Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

Riepilogo

Vi presentiamo un metodo per isolare l'organo del Corti adulta come tre turni intatte cocleari (apice, il medio e basso). Abbiamo anche dimostrare una procedura per immunocolorazione con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio di cellule ciliate, cellule di supporto, e altri tipi di cellule trovato nella coclea.

Abstract

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

Introduzione

La coclea a forma di spirale dell'orecchio interno, contenuto all'interno l'osso temporale, ospita l'organo del Corti, l'organo sensoriale uditivo fine nei mammiferi. La coclea è tonotopically organizzato e comunemente suddivisa in apicale, centrale e basale giri corrispondente alle regioni di frequenze diverse con rilevamento del suono ad alta frequenza nella base e il rilevamento a bassa frequenza nel vertice ^1. Le cellule cigliate, le cellule meccanosensoriali dell'organo di Corti, eseguire la lunghezza della coclea, della lunghezza di circa 6 mm in topi ^2,3. Queste cellule convertono l'energia meccanica delle onde sonore, che sono trasmessi attraverso il labirinto membranoso pieno di liquido, in segnali neurali che vengono elaborati dalle strutture uditive centrali. La tecnica qui descritta fornisce un metodo per preparare supporti interi dell'organo di Corti dopo calcificazione della coclea è completa (per i campioni che vanno da una settimana di vita adulta). Vi presentiamo anche un metodo per immunostavorazio il tutto montato tessuti cocleare. Supporti interi cocleari sono cruciali per la visualizzazione di tutte le cellule dei capelli e circostante cellule di sostegno nei loro arrangiamenti spaziali naturali e consentire l'analisi in tre dimensioni con l'uso della microscopia confocale.

Drs. Hans Engstrom e Harlow Ades originariamente descritto un intero metodo di montaggio dissezione cocleare nel 1966. Hanno dettagliato una tecnica per fissare rapidamente e sezionare coclee calcificata immersi in un liquido da una varietà di mammiferi, preservando brevi segmenti intatti dell'organo del Corti per l'analisi microscopica ^4. La dissezione di un unfixed, calcificata ratto coclea è stato illustrato in un video didattico ^5. Drs. Barbara Bohne e Gary Harding alla Washington University fatto diverse modifiche importanti a questo metodo. Nella loro versione del metodo cocleare tutto il monte, l'osso temporale era decalcificata, incorporato nella plastica, e cinque semi-spire o dieci quarti di giri erano dissezioneted ^6,7. Dr. Charles Liberman e colleghi Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye e Ear Infirmary, modificato questa tecnica in modo che embedding plastica non è stato richiesto ^8. Ulteriore modifica della tecnica si è verificato nel laboratorio del Dr. Jian Zuo in Ospedale dei Bambini St. Jude ^9-12, che ha informato il metodo di dissezione presentato qui. Usiamo una strategia diversa per accedere al dell'organo del Corti di Bohne e Liberman, che permette l'isolamento di apicale completo, medio, e si gira basali. Così il tessuto sezionato è più grande e meno probabilità di essere perso o danneggiato durante i processi di dissezione e di immunoistochimica. Inoltre, l'attuale metodo facilita misura della distanza dalla punta apicale o gancio basale per identificare una regione di frequenza.

Anche se molti laboratori svolgono immunocolorazione del tessuto cocleare, non è chiaro in cui questo metodo ha avuto origine. Di conseguenza ci sono varie ricette per il blocco buffers e buffer di incubazione anticorpo che possono influenzare le prestazioni di anticorpi primari individuali. Qui, presentiamo un metodo per immunocolorazione con anticorpi targhette fluorescenza che è applicabile agli anticorpi più comunemente usati nel campo uditivo.

La forma complessa della coclea, delicata struttura dell'organo del Corti, e encasement ossuto forniscono una sfida per l'analisi istologica e biochimica. Una varietà di tecniche sono attualmente utilizzati nel campo dell'udito di superare queste caratteristiche difficili e visualizzare le cellule all'interno dell'organo di Corti, ogni tecnica con i suoi vantaggi e svantaggi. Il protocollo presentato qui permette per tutta la dissezione monte della coclea topo adulto e, con leggera modifica, può potenzialmente essere utilizzato per esaminare le strutture critiche all'interno del coclee da una varietà di altri organismi modello utilizzato in campo.

Protocollo

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura degli animali istituzionale e del Comitato uso alla Southern Illinois University School of Medicine.

