Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

Resumen

Se presenta un método para aislar el órgano de Corti adultos como tres vueltas intactas cocleares (ápice, medio y de base). También demostramos un procedimiento de inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio de las células ciliadas, células de soporte, y otros tipos de células que se encuentra en la cóclea.

Resumen

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

Introducción

La cóclea en forma de espiral del oído interno, contenida dentro del hueso temporal, alberga el órgano de Corti, el órgano final sensorial auditiva en mamíferos. La cóclea está tonotópicamente organizado y comúnmente dividido en apical, media y basal turnos correspondientes a diferentes regiones de frecuencia con detección de sonido de alta frecuencia en la base y detección de baja frecuencia en el vértice ^1. Las células ciliadas, las células mechanosensory del órgano de Corti, corren a lo largo de la cóclea, que es de aproximadamente 6 mm de largo en ratones ^2,3. Estas células convierten la energía mecánica de las ondas de sonido, que se transmiten a través del laberinto membranoso lleno de líquido, en señales neurales que son procesados ​​por las estructuras auditivas centrales. La técnica descrita aquí proporciona un método para preparar preparaciones completas de órgano de Corti después de la calcificación de la cóclea es completa (para las muestras que van desde una semana de edad hasta la edad adulta). También presentamos un método para immunostacaniza todo ello montado tejido coclear. Preparaciones completas cocleares son cruciales para la visualización de todas las células del cabello y que rodea las células de apoyo en sus disposiciones espaciales naturales y permiten el análisis en tres dimensiones con el uso de la microscopía confocal.

Drs. Hans Engstrom y Harlow Ades describen originalmente montar todo un método de disección coclear en 1966. Se detallan a una técnica para fijar rápidamente y diseccionar cochleae calcificado sumergido en líquido de una variedad de mamíferos, conservando intactas segmentos cortos del órgano de Corti para el análisis microscópico ^4. La disección de un sin fijar, cóclea rata calcificada también se ha ilustrado en un video instructivo ^5. Drs. Barbara Bohne y Gary Harding de la Universidad de Washington hicieron varias modificaciones importantes a este método. En su versión del método de montaje en toda coclear, el hueso temporal fue descalcificada, incrustado en plástico y cinco medias vueltas o diez cuartos de vueltas fueron disecciónted ^6,7. Dr. Charles Liberman y sus colegas de Eaton Peabody laboratorios, Massachusetts ojo y Ear Infirmary, modificaron esta técnica por lo que no se requiere que la incrustación de plástico ^8. Además modificación de la técnica se produjo en el laboratorio del Dr. Jian Zuo en el Hospital de Investigación Infantil St. Jude ^9-12 que informó al método de disección que aquí se presenta. Utilizamos una estrategia diferente para acceder al órgano de Corti que Bohne y Liberman, que permite el aislamiento de apical completa, media y vueltas basales. Así, el tejido diseccionado es más grande y menos probabilidades de ser perdido o dañado durante el proceso de disección o de inmunotinción. Además, el método actual facilita la medición de la distancia desde la punta apical o basal gancho para identificar una región de frecuencia.

Aunque muchos laboratorios realizan inmunotinción del tejido coclear, no está claro dónde se originó este método. Como resultado de ello hay varias recetas para el bloqueo de buffers y tampones de incubación de anticuerpos que pueden afectar el desempeño de los anticuerpos primarios individuales. A continuación, presentamos un método para inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia que es aplicable a los anticuerpos más comúnmente utilizados en el campo auditivo.

La forma compleja de la cóclea, delicada estructura del órgano de Corti, y encajamiento ósea proporcionan un desafío para el análisis histológico y bioquímico. Una variedad de técnicas se utilizan actualmente en el campo de audición para superar estas características difíciles y visualizar las células dentro del órgano de Corti, cada técnica con sus propias ventajas y desventajas. El protocolo que aquí se presenta permite la disección para el conjunto de montaje de la cóclea del ratón adulto y, con una ligera modificación, potencialmente se puede utilizar para examinar las estructuras críticas dentro de las cócleas de una variedad de otros organismos modelo utilizados en el campo.

Protocolo

Declaración de Ética: Procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la Facultad de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois.

1. Extracción de Huesos temporales

1. Identificar los temporales en la base del cráneo del ratón ^{13 y} raspar los nervios craneales utilizando fórceps patrón estándar.
2. Coloque fórceps patrón estándar en la punta de la cápsula ótica y con el pulgar de la mano opuesta presione hacia abajo en el canal semicircular posterior para desalojar la cóclea encapsulado.
3. Liberar la mitad inferior del hueso temporal del cráneo de forma manual con el pulgar y el dedo índice o usando 10,5 cm tijeras finas.

