Un bioréacteur pour Novel Haute Culture de la densité des communautés microbiennes diverses

Résumé

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Résumé

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD¹ and nitrogen species^2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH₄⁺ and NO₃^- concentrations in the feed did not have an effect on NH₄⁺ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH₄⁺ feed concentration was found to be negatively related with NO₃^- removal (n=44, p=0.000) and NO₃^- feed concentration was found to be positively correlated with NO₃^- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH₄⁺, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH₄⁺ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

Introduction

Les eaux usées municipales est généralement traitée avec des procédés à boues activées afin de réduire les matières en suspension (MES), la demande biologique en oxygène (DBO), de l'azote organique et inorganique, et la teneur en phosphore ^{de 5,6.} Le procédé de boues activées, un moyen de traitement secondaire des eaux usées, entraîne l'oxydation du carbone organique dans un bassin d'aération rempli d'une liqueur mixte des eaux usées entrant et micro-organisme hétérotrophe recyclé (communément appelé boues activées) ^5-7. La liqueur mixte entre alors dans une relativement grande clarificateur (de bassin de décantation) où la boue se dépose pour la collecte plus facile, soit être éliminés ou recyclés dans le bassin d'aération, tandis que le, les eaux usées traitées clarifié peut continuer à un traitement tertiaire ou la désinfection avant d'être libéré en eaux réceptrices ^5-7. La séparation efficace des eaux usées traitées et des solides (boues) dans le décanteur secondaire est essentiel pour le bon fonctionnement d'un étéSystème de traitement des tewater, tout comme la boue activée en continuant au-delà des clarificateurs augmentera la DBO et SS dans l'effluent ^5-8.

Un certain nombre de processus biologiques alternatives existent pour le traitement secondaire des eaux usées, qui réduisent ou éliminent la nécessité pour les grands réservoirs de clarification, y compris la croissance jointe (biofilm) réacteurs, bioréacteurs à membranes (MBR) de, et les réacteurs de boues granulaires. Dans les réacteurs à film biologique, la formation de biofilms, dans lequel les micro-organismes naturellement ensemble et fixer comme une couche sur une surface solide, permet la rétention et l'accumulation de la biomasse sans la nécessité d'une cuve de clarification. Biofilm réacteurs peuvent être classés en trois types: les réacteurs à lit garni, réacteurs à lit fluidisé, et contacteurs biologiques rotatifs. Des réacteurs à lit paniers, comme un filtres bactériens et des tours biologiques, utilisent une surface de croissance solide fixe ^5,6. Les réacteurs à lit fluidisé (FBR) dépendent de la fixation de micro-organismes à des particules,tel que du sable, du charbon actif granulaire (GAC), ou des billes de verre, qui sont maintenus en suspension par un courant ascendant de vitesse élevé ^9,10. Rotation des réacteurs biologiques dépendent de biofilms formés sur des supports fixés à un arbre rotatif permettant le biofilm pour être alternativement exposées à l'air et le liquide à traiter ^{de 5,6.} MBR membrane utilisent des unités de filtration, soit dans le bioréacteur (configuration immergée) ou en externe via recirculation (configuration courant latéral) ^5,11. Les membranes servent à obtenir une bonne séparation de la biomasse et de particules solides à partir du liquide traité ^11,12. Réacteurs de boue granulaire sont des réacteurs à flux ascendant dans lequel la formation de granules extrêmement dense et bien-décantation de micro-organismes se produit quand ils sont exposés à courant ascendant d'air superficielle des vitesses élevées ^13.

Dans une autre variante au procédé à boues activées, un système de réacteur à courant ascendant roman, maintenant appelé un bioréacteur à haute densité (HDBR), était designed et construit par des ventes et Shieh (2006) pour étudier la DCO par boues activées à partir de flux de déchets synthétiques dans des conditions de faible F / M qui sont connus pour provoquer la formation de mauvaise boues de décantation (c.-à-gonflement des boues) ^1,7,14. Le système de HDBR utilisée à jour réacteurs à lit fluidisé qui se composent typiquement d'un réacteur ascendant et un réservoir de recyclage externe. Réacteurs à lit fluidisé sont généralement utilisés avec des débits de flux de recyclage suffisamment élevées pour maintenir le substrat de croissance du biofilm en suspension mais suffisamment basse de sorte que le substrat recouvert d'un biofilm est conservée. Contrairement réacteurs à lit fluidisé, l'HDBR décrit dans les ventes et Shieh (2006) a utilisé des débits des cours d'eau de recyclage relativement faibles qui, avec l'aération externe, ont empêché la rupture de la zone de biomasse formée dans le réacteur ^1. Des études ultérieures ont démontré la capacité de cette conception du réacteur pour traiter avec succès une gamme de flux d'azote à l'aide de nitrification / dénitrification bactéries ^3,4. Dans tous les studies la formation d'une zone dense de la biomasse stable dans la HDBR a éliminé la nécessité d'un processus / d'une sédimentation de floculation externe ^1-4.

