Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

Resumo

Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti adulto como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base). Nós também demonstrar um procedimento para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência. Em conjunto estas técnicas permitem o estudo de células ciliadas, células de suporte, e outros tipos de células encontradas na cóclea.

Resumo

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

Introdução

A cóclea em forma de espiral do ouvido interno, contida dentro do osso temporal, abriga o órgão de Corti, o órgão auditivo final sensorial em mamíferos. A cóclea é tonotopically organizado e comumente dividido em apical, médio e basal voltas correspondente a regiões de frequência diferentes, com a detecção de som de alta freqüência na base e detecção de baixa frequência no ápice ^1. As células ciliadas, as células mecanosensorial do órgão de Corti, executar o comprimento da cóclea, que é de aproximadamente 6 mm de comprimento de ^ratos 2,3. Estas células converter a energia mecânica de ondas sonoras, que são transmitidas através do labirinto membranoso cheio de fluido, em sinais neurais que são processadas pelas estruturas auditivas centrais. A técnica aqui descrita fornece um método para a preparação de peças inteiras de o órgão de Corti, após a calcificação da cóclea está completa (para as amostras que vão desde uma semana de idade até à idade adulta). Nós também apresentamos um método para immunostaining tudo montado tecido coclear. Cocleares peças inteiras são cruciais para a visualização de todas as células do cabelo e que envolve as células de suporte nos seus arranjos espaciais naturais e permitir a análise em três dimensões, com a utilização de microscopia confocal.

Drs. Hans Engstrom e Harlow Ades originalmente descrito um método de montar todo dissecção coclear em 1966. Eles detalhado uma técnica para corrigir rapidamente e dissecar cócleas calcificada submersa no líquido a partir de uma variedade de mamíferos, preservando curtos segmentos intactos do órgão de Corti para análise microscópica ^4. A dissecção de um unfixed, calcificada cóclea de rato também foi ilustrado em um vídeo instrutivo ^5. Drs. Barbara Bohne e Gary Harding na Universidade de Washington fez várias modificações importantes a este método. Em sua versão da coclear método montar todo, o osso temporal foi descalcificado, embutido no plástico, e cinco meias-voltas ou dez quartos-de-voltas foram dissecçãoted ^6,7. Dr. Charles Liberman e colegas Eaton Peabody, Massachusetts Eye Laboratories e Ear Infirmary, modificou esta técnica para que a incorporação de plástico não foi necessário ^8. Além disso modificação da técnica ocorreu no laboratório do Dr. Jian Zuo no Hospital de Pesquisa St. Jude Children ^9-12 que informou o método de dissecação aqui apresentada. Nós usamos uma estratégia diferente para obter acesso ao órgão de Corti que Bohne e Liberman, que permite o isolamento completo da apical, média e basal voltas. Assim, o tecido dissecado é maior e menos susceptível de ser danificado ou perdido durante os processos de dissecção ou imunocoloração. Além disso, o método actual de facilitar a medição da distância a partir da extremidade apical ou gancho basal para identificar uma região de frequência.

Embora muitos laboratórios realizar immunostaining de tecido coclear, não está claro onde este método foi originada. Como resultado, há várias receitas para o bloqueio da-manhãrs e tampões de incubação de anticorpos que podem afetar o desempenho de anticorpos primários individuais. Aqui, nós apresentamos um método para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência que é aplicável aos anticorpos mais comumente utilizados no campo auditivo.

A forma complexa da cóclea, delicada estrutura do órgão de Corti, e encaixe ósseo proporcionar um desafio para análise histológica e bioquímica. Uma variedade de técnicas são actualmente usados ​​no campo de audiência para superar estas características difíceis e visualizar as células dentro do órgão de Corti, cada técnica com as suas próprias vantagens e desvantagens. O protocolo aqui apresentado permite a montagem de dissecção toda a cóclea de rato adulto e, com ligeira modificação, pode potencialmente ser usado para examinar as estruturas críticos dentro do cócleas a partir de uma variedade de outros organismos modelo utilizados no campo.