1. Estrazione di temporali Ossa

1. Identificare ossa temporali nella base del cranio del mouse ¹³ e raschiare via nervi cranici con pinze modello standard.
2. Posizionare forcipe modello standard con la punta della capsula otica e con il pollice della mano opposta stampa verso il basso sul canale semicircolare posteriore per rimuovere la coclea incapsulato.
3. Liberare la metà inferiore dell'osso temporale dal cranio manualmente con il pollice e l'indice o utilizzando 10,5 cm forbici sottili.

2. Post-fix temporali Ossa

1. Mettere ossa temporali in 2 ml microprovette contenenti 250-500 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) diluito in 10 mM tampone fosfato (PBS) pH 7.4 e incubmangiato a temperatura ambiente per 2-20 ore.
   NOTA: Non è necessaria l'apertura della calotta apicale o iniezione di PFA nella rotonda o finestra ovale. Consiglia di utilizzare metanolo gratuito, ultra-pura, microscopia elettronica (EM) di grado PFA che può essere acquistato ad una concentrazione del 16% in flaconcini di vetro. Una volta che una fiala viene aperto e diluito 1: 4 in PBS, facendo una soluzione al 4%, può essere utilizzato per un massimo di 2 settimane se conservato ^a 4 ° C (Alcuni anticorpi richiedono breve fissazione e altri possono tollerare O / N (O / N) fissazione).

3. decalcify temporali Ossa

1. Dopo la fissazione, rimuovere PFA con una pipetta e sostituirlo con 120 mm di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), poco più di 2 ml. Assicurati di riempire l'intera 2 ml provetta per evitare bolle d'aria quando il tubo è chiuso.
   1. In caso contrario decalcificazione immediatamente, sostituire PFA con PBS 10 mM pH 7.4 e conservare i campioni ^a 4 ° C
      NOTA: Dopo la fissazione, ossa temporali possono essere conservati per variabLe quantità di tempo prima di decalcificazione seconda delle antigeni esaminata.
2. Porre le provette su end-over-end dei rotatori e ruotano a 4 rpm a temperatura ambiente. Cambiare soluzione EDTA quotidiano con una pipetta. Lunghezza della decalcificazione dipende dall'età del campione e la preferenza del scienziato fare la dissezione.
   1. Incubare ossa temporali in EDTA utilizzando le seguenti linee guida per i tempi di incubazione:
      Per i campioni postnatale giorno (P) 8 a P15: 2-4 ore; Per i campioni di P15 P21: O / N; Per i campioni di P21 P30: 2 O / N; Per i campioni di età superiore a P30: 3 o più O / N.
      NOTA: i tempi di decalcificazione sono soggetti alle preferenze degli utenti e possono essere estesi a seconda delle necessità. Decalcificazione tempo può essere ridotto cambiando la soluzione di EDTA due volte al giorno, circa 8 ore a parte. Alcuni laboratori aggiungi 1% PFA alla soluzione EDTA quando decalcificazione per più di 3 giorni di tempo per evitare la contaminazione.
3. Per determinare se il campione è adeguatamente decalcificata, posizionare ossa temporali ona silicone elastomero rivestito piatto dissezione e premere delicatamente pinze sulla coclea a forma di chiocciola. Se il tessuto è spongey, allora decalcificazione è completa.
4. Una volta che la decalcificazione, rimuovere EDTA con una pipetta e aggiungere 500 ml di -1.000 10 mM PBS pH 7,4. Conservare i campioni a 4 ^{° C} fino al momento di sezionare.

4. Creare silicone elastomero rivestite Dish Dissection

1. Unire la base e il catalizzatore di un kit incapsulante elastomero siliconico in base alle istruzioni del produttore e mescolare accuratamente.
2. Aggiungere circa 2-3 cucchiai di polvere di carbone fino a quando la soluzione è di colore nero e mescolare bene.
   NOTA: l'inchiostro liquido o carbone liquido non si mescolano con la soluzione e non possono essere utilizzati. Kit elastomero incapsulante silicone possono essere acquistati in nero, permettendo passo 4.2 a essere omesso.
3. Versare la soluzione in 60 mm di vetro o scatole Petri in plastica, riempimento sufficiente a rivestire il fondo. Se bubbles sono presenti, sfoglia con l'aria sulla superficie. Lasciate riposare almeno 24 ore a temperatura ambiente per impostare.
   NOTA: piatti elastomero silicone può essere utilizzato più volte per anni. Tuttavia non utilizzare l'etanolo per la pulizia, in modo da causare il elastomero siliconico di crack.