Comme nous rapportons ici, l'utilisation de la HDBR de cultiver des cultures denses a également été testé dans un photobioréacteur (PBR) pour la configuration de la culture d'algues. Nous discutons les avantages et les inconvénients de ce nouveau système de réacteur pour la culture d'algues et de son potentiel pour surmonter un grand obstacle à la commercialisation de biocarburants d'algues associés à la récolte de biomasse (à savoir, une bonne séparation solide-liquide ^15,16). Le protocole suivant décrit les étapes nécessaires à l'assemblage, au démarrage, à partir de l'échantillon, et de maintenir un HDBR avec des algues que la communauté microbienne d'intérêt. Variations dans le démarrage et le fonctionnement protocole de cultures hétérotrophes et nitrification / dénitrification seront également mentionnés. Enfin, les avantages, les inconvénients, générales et inconnues de cette nouvelle conception de réacteur seront mis en évidence.

Protocole

1. Assemblée Réacteur

1. Disposer les composants du réacteur selon le schéma de la figure 1.
   1. Placez le réacteur (R) sur une plaque de mélange, ajouter une barre d'agitation dans le réacteur. Placez le réservoir de recyclage (RT) à côté de la plaque d'agitation et le réacteur de telle sorte que l'orifice d'effluent (en haut) du réservoir est dirigée vers le bord de la table de laboratoire.
   2. Placer le récipient de déchets (W) au-dessous de l'orifice d'effluent (en haut) de la cuve de recyclage (RT). Placez le réservoir d'alimentation (FT) à côté du réservoir de recyclage (RT).
      Remarque: Le réservoir d'alimentation a une capacité totale de 5 L.
2. Fixez le réacteur (R) contre le basculement avec un stand et le collier de taille appropriée. De même, fixer le réservoir de recyclage (RT) pour empêcher le mouvement.
3. Insérez néoprène tubes de pompe péristaltique dans le recyclage (Pompe A) et nourrir têtes (Pompe B) de la pompe. Reportez-vous à la table des matières pour les spécifications de tubes supplémentaires. Installez les têtes de pompe sur les entraînements de pompe avec les vis dispoded avec les entraînements de pompe.
4. Connectez le tuyau de la pompe A aux ports sur le réacteur et le réservoir de recyclage. Insérez l'extrémité de la tubulure de la pompe B dans le réservoir d'alimentation et le réservoir de recyclage. Connectez le port du réacteur haut vers le réservoir de recyclage avec des tubes. Appliquer brides à la tubulure au niveau des ports du réacteur.
   Remarque: les communautés photosynthétiques peuvent bénéficier de l'éclairage artificiel fourni par des lampes.