Protocolo

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Escola de Medicina da Universidade de Southern Illinois.

1. Extração de ossos temporais

1. Identificar ossos temporais na base do crânio do rato ^{13 e} raspar os nervos cranianos, usando uma pinça padrão normal.
2. Coloque uma pinça padrão normal na ponta da cápsula ótica e com o polegar da mão oposta a imprensa para baixo no canal semicircular posterior para desalojar a cóclea encapsulado.
3. Liberte a metade inferior do osso temporal a partir do crânio manualmente com o polegar eo dedo indicador ou usando 10,5 cm tesoura fina.

2. Pós-fix temporais Bones

1. Coloque ossos temporais em 2 ml de tubos de microcentrífuga contendo 250 - 500 ul de paraformaldeido a 4% (PFA) diluído em solução salina tamponada com fosfato 10 mM (PBS) pH 7,4 e incubComeram à temperatura ambiente durante 2 - 20 horas.
   NOTA: Não é necessário qualquer abertura da tampa apical ou injeção de PFA para a rodada ou janela oval. Recomendamos o uso livre, ultra-pura, microscopia eletrônica (EM) grau metanol PFA que podem ser comprados em uma concentração de 16% em frascos de vidro. Uma vez que o frasco é aberto e diluído 1: 4 em PBS, fazer uma solução a 4%, ele pode ser usado por até 2 semanas, quando armazenadas a 4 ^{° C} (Alguns anticorpos requerem curta fixação e outros podem tolerar S / N (O / N) Fixação).

3. descalcificação dos ossos temporais

1. Após a fixação, remover PFA utilizando uma pipeta e substituir com 120 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), um pouco mais do que 2 ml. Certifique-se de preencher todo o tubo de microcentrífuga de 2 ml para evitar bolhas de ar quando o tubo é fechado.
   1. Se não descalcificação imediatamente, recoloque PFA com pH 7,4 e armazenar amostras de PBS 10 mM ^a 4 o C.
      NOTA: Após a fixação, os ossos temporais podem ser armazenadas para variable quantidades de tempo antes da descalcificação dependendo dos antigénios a ser examinado.
2. Colocar os tubos no fim-over-end rotador e rodar a 4 rpm à temperatura ambiente. Alterar solução EDTA diariamente usando uma pipeta. Comprimento de descalcificação depende da idade da amostra e da preferência do cientista fazendo a dissecção.
   1. Incubar ossos temporais em EDTA usando as seguintes diretrizes para tempos de incubação:
      Para amostras de dia pós-natal (P) a 8 P15: 2 - 4 horas; Para amostras de P15 a P21: O / N; Para amostras de P21 a P30: 2 O / N; Para amostras mais velhas do que P30: 3 ou mais S / N.
      NOTA: Os tempos de descalcificação estão sujeitos a preferência dos usuários e pode ser estendido conforme necessário. A descalcificação tempo pode ser reduzida alterando a solução de EDTA a duas vezes por dia, cerca de 8 horas de intervalo. Alguns laboratórios adicionar 1% PFA para a solução de EDTA quando descalcificação por mais de 3 dias para evitar a contaminação.
3. Para determinar se a amostra é adequadamente descalcificados, coloque o ossos temporaisna silício elastômero revestido dissecção prato e pressione suavemente fórceps na cóclea em forma de caracol. Se o tecido é spongey, em seguida, descalcificação é completa.
4. Uma vez descalcificação é completa, remover o EDTA usando uma pipeta e adicionar 500 ul -1.000 de PBS 10 mM pH 7,4. Armazene as amostras ^a 4 ° C até que esteja pronto para dissecar.

