新しいバイオリアクター

要約

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

要約

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD¹ and nitrogen species^2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH₄⁺ and NO₃^- concentrations in the feed did not have an effect on NH₄⁺ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH₄⁺ feed concentration was found to be negatively related with NO₃^- removal (n=44, p=0.000) and NO₃^- feed concentration was found to be positively correlated with NO₃^- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH₄⁺, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH₄⁺ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

概要

地方自治体の廃水は、一般的に浮遊物質（SS）、生物学的酸素要求量（BOD）、有機および無機窒素、及びリン含量^{5,6を低減するために、}活性汚泥プロセスで処理されます。活性汚泥法、二次廃水処理の手段は、入ってくる廃水リサイクル従属栄養微生物の混合液を充填した曝気槽中の有機炭素の酸化を伴う^5-7（一般的に、活性汚泥と呼ばれます）。混合液は、その後明らかにし、下水処理水が中に放出される前に、三次処理や消毒に続けることができますが、汚泥は、曝気槽に配置されたか、再循環することのいずれかに、より簡単に収集するために落ち着く比較的大きな清澄（沈殿槽）に入り、受信水域^5-7。二次清澄における下水処理水と固形物（汚泥）の効率的な分離があったの適切な機能のために不可欠ですtewater処理システム、任意の活性汚泥が排出物^5-8の BODとSSを増加させる清澄を超えて継続しました。

代替生物学的プロセスの数が減少または（バイオフィルム）成長添付リアクター、メンブレンバイオリアクター（MBRの）、および粒状汚泥リアクターを含む大規模な明確タンクの必要性を排除する、廃水の二次処理のために存在します。バイオフィルムリアクターでは、骨材自然微生物および固体表面上の層として添付しているバイオフィルムの形成は、明確にタンクを必要とせずに、バイオマスの保存・蓄積することができます。バイオリアクターは、3種類に分類することができる：充填床反応器、流動床反応器、および生物接触器を回転させます。このようしたたるフィルタおよび生物学的塔として充填床反応器は、固定固体成長表面^{5,6を利用します。}流動床反応器（高速炉）は、粒子への微生物の付着に依存しますこのような高い上昇流速度^9,10によって懸濁液中に保持される砂、粒状活性炭（GAC）、またはガラスビーズ、など。回転の生物学的反応器は、バイオフィルムが交互に空気と^5,6を治療されている液体にさらされることを可能にする回転軸に取り付けられたメディア上に形成されたバイオフィルムによって異なります。 MBRのは、バイオリアクター（水没設定）内または外部再循環（サイドストリーム構成^）5,11のいずれかを介して、膜ろ過ユニットを使用しています。膜は、処理液^11,12からバイオマスおよび固体粒子の良好な分離を達成するのに役立ちます。グラニュール汚泥反応器は、それらが高い空塔上昇流速度¹³にさらされているときに、微生物の非常に緻密でよくセトリング顆粒の形成が発生する上昇流反応装置です。

活性汚泥プロセスの別の代替として、今高密度バイオリアクター（HDBR）と呼ばれる新規な上向流反応器システムは、designeましたDと貧しい沈降スラッジの発生を引き起こすことが知られている低F / Mの条件で合成廃棄物の流れ（ すなわち 、増量汚泥^）1,7,14から活性汚泥によりCOD除去を研究するために販売および（2006）Shiehによって建てられました。利用HDBRシステムは、典型的には、上向流反応器および外部循環タンクから成る流動床反応器を修正しました。バイオフィルムで覆われた基板が保持されるように、流動床反応器は、典型的には、十分に懸濁し、バイオフィルムの成長基体を維持するのに十分高いが、低再循環流の流量で作動されます。流動床反応器とは異なり、HDBRはセールスに記載されており、（2006）Shiehは、外部通気とともに、 ^反応器1内に形成されたバイオマスゾーンの破壊を防止し、比較的低い再循環流の流速を使用していました。その後の研究では、正常に硝化/脱窒細菌に^3,4を用いて、窒素フラックスの範囲を治療するために、この反応器設計の能力を実証しています。すべてのスタッドでHDBR内で安定、高密度のバイオマスゾーンの形成が外部凝集/沈降プロセス^1-4の必要性を排除IES。

私たちがここで報告したように、高密度の文化を成長させるHDBRの使用はまた、藻類の培養のための光バイオリアクター（PBR）の構成でテストされています。私たちは、藻類栽培とバイオマス収穫（ すなわち 、良好な固液分離^15,16）に関連した藻類バイオ燃料の実用化の大きなハードルを克服するために、その可能性のためにこの新規原子炉システムの利点と欠点について説明します。以下のプロトコルは、起動時からのサンプル、組み立て、および関心の微生物群集としての藻類とHDBRを維持するために必要な手順を説明します。従属と硝化/脱窒文化の起動と操作プロトコルの変化も言及されます。最後に、一般的な利点、欠点、およびこの新規原子炉の設計の未知数が強調表示されます。

