Un bioreattore Novel per l'alta densità di coltivazione diverse comunità microbiche

Riepilogo

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Abstract

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD¹ and nitrogen species^2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH₄⁺ and NO₃^- concentrations in the feed did not have an effect on NH₄⁺ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH₄⁺ feed concentration was found to be negatively related with NO₃^- removal (n=44, p=0.000) and NO₃^- feed concentration was found to be positively correlated with NO₃^- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH₄⁺, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH₄⁺ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

Introduzione

Reflui urbani è comunemente trattati con processo a fanghi attivi per ridurre i solidi sospesi (SS), richiesta di ossigeno biologica (BOD), azoto organico e inorganico, e fosforo ^5,6. Il processo a fanghi attivi, un mezzo di depurazione secondario, comporta l'ossidazione del carbonio organico in una vasca di aerazione riempito con un liquido misto di refluo e riciclati microrganismi eterotrofi (comunemente indicato come fanghi attivi) ^5-7. Il liquido misto quindi entra in una relativamente grande chiarificatore (decantatore) dove il fango si deposita per facilitare la raccolta, sia di essere smaltiti o riciclati al serbatoio di aerazione, mentre, acque reflue trattate chiarificata può continuare a trattamento terziario o disinfezione prima di essere rilasciato in acque riceventi ^5-7. Separazione efficiente di acque reflue trattate e solidi (fanghi) nel chiarificatore secondario è essenziale per il corretto funzionamento di un erasistema di trattamento tewater, come ogni fanghi attivi continuare al di là dei chiarificatori aumenterà la BOD e SS nell'effluente ^5-8.

Un certo numero di processi biologici alternative esistono per trattamento secondario delle acque reflue, che riducono o eliminano la necessità di grandi serbatoi chiarificatori, compresi crescita divisoria (biofilm) reattori, bioreattori a membrana (MBR), e reattori fanghi granulari. Nei reattori biofilm, la formazione di biofilm, in cui i microrganismi naturalmente aggregato e collegare come uno strato su una superficie solida, permette di ritenzione biomassa e accumulo senza la necessità di un serbatoio chiarire. Reattori biofilm possono essere classificati in tre tipi: i reattori a letto ricco, reattori a letto fluido, e la rotazione contattori biologici. Reattori a letto pranzo, come un percolatori e torri biologiche, utilizzano un stazionario superficie solida crescita ^5,6. Reattori a letto fluidizzato (FBRs) dipendono dalla attacco dei microrganismi di particelle,come sabbia, carbone attivo granulare (GAC), o di perle di vetro, che sono tenuti in sospensione da un alto tasso di flusso verso l'alto ^9,10. Rotazione reattori biologici dipendono biofilm formati sulla media associati ad un albero rotante che consentono il biofilm essere alternativamente esposte all'aria e il liquido viene trattata ^5,6. MBR utilizzano unità di filtrazione a membrana, sia all'interno del bioreattore (configurazione sommerso) o esternamente tramite ricircolo (configurazione side-stream) ^5,11. Le membrane servono per ottenere una buona separazione della biomassa e particelle solide dal liquido trattato ^11,12. Reattori fango granulare sono reattori flusso verso l'alto in cui la formazione di granuli estremamente densi e ben sedimentazione di microrganismi si verifica quando sono esposti a elevato flusso verso l'alto dell'aria superficiale velocità vettoriale ^13.

Come ulteriore alternativa al processo a fanghi attivi, un reattore upflow romanzo, ora chiamato un bioreattore ad alta densità (HDBR), era designed e costruito da vendite e Shieh (2006) per studiare la rimozione COD da fanghi attivi dai flussi di rifiuti sintetici in condizioni di scarsa F / M che sono noti per causare la formazione di cattiva decantazione fanghi (cioè, carica fanghi) ^1,7,14. Il sistema utilizzato HDBR modificato reattori a letto fluido che in genere consistono di un reattore flusso verso l'alto e un serbatoio di riciclo esterno. Reattori a letto fluido sono in genere azionati con corrente di riciclo Portate abbastanza alto per mantenere il substrato di crescita biofilm sospeso ma bassi abbastanza in modo che il substrato biofilm coperte viene mantenuta. A differenza di reattori a letto fluido, il HDBR descritto nelle vendite e Shieh (2006) ha usato le portate del flusso di riciclaggio relativamente bassi che, insieme con aerazione esterna, impedito interruzione della zona di biomassa formata all'interno del reattore ^1. Studi successivi hanno dimostrato la capacità di questo progetto del reattore di trattare con successo una serie di flussi di azoto utilizzando nitrificanti / batteri denitrificanti ^3,4. In tutto stalloneies la formazione di una stabile, zona biomassa densa all'interno HDBR eliminato la necessità di un processo di flocculazione / sedimentazione esterno ^1-4.