4. Criar Silicone Elastomer-revestido Dish Dissection

1. Combinar a base e o agente de cura de um kit encapsulante elastómero de silicone de acordo com as instruções do fabricante e homogeneiza-se.
2. Adicionar cerca de 2 - 3 colheres de sopa de carvão em pó até que a solução é preto e misturar bem.
   NOTA: tinta líquida ou carvão vegetal líquido não se mistura com a solução e não pode ser utilizado. Kits de elastómero de silicone encapsulantes pode ser comprado em preto, permitindo que o passo 4.2 ser omitido.
3. Despeje a solução no 60 milímetros de vidro ou placas de Petri de plástico, enchendo o suficiente para cobrir o fundo. Se bubbles estão presentes, sopro de ar sobre a superfície. Deixar repousar pelo menos 24 horas à temperatura ambiente para ajustar.
   NOTA: pratos revestido de elastômero de silicone pode ser usado repetidamente por anos. No entanto, não usar álcool para limpeza, pois isso fará com que o elastômero de silicone de crack.

5. Monte todo Dissecção da cóclea (para P7 e amostras mais antigas)

1. Separe o giro basal do giro médio / apical
   1. Coloque um osso temporal descalcificadas em um prato de dissecação elastómero de silicone com revestimento preenchido dois terços cheio com PBS 10 mM pH 7,4 e usar um microscópio de dissecção estéreo para as seguintes etapas.
   2. Segure o osso temporal na região vestibular com # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta e com 5 mm Vannas-Tübingen tesoura primavera, corte o excesso de tecido cápsula ótica ao longo dos lados e acima do ápice.
   3. Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, inserir uma lâmina para a janela oval e fazer vários pequenos cortes ao longo do ligamento espiral lateral /parede do giro basal.
   4. Usando 5 mm Vannas-Tübingen tesoura primavera, inserir uma lâmina na região apenas cortar e coloque a outra lâmina na parte externa do osso temporal, medial à janela oval. Este corte separa o giro basal de voltas médio e apical.
2. Dissecção completa do giro basal.
   1. Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, cortar as fibras nervosas do gânglio espiral que se conectam à modiolus para liberar a tensão no giro basal e corte abaixo do giro basal se separar de órgãos vestibulares.
   2. Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, fazer uma série de pequenos cortes para remover / parede lateral do ligamento espiral de ambos acima e abaixo do órgão de Corti. Use # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta para orientar o tecido. Pin as fibras nervosas do gânglio espiral ao silicone revestido com elastômero dissecção prato, mas não agarrar esta região como o tecido vai rasgar.
   3. Durante os passos anteriores, alguns dos Membran de Reissnere, muitas vezes, ser removido. Se alguma ainda permanece, segure a membrana de Reissner com uma pinça # 4 ou # 5 de joalheiro em linha reta e se afastar do órgão de Corti.
      NOTA: A membrana tectorial é raramente visível e tipicamente flutua para longe sem a necessidade de uma etapa específica para a remoção.
   4. Finalmente fazer vários cortes para reduzir a espessura dos axônios do gânglio espiral, para fazer a volta mais plano possível e usar # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta para transferir o giro basal dissecado, segurando os axônios restantes do gânglio espiral, para uma placa de 48 poços (ou corrediça câmara) contendo ~ 500 mL de 10 mM de PBS a pH 7,4.
3. Meio e voltas apicais separado
   1. Coloque os restantes dois terços da cóclea, lado apical para baixo.
   2. Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, inserir uma lâmina na escala média, onde o giro médio costumava ser conectados ao giro basal, e fazer vários pequenos cortes ao longo do ligamento espiral / parede lateral do the giro médio.
   3. Utilizando 5 mm Vannas-Tubingen tesoura primavera, inserir uma lâmina na região imediatamente cortada com a espira média colocada em cima da lâmina, e colocar a outra lâmina do lado de fora do labirinto ósseo, com um ângulo de ⁹⁰ ° a partir da extremidade apical. Isso separa o giro médio do giro apical.
4. Dissecção completa do giro médio de um modo semelhante ao giro basal (ver passos 5.2.2 a 5.2.4).
5. Dissecção completa do giro apical.
   1. Usando 2,5 mm Vannas tesoura primavera, abra a tampa que cobre o giro apical. Dissecção completa de uma forma semelhante à espira basal (ver passos 5.2.2 a 5.2.4).
      NOTA: dissecado cada espira pode ser armazenado em 10 mM de PBS a pH 7,4 numa placa de 48 poços (ou corrediça câmara) ^a 4 ° C durante várias semanas antes de imunocoloração. No entanto PBS irá evaporar e necessita de ser reabastecido periodicamente e de armazenagem superior a 2 - 3 semanas pode resultar em crescimento de bactérias ou fungos notecido, que pode diminuir a qualidade da imagem. Recomendamos armazenamento de longo prazo de amostras como ossos temporais não dissecado.