5. intero monte dissezione della coclea (per P7 e campioni più vecchi)

1. Separare il giro basale da curve medio / apicali
   1. Posizionare un osso temporale decalcificata in un piatto dissezione elastomero siliconico rivestite riempita per due terzi con 10 mM PBS pH 7.4 e utilizzare un microscopio dissezione stereo per i seguenti passaggi.
   2. Tenere l'osso temporale nella regione vestibolare con # 4 o # 5 pinze gioiellerie dritto e con 5 mm di forbici a molla Vannas-Tubinga, tagliare l'eccesso di tessuto capsula otica lungo i lati e sopra l'apice.
   3. Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, inserire una lama nella finestra ovale e fare diversi piccoli tagli lungo la spirale legamento / lateraleparete del giro basale.
   4. Utilizzando 5 mm forbici primavera Vannas-Tubinga, inserire una lama nella regione appena tagliato e posizionare l'altra lama sulla parte esterna dell'osso temporale, mediale alla finestra ovale. Questo taglio separa il giro basale da curve medio e apicale.
2. Dissezione completa del giro basale.
   1. Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici primavera, tagliare le fibre nervose spirale gangliari che si connettono al modiolus per allentare la tensione nel giro basale e tagliare sotto il giro basale a separarsi da organi vestibolari.
   2. Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, effettuare una serie di piccoli tagli per rimuovere il / parete laterale spirale legamento da sopra e sotto l'organo di Corti. Utilizzare # 4 o # 5 pinze gioielliere dritto per guidare il tessuto. Pin le fibre nervose spirale gangliari al rivestito-elastomero piatto dissezione di silicone, ma non tenere su questa regione come il tessuto si strappa.
   3. Durante le fasi precedenti, alcuni dei Membran di Reissnere sarà spesso rimosso. Se qualcuno rimane ancora, afferrare la membrana della Reissner con una pinza # 4 o # 5 gioiellerie dritto e tirare via dal organo del Corti.
      NOTA: La membrana tectorial è raramente visibile e in genere galleggia via senza la necessità di una fase specifica per la rimozione.
   4. Infine fare diversi tagli per ridurre lo spessore degli assoni spirale gangliari, per far girare il più piatto possibile e utilizzare # 4 o 5 # pinze gioielliere dritto per trasferire il giro basale sezionato, afferrando le rimanenti assoni del ganglio a spirale, a una piastra 48 pozzetti (o una diapositiva da camera) contenente ~ 500 ml di 10 mM PBS pH 7,4.
3. Mezzo separata e curve apicali
   1. Posizionare i restanti due terzi della coclea, parte apicale verso il basso.
   2. Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, inserire una lama nei media Scala, dove il turno di mezzo utilizzato per essere collegato al giro basale, e fare diversi piccoli tagli lungo il / parete laterale spirale legamento di the turno centrale.
   3. Utilizzando 5 mm forbici primavera Vannas-Tübingen, inserire una lama nella regione appena tagliato con il blocco di supporto centrale posto sulla parte superiore della lama, e posizionare l'altra lama sul lato esterno del labirinto osseo, a un angolo di punta apicale ⁹⁰ o. Questo separa la svolta mezzo dalla svolta apicale.
4. Dissezione completa del blocco di supporto centrale in modo simile al giro basale (vedi i punti 5.2.2 a 5.2.4).
5. Dissezione completa del turno apicale.
   1. Utilizzando 2,5 mm Vännäs forbici a molla, aprire il tappo che copre il turno apicale. Dissezione completa in un modo simile al giro basale (vedere i passi 5.2.2 a 5.2.4).
      NOTA: dissecato giri cocleari possono essere memorizzati in 10 mM PBS pH 7,4 in una piastra a 48 pozzetti (o camera di scorrimento) ^a 4 ° C per diverse settimane prima immunocolorazione. Tuttavia PBS evapora e deve essere rifornito periodicamente e stoccaggio più di 2 - 3 settimane può provocare la crescita batterica o fungina sultessuto che può diminuire la qualità dell'immagine. Si consiglia di conservazione a lungo termine di campioni come ossa temporali undissected.