プロトコル

1.原子炉アセンブリ

1. 図1の概略図によれば、原子炉コンポーネントを配置します。
   1. ミキシングプレート上リアクター（R）を配置し、反応器に攪拌棒を追加します。タンクの廃液（上）ポートは実験台の端に向けられているように、撹拌プレート、反応器の横にリサイクルタンク（RT）を配置します。
   2. リサイクルタンク（RT）の流出流（上）ポートの下に廃棄物容器（W）を配置します。リサイクルタンク（RT）の隣に供給タンク（FT）を配置します。
      注：供給タンクは、5 Lの総容量があります
2. 適切なサイズのスタンドとクランプで転倒に対してリアクター（R）を固定します。同様に、移動を防止するために、リサイクルタンク（RT）で固定します。
3. リサイクル（ポンプA）にネオプレン蠕動ポンプチューブを挿入し、（ポンプB）ポンプヘッドを養います。追加のチューブ仕様のための材料の表を参照してください。ネジ専らとポンプドライブにポンプヘッドを取り付けますポンプドライブでDED。
4. 原子炉のポートとリサイクルタンクにポンプAのチューブを接続します。供給タンクとリサイクルタンクにポンプBのチューブの端を挿入します。チューブとリサイクルタンクに上部原子炉ポートを接続します。原子炉ポートでチューブにクランプを適用します。
   注意：光合成コミュニティはランプによって提供人工照明から利益を得ることができます。

ストックソリューションの流入/供給溶液、および藻類接種の調製

1. ミネラル原液を準備します。 500mlの脱イオン水で1Lのメスフラスコに以下を加える：200gの炭酸水素ナトリウム、40グラムの一塩基性リン酸カリウム、4グラムの硫酸マグネシウム、4 gで塩化第二鉄、4グラムの塩化カルシウム、1gの塩化銅、1gのコバルト六水和物、1gの塩化ニッケル六水和物、1gの硫酸亜鉛七水和物。追加の脱イオン水400ミリリットルを追加します。塩の溶解を促進するために強制的に渦巻。以下のディス塩のolution 1にL.を溶液の総体積を脱イオン水を加えます
2. アンモニア原液を準備します。 1Lのメスフラスコに、約900 mlの脱イオン水の中での塩化アンモニウム38.214グラムを溶解します。溶解後、千ミリリットルの全容量のアップをもたらすために、脱イオン水を加えます。
   注：1 Lに希釈したストック溶液1mlは、10mgのL ^-1 NH ₄ ⁺ -N溶液が得られます。
3. 硝酸原液を準備します。 1Lのメスフラスコに、約900 mlの脱イオン水に硝酸カリウム72.413グラムを溶解します。溶解後、千ミリリットルの全容量のアップをもたらすために、脱イオン水を加えます。
   注： ^- -N溶液1Lに希釈したストック溶液1mlは、10mgのL ^-1 NO _{3が得られます} 。
4. フィード/流入溶液を準備します。 2mlの希-N ^- 20 mgのLを含む供給溶液^-1 NH ₄ ⁺ -Nと20mgのL ^-1 NO _{3を作成するには}mmoniaストック溶液と1 Lの総体積に対する硝酸ストック溶液2ml。希釈する前に、行われて溶液0.5mlミネラル溶液/ Lを追加します。原子炉を起動して、合計で流入の5リットルを準備します。
5. 藻類の接種を準備します。
   1. このような流れや池などの藻類含有水本体から大量の水（少なくとも10 L）を収集します。藻類は24時間静かに水試料を残すことによって解決することができます。
   2. サンプル瓶内に集中藻類懸濁液を残して、デカントし、サンプルの上部にクリア（非含有藻類）の水を捨てます。一つの容器にサンプルの全てから藻類サスペンションを結合し、沈降およびデカンテーションの手順を繰り返します。
   3. 濃縮試料中のバイオマスを測定します。
      1. COを測定し、室温で30分間デシケーター中で冷却した後103℃に設定されたオーブンでボートO / Nを秤量紙の真空フィルター（0.45μmのMCEの真空フィルター）とアルミニウムを乾燥フィルタの質量をmbined、ボートの重量を量ります。
      2. 真空フィルタ20濃厚藻の懸濁液1ml及びフィルタを返すとO / Nを乾燥させるためにオーブンへのボートの重量を量ります。
      3. フィルタの合計質量を測定し、ボートの重量を量ります。濃縮試料中のバイオマス密度を計算します。
         注：研究者が収集する必要があることを水試料の総容量は、ソース水域に依存します。