6. Immunostaining com fluorescente etiquetado anticorpos

1. Após a dissecção, armazenar cada espira em um bem separado em uma placa de 48 poços (ou slide câmara), submerso em ~ 500 mL de 10 mM PBS pH 7,4. Para cada um dos seguintes passos a espira deve ser submersa em líquido, não flutuante no topo ou preso ao lado do poço.
   NOTA: Ao remover o líquido de cada bem, é fácil perder os giros cocleares ou chupar-lo na ponta da pipeta. Mudando soluções com uma ponta de pipeta de 200 mL usando um escopo dissecção vai ajudar a evitar isso.
2. Usando uma pipeta, remover PBS de cada poço e substitui com ~ 200 - 300 ul por poço de bloqueio / solução de permeabilização (1% de Triton X-100, 1% de albumina sérica bovina (BSA), e 10% de soro de cabra normal (NGS) diluído em PBS 10 mM de pH 7,4). Incubar 1 hora à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D.
   NOTA: Se qualquer anticorpo primário utilizado foi feita num hospedeiro de cabra, em seguida, um anticorpo anti-cabra secundário irá ser necessário e NGS não deve ser utilizado para qualquer uma das etapas. Soro normal de cavalo pode ser utilizado como um substituto para o NGS.
3. Remover solução de bloqueio / permeabilização usando uma pipeta e substituir com 100 ul ~ por poço de solução de anticorpo primário (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, NGS e 5% diluído em PBS 10 mM, pH 7,4). O factor de diluição para cada anticorpo primário varia. Incubar O / N (mínimo 14 horas) ^a 4 ° C em um rotador 3D.
   NOTA: Se mais de um anticorpo primário é usado, todos podem ser combinados na mesma solução para incubação, apenas certifique-se de que cada anticorpo primário tem um host diferente.
4. Remoção da solução de anticorpo primário, utilizando uma pipeta e lavagens de executar 3 10 mM de PBS a pH 7,4 em ~ 500 ul por poço. Cada lavagem incuba um mínimo de 5 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D.
5. Retirar última PBS uma lavagem usando uma pipeta e substitua com ~ 100 ul por poço de solução de anticorpo secundário (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, NGS e 5% diluído em PBS 10 mM, pH 7,4). O factor de diluição para cada fluorescente etiquetado o anticorpo secundário é usualmente 1: 500 ou 1: 1.000. Coloque de 48 poços em uma caixa preta para proteger fluorescente etiquetado anticorpos secundários da luz. Incubar 2 - 3 horas à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D.
   NOTA: Se for necessário mais do que um anticorpo secundário, eles podem ser combinados na mesma solução durante a incubação. Certifique-se de que não há possibilidade de rotulagem cruzada (por exemplo., Usando cabra anti-coelho e frango anti-cabra anticorpos secundários)
6. Remoção da solução de anticorpo secundário, utilizando uma pipeta e lavagens de executar 3 10 mM de PBS a pH 7,4 em ~ 500 ul por poço. Incubar cada lavagem durante um mínimo de 5 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. Mantenha de 48 poços em uma caixa preta para proteger da luz.
7. Retirar última lavagem PBS com uma pipeta e substituir com ~ 100 ul por poço de HoecHST 33342 (diluído 1: 2000 em 10 mM de PBS, pH 7,4) para rotular núcleos. Incubar 15 - 20 min à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. Mantenha de 48 poços em uma caixa preta para proteger da luz. Não incubar mais tempo do que 20 min.
8. Remover Hoechst solução utilizando uma pipeta e lavagens de executar 3 10 mM de PBS a pH 7,4 em ~ 500 ul por poço. Incubar cada lavagem durante um mínimo de 5 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo 3D. Mantenha de 48 poços em uma caixa preta para proteger da luz.
9. Todos os passos podem ser estendidos, excepto incubação a Hoechst, por várias horas, se necessário. Para pausar a reação em qualquer fase, apenas submergir amostras em ~ 500 ul de 10 mM PBS pH 7,4 e armazenar a placa de 48 -bem (ou slide câmara) ^a 4 ° C até que esteja pronto para retomar as horas de protocolo ou 1 - 2 dias depois .
   