2. Post-fix temporales Huesos

1. Coloque huesos temporales en 2 ml tubos de microcentrífuga que contiene 250 - 500 l 4% de paraformaldehído (PFA) diluido en solución salina tamponada con fosfato 10 mM (PBS) de pH 7,4 y incubcomió a temperatura ambiente durante 2-20 horas.
   NOTA: No se necesita una apertura de la tapa apical o inyección de PFA en la ronda o la ventana oval. Recomendar el uso libre, ultra-pura, microscopía electrónica (EM) de grado metanol PFA que se puede comprar en una concentración del 16% en viales de vidrio. Una vez que se abrió un vial y se diluyó 1: 4 en PBS, por lo que una solución al 4%, que puede ser utilizado para un máximo de 2 semanas cuando se almacena a 4 ^{° C} (Algunos anticuerpos requieren la fijación a corto y otros pueden tolerar O / N (O / N) de fijación).

3. decalcify temporales Huesos

1. Después de la fijación, retire PFA con una pipeta y reemplazar con 120 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), un poco más de 2 ml. Asegúrese de llenar todo el tubo de microcentrífuga de 2 ml para evitar las burbujas de aire cuando el tubo está cerrado.
   1. Si no descalcificación inmediatamente, vuelva PFA con pH 7,4 y almacenar muestras de PBS 10 mM a 4 ^{o C.}
      NOTA: Después de la fijación, huesos temporales se pueden almacenar durante variable asciende de tiempo antes de descalcificación en función de los antígenos que se examina.
2. Colocar los tubos en extremo-extremo sobre los rotadores y giran a 4 rpm a temperatura ambiente. Cambie solución de EDTA al día usando una pipeta. Longitud de descalcificación depende de la edad de la muestra y la preferencia del científico que hace la disección.
   1. Incubar huesos temporales en EDTA usando las siguientes directrices para los tiempos de incubación:
      Para las muestras de día postnatal (P) 8 a P15: 2 - 4 horas; Para muestras P15 a P21: O / N; Para muestras P21 a P30: 2 O / N; Para muestras mayores de P30: 3 o más O / N.
      NOTA: Los tiempos de descalcificación están sujetas a la preferencia de los usuarios y se puede ampliar según sea necesario. Tiempo de descalcificación se puede reducir cambiando la solución de EDTA dos veces al día, alrededor de 8 horas de diferencia. Algunos laboratorios añadir 1% PFA a la solución de EDTA cuando descalcificación por más de 3 días para evitar la contaminación.
3. Para determinar si la muestra se descalcificar adecuadamente, coloque huesos temporales ona de silicio impregnados de elastómero plato de disección y presione suavemente con fórceps en la cóclea en forma de caracol. Si el tejido es spongey, a continuación, la descalcificación es completa.
4. Una vez descalcificación, retire EDTA con una pipeta y añadir 500 -1000 l de 10 mM PBS pH 7,4. Almacene las muestras a 4 ^{° C} hasta el momento de diseccionar.

4. Crear recubierto de elastómero de silicona Dish Disección

1. Combinar la base y agente de curado de un kit encapsulante elastómero de silicona de acuerdo con las instrucciones del fabricante y mezclar bien.
2. Añadir aproximadamente 2-3 cucharadas de polvo de carbón hasta que la solución es de color negro y mezclar bien.
   NOTA: tinta líquida o carbón vegetal líquido no se mezclan con la solución y no se puede utilizar. Kits encapsulantes elastómero de silicona se pueden comprar en negro, lo que permite el paso 4.2 para ser omitido.
3. Vierta la solución en 60 mm de vidrio o placas de Petri de plástico, lo suficientemente satisfactorios para cubrir el fondo. Si bubbles están presentes, soplo de aire en la superficie. Deje reposar por lo menos 24 horas a temperatura ambiente para ajustar.
   NOTA: los platos impregnados de elastómero de silicona se puede utilizar en varias ocasiones durante años. Sin embargo, no use etanol para la limpieza, ya que esto hará que el elastómero de silicona de roer.