2. Préparation des solutions mères, Solutions Influent / d'alimentation, et les algues Inoculant

1. Préparer la solution minérale de stock. Ajouter ce qui suit à un 1 L fiole jaugée de 500 ml d'eau déminéralisée: 200 g de bicarbonate de sodium, 40 g de phosphate monobasique de potassium, le sulfate de magnésium 4 g, 4 g de chlorure ferrique, 4 g de chlorure de calcium, 1 g de chlorure de cuivre, 1 g de cobalt chlorure hexahydraté, 1 g de chlorure de nickel hexahydraté, 1 g de sulfate de zinc heptahydraté. Ajouter un 400 ml supplémentaires d'eau déminéralisée. Agiter vigoureusement pour encourager la dissolution de sels. Diss suivantsolution de sels, ajouter de l'eau désionisée pour porter le volume total de solution à 1 L.
2. Préparer la solution d'ammoniac stock. Dans une fiole jaugée de 1 litre, dissoudre 38.214 grammes de chlorure d'ammonium dans environ 900 ml d'eau désionisée. Après dissolution, ajouter de l'eau désionisée pour porter le volume total à 1000 ml.
   Note: 1 ml de solution d'achat d'actions dilué à 1 L donne un 10 mg ^L -1 _NH 4 ⁺ -N solution.
3. Préparer la solution de nitrate de stock. Dans une fiole jaugée de 1 litre, on dissout 72,413 g de nitrate de potassium dans environ 900 ml d'eau désionisée. Après dissolution, ajouter de l'eau désionisée pour porter le volume total à 1000 ml.
   Note: 1 ml de solution d'achat d'actions dilué à 1 L donne un 10 mg ^L -1 _NO 3 ^- -N solution.
4. Préparer la solution d'alimentation / affluent. Pour faire une solution d'alimentation contenant 20 mg ^L -1 _NH 4 ⁺ -N et 20 mg ^L -1 _NO 3 ^- -N, diluer 2 ml d'unemmonia solution de stock et 2 ml de solution de nitrate d'achat d'actions à 1 L volume total. Avant la dilution, ajouter 0,5 ml de solution minérale / L de solution réalisés. Préparer 5 litres d'affluent au total pour démarrer le réacteur.
5. Préparer l'inoculant des algues.
   1. Recueillir un grand volume (au moins 10 L) d'eau à partir d'un corps de l'eau contenant des algues comme un ruisseau ou un étang. Laisser les algues à régler en laissant les échantillons d'eau au repos pendant 24 heures.
   2. Décanter et jeter le (non-algues contenant) l'eau claire au sommet des échantillons, laissant une suspension d'algues concentrée dans les bouteilles d'échantillon. Combinez la suspension d'algues de tous les échantillons dans un récipient et répéter la décantation et étapes de décantation.
   3. Mesurer la biomasse au sein de l'échantillon concentré.
      1. Séchez un filtre à vide de papier (filtre à vide de 0,45 um MCE) et d'aluminium peser bateau O / N dans un four qui a été réglé à 103 ° C Après refroidissement dans un dessiccateur pendant 30 min à température ambiante mesurer la combined masse du filtre et peser bateau.
      2. On filtre sous vide de 20 ml de concentré suspension d'algues et retourner le filtre et peser bateau au four pour sécher O / N.
      3. Mesurer la masse combinée du filtre et peser bateau. Calculer la densité de la biomasse à l'intérieur de l'échantillon concentré.
         Remarque: Le volume total d'échantillon d'eau que les enquêteurs devront recueillir dépendra de la masse d'eau de la source.

3. L'ensemencement et démarrage du réacteur

1. Ajouter 750 ml de solution d'alimentation dans le réacteur. Remplir le réservoir de recyclage avec 500 ml de solution d'alimentation.
2. Utiliser une pipette pour ajouter longue doucement inoculer une suspension contenant 1,5 g d'algues près du fond du réacteur. Laisser l'inoculum se déposer au fond du réacteur, assurer ce par observation visuelle, avant de passer à l'étape suivante.
3. Une fois que les cellules se sont installés, retirez les colliers de serrage et tourner sur la pompe A à un débit lent (10 revolutions min ^-1/38 ml ^min -1). L'air emprisonné dans le tube sera expulsé dans le réacteur.
   Remarque: L'addition de 750 ml dans le réacteur permet d'éviter toute biomasse perturbé par la pompe à partir de la sortie du réacteur. Presser le tube pour assurer que tout l'air a été expulsé.
4. Ajouter graduellement la solution d'alimentation vers le réservoir de recyclage en tant que la solution est pompée dans le réacteur. Continuer l'addition jusqu'à ce que à la fois le réacteur et le réservoir de recyclage sont à pleine capacité et commence effluents pour sortir de la cuve de recyclage via le port haut.
   Remarque: Le volume de la solution d'alimentation pour être ajouté à la cuve de recyclage varie avec le volume de l'inoculum ajouté dans le réacteur.
5. Verser la solution d'alimentation restant dans le réservoir d'alimentation.
6. Régler la pompe de recyclage (Pompe A) à 19 tours ^min -1, établissant un débit de recyclage de 72,5 ml ^min -1. Observer les algues grenier commencent à partir du fond du réacteur. En utilisant les graduations sur le réacteur, déterminer le bi d'alguesomass hauteur de la zone. Assurez-vous que la hauteur est constante avant de passer à l'étape suivante.
7. Tournez sur la plaque de mélange à très basse vitesse; une valeur de 1 ou 2 est approprié de commencer. La barre de mélange aidera à lofting biomasse plus loin, mais mélange agressif provoquer des algues de quitter le réacteur, entrer dans le réservoir de recyclage, et laisser dans l'effluent. Réglez la vitesse de mélange à un réglage nécessaire d'établir une limite d'algues clairement l'intérieur du réacteur (figure 2A); la zone de biomasse d'algues doit être d'environ 10 à 15 cm de hauteur.
8. Démarrer la pompe d'alimentation après avoir observé une frontière claire entre la prise d'algues et le fluide du réacteur. Régler la pompe à 25 tours min ^-1, en ​​établissant un débit de 1,5 ml min ^-1. Observer la sortie de fluide de l'orifice réacteur effluent due à la gravité et du déplacement provoqué par le courant d'arrivée entrant.