Come riportiamo qui, l'uso del HDBR crescere culture dense è stato anche testato in una configurazione photobioreactor (PBR) alla coltura delle alghe. Discutiamo i vantaggi e gli svantaggi di questo sistema reattore romanzo per la coltivazione delle alghe e le sue potenzialità per superare un grande ostacolo nella commercializzazione di biocarburanti algali associati alla raccolta di biomassa (ad esempio, una buona separazione solido-liquido ^15,16). Il protocollo che segue illustra i passaggi necessari per assemblare, avvio, campione, e mantenere un HDBR con alghe come la comunità microbica di interesse. Saranno inoltre menzionate variazioni del protocollo di avvio e il funzionamento delle culture eterotrofi e nitrificazione / denitrificanti. Infine, saranno evidenziati i vantaggi generali, gli svantaggi e le incognite di questo disegno romanzo reattore.

Protocollo

1. Reattore Assemblea

1. Disporre i componenti del reattore secondo lo schema di figura 1.
   1. Posizionare il reattore (R) su una piastra di miscelazione, aggiungere una ancoretta al reattore. Posizionare il serbatoio di riciclo (RT) accanto alla piastra di agitazione e reattore in modo che la porta effluente (superiore) del serbatoio è diretto verso il bordo del banco di laboratorio.
   2. Posizionare il contenitore degli scarti (W) sotto la porta di effluente (superiore) del serbatoio di riciclo (RT). Posizionare il serbatoio di alimentazione (FT) accanto al serbatoio di riciclo (RT).
      Nota: Il serbatoio di alimentazione ha una capacità totale di 5 L.
2. Fissare il reattore (R) contro il ribaltamento con uno stand di dimensioni appropriate e morsetto. Allo stesso modo, fissare il serbatoio di riciclo (RT) per impedire il movimento.
3. Inserire neoprene tubo della pompa peristaltica nel riciclo (Pompa A) e dei mangimi teste (pompa B) pompa. Fare riferimento alla tabella dei materiali per le specifiche tubi aggiuntivi. Installare le teste delle pompe sulle pompe con le viti Provided con gli accoppiatori.
4. Collegare il tubo di pompa A per le porte sul reattore e la vasca di riciclo. Inserire l'estremità del tubo di pompa B nel serbatoio di alimentazione e il serbatoio di riciclo. Collegare la porta del reattore superiore al serbatoio di riciclo con la tubazione. Applicare fascette al tubo nei porti reattore.
   Nota: Le comunità fotosintetici possono beneficiare di illuminazione artificiale fornita da lampade.