5. Todo el montaje Disección de la cóclea (por P7 y muestras de edad avanzada)

1. Separar la espira basal de vueltas medias / apicales
   1. Coloque un hueso temporal descalcificada en un plato de la disección con recubrimiento de elastómero de silicona rellena dos tercios de su capacidad con 10 mM de PBS pH 7,4 y el uso de un microscopio de disección estéreo para los siguientes pasos.
   2. Sostenga el hueso temporal en la región vestibular con # 4 o # 5 pinzas de joyero recta y usando 5 mm tijeras de primavera Vannas-Tübingen, cortar el exceso de tejido cápsula ótica largo de los lados y por encima del ápice.
   3. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, inserte una hoja en la ventana oval y hacer varios pequeños cortes a lo largo del ligamento espiral / lateralpared de la espira basal.
   4. El uso de 5 mm tijeras de primavera Vannas-Tübingen, inserte una hoja en la región acaba de cortar y colocar la otra hoja en la parte externa del hueso temporal, medial a la ventana oval. Este corte separa la espira basal de giros medio y apical.
2. La disección completa de la espira basal.
   1. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, cortar las fibras nerviosas del ganglio espiral que se conectan a la modiolo para liberar la tensión en la espira basal y corte por debajo de la espira basal de separar de los órganos vestibulares.
   2. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, hacer una serie de pequeños cortes para retirar el ligamento espiral / pared lateral de ambos por encima y por debajo del órgano de Corti. Utilice # 4 o # 5 pinzas de joyero recta para guiar el tejido. Fijar las fibras nerviosas del ganglio espiral en el elastómero de silicona recubierto con plato de disección, pero no aferrarse a esta región como el tejido se rompa.
   3. Durante los pasos anteriores, algunos de los Membran de Reissnere a menudo será eliminado. Si alguna sigue siendo, sujete la membrana de Reissner con pinzas # 4 o # 5 de joyero recta y alejarse del órgano de Corti.
      NOTA: La membrana tectorial rara vez es visible y por lo general flota lejos sin necesidad de un paso específico para su eliminación.
   4. Finalmente hacer varios recortes para reducir el espesor de los axones del ganglio espiral, para hacer la vuelta lo más plano posible y utilizar # 4 o # 5 pinzas de joyero directamente a transferir la espira basal diseccionado, agarrando los axones restantes del ganglio espiral, a una placa de 48 pocillos (o cámara de diapositivas) que contiene ~ 500 l de 10 mM de PBS pH 7,4.
3. Media separada y vueltas apical
   1. Coloque los dos tercios restantes de la cóclea, con el lado apical hacia abajo.
   2. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, inserte una hoja en la escala media, donde el giro medio utilizado para conectarse a la espira basal, y hacer varios pequeños cortes a lo largo del ligamento espiral / de la pared lateral del XXe espira media.
   3. El uso de 5 mm tijeras de primavera Vannas-Tübingen, inserte una hoja en la región acaba de cortar con el giro medio colocado en la parte superior de la hoja, y coloque la otra hoja en la parte exterior del laberinto óseo, en un ángulo de ⁹⁰ ° de la punta apical. Esto separa la espira media de la vuelta apical.
4. La disección completa de la espira media de una manera similar a la vuelta basal (consulte los pasos 5.2.2 al 5.2.4).
5. La disección completa de la vuelta apical.
   1. El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, abra la tapa que cubre el turno apical. Disección completa de una manera similar a la espira basal (consulte los pasos 5.2.2 a 5.2.4).
      NOTA: disecado giros cocleares pueden almacenarse en 10 mM PBS pH 7,4 en una placa de 48 pocillos (o cámara de diapositivas) ^a 4 ° C durante varias semanas antes de la inmunotinción. Sin embargo PBS se evaporará y necesita ser repuesto periódicamente y almacenamiento de más de 2 - 3 semanas puede dar lugar a crecimiento bacteriano o fúngico en eltejido que puede disminuir la calidad de la imagen. Se recomienda el almacenamiento a largo plazo de las muestras como los temporales no seccionada.