3.シーディングと原子炉の起動

1. 反応器に供給溶液の750ミリリットルを追加します。供給溶液500ミリリットルとリサイクルタンクを埋めます。
2. 静かに反応器の底部近くに藻類の1.5グラムを含む接種サスペンションを追加するために、長いピペットを使用してください。次のステップに進む前に、目視でこれを確実に、接種材料は、反応器の底に沈殿することを許可します。
3. 細胞が定着した後、（10 revolutioをチューブクランプを取り外し、ゆっくりと流量にポンプAをオンにしますNS分^-1 / 38ミリリットル分^-1）。チューブに閉じ込められた空気は、反応器内に放出されます。
   注：反応器への750ミリリットルの添加は、反応器を出るからポンプによって妨害任意のバイオマスを防ぐことができます。すべての空気が追い出されたことを確認するためにチューブを絞ります。
4. この溶液を反応器に注入されると、徐々に再循環タンクに供給溶液を加えます。原子炉とリサイクルタンクの両方がトップポートを介して循環タンクを終了する能力と廃液が開始になるまで追加を続けます。
   注：供給溶液の体積は、反応器に添加し接種の量に応じて変化する再循環タンクへ添加します。
5. 飼料タンクに残った供給溶液を注ぎます。
6. 分72.5ミリリットルのリサイクル流量を確立し^、-1分19回転に循環ポンプ（ポンプA）を設定^-1。藻類を守って反応器の底部からロフトを開始します。原子炉のグラデーションを使用して、藻類の双方向を決定omassゾーンの高さ。高さは、次のステップに進む前に一定であることを確認してください。
7. 非常に低速でミキシングプレートをオンにします。 1または2の設定が開始することが適切です。混合バーはさらに、バイオマスをロフティングを支援しますが、積極的な混合は、原子炉を残してリサイクルタンクを入力し、流​​出液中に残すために藻が発生します。原子炉（ 図2A）内の明確な藻類の境界を確立するために必要な設定で混合速度設定します。藻類バイオマスゾーンは高さが約10〜15 cmである必要があります。
8. 藻類プラグと原子炉流体との間の明確な境界を観察した後、供給ポンプを起動します。分1.5ミリリットルの流量を確立し^、-1分25回転にポンプを設定^-1。着信流入ストリームに起因する重力や位置ずれに原子炉流体出口に廃液ポートを確認します。

4.サンプルの収集と分析

1. サンプル収集活動のPRIを実行しまたは反応器システムのメンテナンスを実行します。毎日の流出と流入サンプルの20ミリリットルを収集します。リサイクルタンク内からの流出物のサンプルを収集します。供給タンクから直接流入サンプルを収集します。
2. 貯蔵前と分析に懸濁物質を除去するための真空フィルタサンプル。
3. さらなる分析まで-20℃で流入、流出液のサンプルを保管してください。制限の凍結融解サイクルのサンプル数は、にさらされます。必要に応じて、サンプルは、サンプルの完全性を維持するためにアリコートに分割することができます。
4. 標準的な技術^{17を用いて}硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニアのサンプルの分析を行います。
   注意：イオンクロマトグラフィー（IC）を利用著者らは、本明細書に提示される結果を生成します。仕様のための材料の表を参照してください。

結果

40 mgの-NL ^-1で供給物中の全窒 ​​素含有量を維持しながらHDBRは、流入アンモニアと硝酸塩濃度のいくつかの比率の上に藻類を育成するために使用されました。流入、流出液のサンプルを毎日採取しました。バイオマス濃度試料を各条件の開始時と終了時に採取しました。反応器は、条件を変更した後に定常状態の平衡に到達するのに平均3-5日かかりました。流入条件の広い範囲にわ...

ディスカッション

このセクションでは、可能な運用上の問題に対処するだけでなく、異なる微生物群集を使用するために必要なプロトコルの変化の議論で開始します。この反応器の設計の長所は、反応器内の酸素フラックス及び高密度フロックの形成制御を管理する能力を含めて、説明されます。現在の課題や調査の可能な手段も言及されます。

プロトコルニュアンスとバリエーショ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aeration stone	Alita	AS-3015C
Aerator	Top Fin	Air-1000
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Anion analysis column	Shodex	IC SI-52 4E
Beaker (600 mL)	Corning Pyrex	1000-600	Used as mixing vessel (MV). Addition of hose barbs at the bottom and 500 mL levels. Outside diameter of hose barbs 3/8".
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C5670
Cation analysis column	Shodex	IC YS-50
Cobalt chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C8661
Copper chloride	Sigma Aldrich	222011
Ferric chloride	Sigma Aldrich	157740
Filter (vacuum)	Fisherbrand	09-719-2E	0.45 um membrane filter, MCE, 47 mm diameter
Graduated cylinder (1000 mL)	Corning Pyrex	3025-1L	Used as reactor vessel (R). Addition of hose barbs at bottom, 500 mL, and 1 L levels. Outside diameter of hose barbs 3/8".
HPLC/IC	Shimadzu	Prominence
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Masterflex L/S variable speed drive	Masterflex	07553-50	Drive for recycle and feed pumps (2 needed)
Nickel chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	N6136
Potassium nitrate	Sigma Aldrich	P8291
(Monobasic) Potassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
Pump head	Masterflex	07018-20	Recycle pump head
Pump head	Masterflex	07013-20	Feed pump head
Pump tubing	Masterflex	6404-18	Recycle pump tubing
Pump tubing	Masterflex	6404-13	Feed pump tubing
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z0251