2. Preparazione di soluzioni di riserva, Affluente / mangimi Solutions, e alghe Inoculant

1. Preparare la soluzione minerale magazzino. Aggiungere quanto segue in un matraccio da 1 L con 500 ml di acqua deionizzata: 200 g di bicarbonato di sodio, 40 g di fosfato monobasico di potassio, 4 g di solfato di magnesio, 4 g di cloruro ferrico, 4 g di cloruro di calcio, 1 g di cloruro di rame, 1 g di cobalto cloruro esaidrato, 1 g di cloruro esaidrato di nichel, 1 g di solfato di zinco eptaidrato. Aggiungere ulteriori 400 ml di acqua deionizzata. Agitare con forza per favorire la dissoluzione dei sali. A seguito di dissoluzione di sali, aggiungere acqua deionizzata per portare il volume totale di soluzione per 1 L.
2. Preparare la soluzione di ammoniaca magazzino. In un matraccio tarato da 1 L, sciogliere 38.214 grammi di cloruro di ammonio in circa 900 ml di acqua deionizzata. Dopo la dissoluzione, aggiungere acqua deionizzata per portare il volume totale a 1.000 ml.
   Nota: 1 ml di soluzione madre diluita a 1 L rendimenti a 10 mg ^L-1 _NH 4 ⁺ -N soluzione.
3. Preparare la soluzione di nitrato. In un matraccio tarato da 1 L, sciogliere 72,413 g di nitrato di potassio in circa 900 ml di acqua deionizzata. Dopo la dissoluzione, aggiungere acqua deionizzata per portare il volume totale a 1.000 ml.
   Nota: 1 ml di soluzione madre diluita a 1 L ottiene un 10 mg ^{L-1 _NO} 3 - -N soluzione.
4. Preparare alimentazione soluzione / influente. Per fare una soluzione di alimentazione contenente 20 mg L ^-1 NH ₄ ⁺ -N e 20 mg L ^-1 NO ₃ ^- -N, diluire 2 ml di unasoluzione stock mmonia e 2 ml di nitrato di soluzione madre al volume totale 1 L. Prima della diluizione, aggiungere 0,5 ml soluzione minerale / L di soluzione compiuti. Preparare 5 L di influente in totale per avviare il reattore.
5. Preparare il inoculante alghe.
   1. Raccogliere un grande volume (almeno 10 L) di acqua da un corpo idrico alghe contenente come un ruscello o stagno. Lasciare che le alghe di stabilirsi lasciando i campioni di acqua indisturbato per 24 ore.
   2. Decantare e scartare chiaro (non contenente alghe) acqua in cima dei campioni, lasciando una sospensione concentrata di alghe all'interno dei contenitori. Unire la sospensione di alghe da tutti i campioni in un contenitore e ripetere la decantazione e gradini decantazione.
   3. Misurare la biomassa all'interno del campione concentrato.
      1. Essiccare un filtro di carta vuoto (0,45 micron MCE filtro a vuoto) e alluminio pesare barca O / N in un forno che è stato impostato a 103 ° C Dopo raffreddamento in essiccatore per 30 minuti a RT misurare la combined massa del filtro e pesare barca.
      2. Filtro a vuoto 20 ml di sospensione concentrata di alghe e restituire il filtro e pesare barca a forno ad asciugare O / N.
      3. Misurare la massa combinata del filtro e pesare barca. Calcolare la densità della biomassa nel campione concentrato.
         Nota: Il volume totale di campione che gli investigatori dovranno raccogliere dipenderà corpo acqua di fonte.

3. Semina e avvio il reattore

1. Aggiungere 750 ml di soluzione di alimentazione al reattore. Riempire il serbatoio di riciclo con 500 ml di soluzione di alimentazione.
2. Utilizzare una lunga pipetta per aggiungere delicatamente una sospensione inoculare contenente 1,5 g di alghe vicino al fondo del reattore. Consentire l'inoculo di depositarsi sul fondo del reattore, garantisce questo mediante osservazione visiva, prima di procedere alla fase successiva.
3. Una volta che le cellule si sono stabiliti, rimuovere i fermagli del tubo e accendere Pompa A per una portata lenta (10 Revolutions min ^-1/38 ml ^min -1). Aria intrappolata nel tubo sarà espulso nel reattore.
   Nota: L'aggiunta di 750 ml al reattore impedirà qualsiasi biomassa disturbati dalla pompa in uscita dal reattore. Spremere il tubo per assicurare che tutta l'aria è stata espulsa.
4. Aggiungere gradualmente soluzione di alimentazione al serbatoio di riciclo come la soluzione viene pompata nel reattore. Continuare l'aggiunta fino sia il reattore e il serbatoio di riciclo sono a capacità e inizia effluenti uscire serbatoio riciclo tramite la porta superiore.
   Nota: Il volume di soluzione di carica da aggiungere al serbatoio di riciclo varierà con il volume del inoculante aggiunta al reattore.
5. Versare la soluzione di alimentazione rimanente nel serbatoio di alimentazione.
6. Impostare la pompa di ricircolo (Pompa A) a 19 giri ^min -1, che stabilisce un flusso di riciclo del 72,5 ml ^min -1. Osservare le alghe cominciano a soppalco dal fondo del reattore. Utilizzando le gradazioni sul reattore, determinare il bi alghealtezza zona omass. Assicurarsi che l'altezza è costante prima di procedere alla fase successiva.
7. Accendere la piastra di miscelazione a velocità molto bassa; un ambiente di 1 o 2 è opportuno iniziare. La barra di miscelazione aiuterà a loft ulteriore biomassa, ma miscelazione aggressivo causerà alghe per lasciare il reattore, inserire il serbatoio di riciclo, e lasciare in effluenti. Impostare miscelazione velocità ad un ambiente necessario per stabilire un confine netto alghe all'interno del reattore (Figura 2A); zona biomassa algale dovrebbe essere di circa 10-15 cm di altezza.
8. Avviare la pompa di alimentazione dopo aver osservato un chiaro confine tra la spina algale e il fluido del reattore. Impostare la pompa 25 giri min ^-1, che stabilisce un flusso di 1,5 ml min ^-1. Osservare l'uscita del fluido del reattore porto effluente dovuta alla gravità e spostamento causato dal flusso entrante in entrata.