6. La inmunotinción con marcado con fluorescencia Anticuerpos

1. Después de la disección, almacenar cada vez coclear en un pozo independiente en una placa de 48 pocillos (o diapositiva de cámara), sumergido en ~ 500 l de 10 mM PBS pH 7,4. Para cada uno de los siguientes pasos el giro coclear debe ser sumergido en un líquido, no flotante en la parte superior o pegada a un lado del pozo.
   NOTA: Al retirar el líquido de cada pocillo, es fácil perder los giros cocleares o encárgate de la punta de la pipeta. Cambio de soluciones con una punta de pipeta 200 l usando un alcance de la disección ayudará a prevenir esto.
2. Con una pipeta, retire PBS de cada pocillo y reemplazar con ~ 200 - 300 l por pocillo de bloquear / solución de permeabilización (1% Triton X-100, 1% de albúmina de suero bovino (BSA), y 10% de suero normal de cabra (NGS) diluido en PBS 10 mM pH 7,4). Incubar 1 hora a temperatura ambiente en un rotador 3D.
   NOTA: Si cualquier anticuerpo primario utilizado fue hecha en un huésped de cabra, entonces será necesario un anticuerpo secundario de cabra anti-NGS y NO se debe utilizar para cualquiera de los pasos. Suero de caballo normal puede ser utilizado como un reemplazo para NGS.
3. Eliminar la solución de bloqueo / permeabilización utilizando una pipeta y reemplazar con ~ 100 l por pocillo de solución de anticuerpo primario (0,1% Triton X-100, 1% de BSA, y 5% NGS diluidos en PBS 10 mM pH 7,4). El factor de dilución para cada anticuerpo primario varía. Incubar O / N (mínimo 14 horas) ^a 4 ° C en un rotador 3D.
   NOTA: Si se utiliza más de un anticuerpo primario, todas se pueden combinar en la misma solución para la incubación, sólo asegúrese de que cada anticuerpo primario tiene un host diferente.
4. Retire solución de anticuerpo primario utilizando una pipeta y realizar 3 lavados de 10 mM de PBS pH 7,4 a ~ 500 l por pocillo. Cada lavado incuba un mínimo de 5 minutos a temperatura ambiente en un rotador 3D.
5. Retire última PBS lavado usando una pipeta y reemplazar con ~ 100 l por pocillo de una solución de anticuerpo secundario (0,1% Triton X-100, 1% de BSA, y el 5% NGS diluidos en PBS 10 mM pH 7,4). El factor de dilución para cada fluorescentemente etiquetado anticuerpo secundario es generalmente de 1: 500 o 1: 1000. Coloque la placa de 48 pocillos en un cuadro negro para proteger fluorescente etiquetados anticuerpos secundarios de la luz. Incubar 2-3 horas a temperatura ambiente en un rotador 3D.
   NOTA: Si se necesita más de un anticuerpo secundario, que se pueden combinar en la misma solución para la incubación. Asegúrese de que no hay posibilidad de etiquetado cruz (ej., El uso de anticuerpos secundarios de cabra anti-conejo y pollo anti-cabra)
6. Retire solución de anticuerpo secundario con una pipeta y realizar 3 lavados de 10 mM de PBS pH 7,4 a ~ 500 l por pocillo. Incubar cada lavado durante un mínimo de 5 min a RT en un rotador 3D. Mantenga placa de 48 pocillos en un cuadro negro para protegerlo de la luz.
7. Retire último lavado PBS utilizando una pipeta y reemplazar con ~ 100 l por pocillo de CEOShst 33342 (diluido 1: 2000 en PBS 10 mM pH 7,4) para etiquetar los núcleos. Incubar 15 - 20 min a TA en un rotador 3D. Mantenga placa de 48 pocillos en un cuadro negro para protegerlo de la luz. No incubar más de 20 min.
8. Retire la solución Hoechst utilizando una pipeta y realizar 3 lavados de 10 mM de PBS pH 7,4 a ~ 500 l por pocillo. Incubar cada lavado durante un mínimo de 5 min a RT en un rotador 3D. Mantenga placa de 48 pocillos en un cuadro negro para protegerlo de la luz.
9. Todos los pasos se pueden extender, excepto la incubación Hoechst, por varias horas si es necesario. Para detener la reacción en cualquier momento, simplemente sumergir las muestras en ~ 500 ul de PBS 10 mM pH 7,4 y almacenar la placa 48 -bien (o diapositiva de cámara) ^a 4 ° C hasta que esté listo para reanudar las horas de protocolo o de 1 - 2 días después .
   