6. Immunostaining con fluorescenza Tagged Anticorpi

1. Dopo la dissezione, memorizzare ogni turno cocleare in un pozzo separata in una piastra da 48 pozzetti (o una diapositiva da camera), immerso in ~ 500 ml di 10 mM PBS pH 7,4. Per ciascuna delle seguenti fasi del turno cocleare deve essere immerso in un liquido, non galleggia sulla parte superiore o attaccato al lato del bene.
   NOTA: Quando si rimuove liquido da ciascun pozzetto, è facile perdere i giri cocleari o aspirare nella punta della pipetta. Modifica soluzioni con una punta della pipetta 200 microlitri utilizzando un ambito dissezione aiuterà a prevenire questo.
2. Usando una pipetta, rimuovere PBS da ogni pozzetto e sostituirlo con ~ 200-300 ml per pozzetto di bloccare / soluzione permeabilizzazione (1% Triton X-100, 1% di albumina sierica bovina (BSA), e siero di capra normale il 10% (NGS) diluito in 10 PBS mm PH 7.4). Incubare 1 ora a RT su un rotatore 3D.
   NOTA: Se un anticorpo primario utilizzato è stato fatto in una serie di capra, quindi sarà necessario un anticorpo anti-capra secondario e NGS NON deve essere utilizzato per uno dei passaggi. Siero di cavallo normale può essere utilizzato in sostituzione di NGS.
3. Rimuovere soluzione bloccante / permeabilizzazione con una pipetta e sostituirlo con ~ 100 microlitri per pozzetto di soluzione di anticorpo primario (0,1% Triton X-100, 1% BSA e 5% NGS diluito in PBS 10 mM pH 7,4). Il fattore di diluizione per ogni anticorpo primario varia. Incubare O / N (minimo 14 ore) ^a 4 ° C su un rotatore 3D.
   NOTA: Se si usa più di un anticorpo primario, tutti possono essere combinati nella stessa soluzione per l'incubazione, basta assicurarsi che ogni anticorpo primario ha un host diverso.
4. Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi con una pipetta ed eseguire 3 lavaggi di 10 mm PBS pH 7,4 a ~ 500 microlitri per bene. Ogni lavaggio incuba un minimo di 5 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D.
5. Rimuovere ultima PBS lavata con una pipetta e sostituire con ~ 100 ml per pozzetto di soluzione di anticorpo secondario (0,1% Triton X-100, 1% BSA, e 5% NGS diluito in 10 mM PBS pH 7,4). Il fattore di diluizione per ogni fluorescente contrassegnati anticorpo secondario è di solito 1: 500 o 1: 1.000. Mettere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggere fluorescente contrassegnati anticorpi secondari dalla luce. Incubare 2-3 ore a temperatura ambiente su un rotatore 3D.
   NOTA: Se è necessario più di un anticorpo secondario, possono essere combinati nella stessa soluzione per l'incubazione. Assicurarsi che non vi è alcuna possibilità di cross-etichettatura (ad es., Utilizzando capra anti-coniglio e pollo anti-capra anticorpi secondari)
6. Rimuovere la soluzione anticorpo secondario con una pipetta ed eseguire 3 lavaggi di 10 mm PBS pH 7,4 a ~ 500 microlitri per bene. Incubare ogni lavaggio per almeno 5 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. Tenere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggerla dalla luce.
7. Rimuovere ultimo lavaggio PBS utilizzando una pipetta e sostituirlo con ~ 100 pl per pozzetto di HOECHST 33342 (diluito 1: 2.000 in 10 mM PBS pH 7,4) per etichettare nuclei. Incubare 15 - 20 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. Tenere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggerla dalla luce. NON incubare più lungo di 20 minuti.
8. Rimuovere la soluzione Hoechst con una pipetta ed eseguire 3 lavaggi di 10 mm PBS pH 7,4 a ~ 500 microlitri per bene. Incubare ogni lavaggio per almeno 5 minuti a temperatura ambiente su un rotatore 3D. Tenere piatto 48-bene in una scatola nera per proteggerla dalla luce.
9. Tutte le fasi possono essere estesi, tranne Hoechst incubazione, per diverse ore, se necessario. Per mettere in pausa la reazione in qualsiasi momento, basta immergere campioni in ~ 500 ul di 10mM PBS pH7.4 e conservare la piastra 48 be '(o una diapositiva da camera) ^a 4 ° C fino al momento di riprendere le ore di protocollo o 1 - 2 giorni dopo .
   