4. Raccolta e analisi

1. Svolgere attività di raccolta dei campioni prio per eseguire la manutenzione del sistema reattore. Raccogliere 20 ml di campioni di effluenti e influenti quotidiano. Raccogliere campioni effluenti all'interno della vasca di riciclo. Raccogliere campioni influenti direttamente dal serbatoio di alimentazione.
2. Campioni del filtro di vuoto per rimuovere i solidi prima di archiviazione e l'analisi sospesi.
3. Conservare influente ed effluente campioni a -20 ° C fino ad ulteriore analisi. Limitare il numero di cicli di scongelamento congelare i campioni sono sottoposti. Se necessario, i campioni possono essere suddivisi in aliquote per mantenere l'integrità del campione.
4. Effettuare analisi campione per nitrati, nitriti, ammoniaca e utilizzando tecniche standard ^17.
   Nota: Gli autori hanno utilizzato cromatografia ionica (IC) per produrre i risultati presentati nel presente documento. Fare riferimento alla tabella dei materiali per la specifica.

Risultati

Il HDBR stato usato per coltivare le alghe in diversi rapporti di concentrazione influente ammoniaca e nitrati, pur mantenendo un contenuto di azoto totale nel mangime a 40 mg -NL ^-1. Influente e campioni effluenti sono stati presi tutti i giorni; campioni di densità di biomassa sono stati prelevati all'inizio e alla fine di ogni condizione. Il reattore sono voluti in media 3-5 giorni per raggiungere l'equilibrio di stato stazionario dopo sono state modificate le condizioni. Su una vasta gamma di con...

Discussione

Questa sezione inizia con una discussione di variazioni di protocollo necessari per affrontare eventuali questioni operative, nonché utilizzando diverse comunità microbiche. La forza di questo disegno reattore saranno discussi, tra cui la possibilità di governare il controllo del flusso di ossigeno e la formazione di fiocchi alta densità all'interno del reattore. Saranno inoltre menzionate le sfide attuali e le possibili vie di studio.

Protocollo sfumature e variazioni

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aeration stone	Alita	AS-3015C
Aerator	Top Fin	Air-1000
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434
Anion analysis column	Shodex	IC SI-52 4E
Beaker (600 mL)	Corning Pyrex	1000-600	Used as mixing vessel (MV). Addition of hose barbs at the bottom and 500 mL levels. Outside diameter of hose barbs 3/8".
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C5670
Cation analysis column	Shodex	IC YS-50
Cobalt chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C8661
Copper chloride	Sigma Aldrich	222011
Ferric chloride	Sigma Aldrich	157740
Filter (vacuum)	Fisherbrand	09-719-2E	0.45 um membrane filter, MCE, 47 mm diameter
Graduated cylinder (1000 mL)	Corning Pyrex	3025-1L	Used as reactor vessel (R). Addition of hose barbs at bottom, 500 mL, and 1 L levels. Outside diameter of hose barbs 3/8".
HPLC/IC	Shimadzu	Prominence
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M2643
Masterflex L/S variable speed drive	Masterflex	07553-50	Drive for recycle and feed pumps (2 needed)
Nickel chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	N6136
Potassium nitrate	Sigma Aldrich	P8291
(Monobasic) Potassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
Pump head	Masterflex	07018-20	Recycle pump head
Pump head	Masterflex	07013-20	Feed pump head
Pump tubing	Masterflex	6404-18	Recycle pump tubing
Pump tubing	Masterflex	6404-13	Feed pump tubing
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z0251