7. Monte Coclear Activa Diapositivas

1. Etiquetar los portaobjetos con información pertinente acerca de la muestra y los anticuerpos utilizados.
2. Pipeta ~ 50 l de los medios de montaje en cada diapositiva y tener cuidadopara evitar burbujas. Centrifugar el tubo que contiene el medio de montaje para eliminar las burbujas.
3. Usando # 4 o # 5 pinzas de joyero recta, sujete los axones del ganglio espiral para transferir suavemente una vuelta coclear de la placa de 48 pocillos a la diapositiva y el lugar en los medios de montaje. Monte una vuelta coclear por diapositiva para evitar exposición a la luz y fotoblanqueo durante el proceso de obtención de imágenes.
4. Utilice un microscopio de disección estéreo para asegurar que a su vez coclear no se dobla, tuerce, o cerca de una burbuja de aire. Si se produce alguna de estas condiciones, fórceps uso # 4 o # 5 de joyero directamente a reposicionar el turno coclear.
5. Coloque un extremo de un cubreobjetos sobre el portaobjetos y suelte suavemente para dejar caer el cubreobjetos.
6. Utilice un microscopio de disección estéreo para asegurarse de que la vuelta coclear no se dobla, tuerce, o cerca de una burbuja de aire. Si se produce alguna de estas condiciones, mueva suavemente el cubreobjetos de ida y vuelta para volver a colocar el turno coclear.
7. Colocar los portaobjetosen una carpeta de diapositivas para que queden planos. Deje de montaje cura medios O / N a temperatura ambiente (mantener en la oscuridad)
8. Cubreobjetos sello con esmalte transparente de uñas y almacenar a temperatura ambiente o ^-20 ° C hasta el fotografiado. Las diapositivas se pueden almacenar en una carpeta de diapositivas o caja de portaobjetos.
   NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar a largo plazo a -20 ^{° C} o -80 ^{° C} y la fluorescencia se mantendrá durante varios meses.
9. Diapositivas de imágenes utilizando un microscopio confocal con la longitud de onda apropiada basada en los anticuerpos secundarios utilizados durante el procedimiento de inmunotinción. Ajustes de brillo y contraste se pueden realizar utilizando el software de imagen proporcionada por el vendedor confocal.

Resultados

Se presenta un método para aislar el órgano de Corti como tres vueltas intactas cocleares (ápice, medio y base) a partir de tejido coclear que está calcificada, con escalones de disección clave presentados en la Figura 1. Durante la primera semana postnatal del desarrollo, la calcificación de la cóclea del ratón es incompleta y un método de disección más simple puede ser utilizado ^13. Utilizando el método de disección neonatal tod...

Discusión

Hay varios pasos críticos para el éxito de la disección de todo el montaje y la inmunotinción. Sin embargo antes de que cualquiera de estos métodos se llevan a cabo, se requiere la fijación adecuada del tejido coclear. Recomendamos el uso de metanol libre, ultra-pura, EM grado PFA. PFA hecha de polvo puede tener trazas de metanol y un pH inestable que disminuye la calidad de inmunofluorescencia. Otros grupos también han demostrado que las disecciones similares son posibles utilizando fijadores que no contie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard  pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	can be purchased from other vendors
10.5 cm fine scissors	Fine Science Tools	14060-11	can be purchased from other vendors
2 ml microcentrifuge tubes	MidSci	AVSS2000	can be purchased from other vendors
16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade	Polysciences	18814	TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.
PBS pH 7.4	Sigma	P3813-10PAK	can be purchased from other vendors
EDTA	Fisher	BP118-500	can be purchased from other vendors
end-over-end tube rotator	Fisher	05-450-127	can be purchased from other vendors
60 mm petri dish	Fisher	50-202-037	can be purchased from other vendors
Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
activated charcoal	Fisher	AC134372500	can be purchased from other vendors
stereo dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000	can be purchased from other vendors
Dumont #4 jeweler's forceps	Fine Science Tools	11241-30
Dumont #5 jeweler's forceps	Fine Science Tools	11251-20
2.5 mm Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08	curved
5 mm Vannas-Tubingen spring scissors	Fine Science Tools	15003-08	straight
48 well plates	Fisher	08-772-52	can be purchased from other vendors
8 well chamber slides	Fisher	1256518	can be purchased from other vendors
Triton X-100	Sigma	X100-500	can be purchased from other vendors
BSA, fraction V	Fisher	BP1605	can be purchased from other vendors
NGS	Vector labs	S-1000	can be purchased from other vendors
NHS	Vector labs	S-2000	can be purchased from other vendors
3D rotator	Midsci	R3D-710	can be purchased from other vendors
Western blot incubation box XL	Licor	929-97401
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	can be purchased from other vendors
Prolong gold antifade mounting media	Life Technologies	P36930	can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching
Superfrost Plus Slides	Fisher	12-550-15	can be purchased from other vendors
coverslips 22 x 22 x 1	Fisher	12-548-B	can be purchased from other vendors
clear nail polish	Local drug store		can be purchased from other vendors
cardboard slide folder	Fisher	12-587-10	can be purchased from other vendors
plastic slide box	Fisher	03-448-10	can be purchased from other vendors