7. Montare Cochlear Attiva diapositive

1. Etichetta vetrini con informazioni pertinenti sul campione e anticorpi utilizzati.
2. Pipettare ~ 50 ml di supporti di montaggio sul ogni diapositiva e stia attentoper evitare bolle. Centrifugare la provetta contenente il supporto di montaggio per rimuovere eventuali bolle.
3. Utilizzando # 4 o pinze # 5 del gioielliere dritto, afferrare gli assoni del ganglio spirale di trasferire delicatamente un giro cocleare dalla piastra 48 pozzetti alla diapositiva e posto nei media di montaggio. Montare un giro cocleare per diapositiva per evitare l'esposizione alla luce e photobleaching durante il processo di imaging.
4. Utilizzare un microscopio dissezione stereo per garantire quel turno cocleare non sia piegata, contorto, o vicino ad una bolla d'aria. Se una di queste condizioni, pinza uso # 4 o # 5 del gioielliere dritto per riposizionare il turno cocleare.
5. Luogo un'estremità di un coprioggetto sul vetrino e delicatamente rilasciare far cadere coprioggetto.
6. Utilizzare un microscopio dissezione stereo per garantire che il turno cocleare non sia piegata, contorto, o vicino ad una bolla d'aria. Se una di queste condizioni, spostare delicatamente il coprioggetto avanti e indietro per riposizionare il turno cocleare.
7. Collocare i vetriniin una cartella diapositiva in modo che essi rimangano piatti. Lasciate montaggio supporti cura O / N a temperatura ambiente (tenere al buio)
8. Coprioggetto Seal con smalto trasparente e conservare a temperatura ambiente o -20 ^{° C} fino a creare l'immagine. Le diapositive possono essere memorizzati in una cartella diapositiva o scivolo box.
   NOTA: Le diapositive possono essere conservati a lungo termine a -20 ^{° C} o -80 ^{° C e} fluorescenza verrà mantenuto per diversi mesi.
9. Le diapositive di immagini utilizzando un microscopio confocale con la lunghezza d'onda appropriata sulla base delle anticorpi secondari utilizzati durante la procedura di immunocolorazione. Luminosità e contrasto regolazioni possono essere eseguite utilizzando il software di imaging fornito dal venditore confocale.

Risultati

Presentiamo un metodo per isolare l'organo del Corti come tre giri intatte cocleari (apice, medio e base) dal tessuto cocleare che è calcificata, con gradini dissezione chiave presentati in Figura 1. Durante la prima settimana postnatale dello sviluppo, calcificazione Mouse coclea è incompleta e più semplice metodo di dissezione ¹³ può essere utilizzato. Utilizzando l'intero metodo di dissezione monte neonatale con coclea da P7 e anziani topi risul...

Discussione

Ci sono diversi passaggi critici per il successo dell'intero dissezione mount e immunocolorazione. Tuttavia prima di uno di questi metodi vengono eseguiti, è necessaria un'adeguata fissazione del tessuto cocleare. Si consiglia di utilizzare metanolo gratuito, ultra-pura, grado EM PFA. PFA ottenuta dalla polvere può avere tracce di metanolo e un pH instabile che diminuisce la qualità di immunofluorescenza. Altri gruppi hanno anche dimostrato che le dissezioni simili sono possibili utilizzando fissativi c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard  pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	can be purchased from other vendors
10.5 cm fine scissors	Fine Science Tools	14060-11	can be purchased from other vendors
2 ml microcentrifuge tubes	MidSci	AVSS2000	can be purchased from other vendors
16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade	Polysciences	18814	TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.
PBS pH 7.4	Sigma	P3813-10PAK	can be purchased from other vendors
EDTA	Fisher	BP118-500	can be purchased from other vendors
end-over-end tube rotator	Fisher	05-450-127	can be purchased from other vendors
60 mm petri dish	Fisher	50-202-037	can be purchased from other vendors
Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
activated charcoal	Fisher	AC134372500	can be purchased from other vendors
stereo dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000	can be purchased from other vendors
Dumont #4 jeweler's forceps	Fine Science Tools	11241-30
Dumont #5 jeweler's forceps	Fine Science Tools	11251-20
2.5 mm Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08	curved
5 mm Vannas-Tubingen spring scissors	Fine Science Tools	15003-08	straight
48 well plates	Fisher	08-772-52	can be purchased from other vendors
8 well chamber slides	Fisher	1256518	can be purchased from other vendors
Triton X-100	Sigma	X100-500	can be purchased from other vendors
BSA, fraction V	Fisher	BP1605	can be purchased from other vendors
NGS	Vector labs	S-1000	can be purchased from other vendors
NHS	Vector labs	S-2000	can be purchased from other vendors
3D rotator	Midsci	R3D-710	can be purchased from other vendors
Western blot incubation box XL	Licor	929-97401
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	can be purchased from other vendors
Prolong gold antifade mounting media	Life Technologies	P36930	can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching
Superfrost Plus Slides	Fisher	12-550-15	can be purchased from other vendors
coverslips 22 x 22 x 1	Fisher	12-548-B	can be purchased from other vendors
clear nail polish	Local drug store		can be purchased from other vendors
cardboard slide folder	Fisher	12-587-10	can be purchased from other vendors
plastic slide box	Fisher	03-448-10	can be purchased from other vendors