4. Collecte et analyse des échantillons

1. Mener des activités de collecte de l'échantillon priou pour de la maintenance du système de réacteur. Recueillir 20 ml d'échantillons d'effluents et influents quotidienne. Prélever des échantillons d'effluents de l'intérieur du réservoir de recyclage. Prélever des échantillons de l'influent directement à partir du réservoir d'alimentation.
2. Des échantillons de filtre sous vide pour éliminer les solides avant le stockage et l'analyse suspendus.
3. Stocker l'affluent et les échantillons d'effluents à -20 ° C jusqu'à une analyse plus approfondie. Limiter le nombre de cycles de gel-dégel échantillons sont soumis. Si nécessaire, des échantillons peuvent être divisés en aliquotes pour maintenir l'intégrité de l'échantillon.
4. Procéder à une analyse de l'échantillon de nitrate, nitrite, l'ammoniac et utilisant des techniques standard ^17.
   Remarque: Les auteurs utilisés chromatographie ionique (IC) pour produire les résultats présentés ici. Reportez-vous à la table des matières pour la spécification.

Résultats

Le HDBR a été utilisé pour cultiver des algues sur plusieurs rapports de concentrations d'ammoniaque et influent nitrate, tout en maintenant une teneur totale en azote dans la charge à 40 mg -NL ^-1. Influent et des échantillons d'effluents ont été prélevés quotidiennement; Des échantillons de densité de la biomasse ont été prélevés au début et à la fin de chaque état. Le réacteur a fallu en moyenne 3-5 jours pour atteindre l'état d'équilibre après conditions ont été mod...

Discussion

Cette section commence par une discussion des variations de protocole nécessaires pour régler des problèmes opérationnels possibles ainsi que l'aide de différentes communautés microbiennes. Les points forts de ce modèle de réacteur seront discutés, y compris la capacité de gouverner le contrôle des flux d'oxygène et la formation de flocs de haute densité dans le réacteur. Les défis actuels et les possibilités d'investigation seront également mentionnés.

Nuan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aeration stone	Alita	AS-3015C
Aerator	Top Fin	Air-1000
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Anion analysis column	Shodex	IC SI-52 4E
Beaker (600 mL)	Corning Pyrex	1000-600	Used as mixing vessel (MV). Addition of hose barbs at the bottom and 500 mL levels. Outside diameter of hose barbs 3/8".
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C5670
Cation analysis column	Shodex	IC YS-50
Cobalt chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C8661
Copper chloride	Sigma Aldrich	222011
Ferric chloride	Sigma Aldrich	157740
Filter (vacuum)	Fisherbrand	09-719-2E	0.45 um membrane filter, MCE, 47 mm diameter
Graduated cylinder (1000 mL)	Corning Pyrex	3025-1L	Used as reactor vessel (R). Addition of hose barbs at bottom, 500 mL, and 1 L levels. Outside diameter of hose barbs 3/8".
HPLC/IC	Shimadzu	Prominence
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Masterflex L/S variable speed drive	Masterflex	07553-50	Drive for recycle and feed pumps (2 needed)
Nickel chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	N6136
Potassium nitrate	Sigma Aldrich	P8291
(Monobasic) Potassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
Pump head	Masterflex	07018-20	Recycle pump head
Pump head	Masterflex	07013-20	Feed pump head
Pump tubing	Masterflex	6404-18	Recycle pump tubing
Pump tubing	Masterflex	6404-13	Feed pump tubing
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z0251