7. Monte Coclear Liga Slides

1. Etiqueta de slides com informações pertinentes sobre a amostra e os anticorpos utilizados.
2. Pipeta ~ 50 ul de mídia montagem em cada slide e ter cuidadopara evitar as bolhas. Centrifuga-se o tubo contendo os meios de montagem para remover quaisquer bolhas.
3. Usando # 4 ou # 5 fórceps de joalheiro em linha reta, segure os axônios do gânglio espiral para transferir suavemente uma vez coclear a partir da placa de 48 poços para o slide e lugar nos meios de montagem. Monte uma espira por lâmina para evitar a exposição à luz e fotodegradação durante o processo de criação de imagens.
4. Use um microscópio de dissecção estéreo para garantir que espira não está dobrado, torcido, ou perto de uma bolha de ar. Se qualquer uma dessas condições ocorrer, fórceps uso # 4 ou # 5 de joalheiro em linha reta para reposicionar a espira.
5. Colocar uma extremidade de uma lamela sobre a lâmina e libertar suavemente para permitir a queda lamela.
6. Usar um microscópio de dissecção estéreo para assegurar que a espira não está dobrado, torcido, ou perto de uma bolha de ar. Se alguma dessas condições ocorrer, mova suavemente a lamela para trás e para reposicionar a espira.
7. Colocar as lâminasem uma pasta slide para que eles colocar o plano. Vamos montar cura mídia O / N à temperatura ambiente (manter no escuro)
8. Lamelas Selo com clara unha polonês e armazenar a RT ou ^-20 ° C até trabalhada. Slides podem ser armazenados em uma pasta ou caixa de slides slide.
   NOTA: Os slides podem ser armazenados a longo prazo a -20 ^{° C} ou -80 ^{° C e} fluorescência será mantida por vários meses.
9. Lâminas de imagem usando um microscópio confocal com o comprimento de onda apropriado com base nos anticorpos secundários utilizados durante o procedimento de imunocoloração. Ajustes de brilho e contraste pode ser realizada utilizando o software de imagem fornecida pelo vendedor confocal.

Resultados

Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base) a partir de tecido da cóclea que é calcificada, com passos de dissecação chave apresentados na Figura 1. Durante a primeira semana pós-natal de desenvolvimento, a calcificação do do mouse cóclea é incompleta e um método de dissecação mais simples pode ser usado ^13. Usando todo o método de dissecação montagem neonatal com cóclea...

Discussão

Há vários passos críticos para toda bem sucedido dissecção montagem e immunostaining. Contudo, antes de qualquer um destes métodos são realizados, é necessária a fixação adequada do tecido coclear. Recomendamos a utilização de metanol livre, ultra-pura, EM grau PFA. PFA feita a partir de pó pode ter vestígios de metanol e um pH instável o que diminui a qualidade de imunofluorescência. Outros grupos também mostraram que dissecções semelhantes são possíveis usando fixadores que não contêm for...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard  pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	can be purchased from other vendors
10.5 cm fine scissors	Fine Science Tools	14060-11	can be purchased from other vendors
2 ml microcentrifuge tubes	MidSci	AVSS2000	can be purchased from other vendors
16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade	Polysciences	18814	TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.
PBS pH 7.4	Sigma	P3813-10PAK	can be purchased from other vendors
EDTA	Fisher	BP118-500	can be purchased from other vendors
end-over-end tube rotator	Fisher	05-450-127	can be purchased from other vendors
60 mm petri dish	Fisher	50-202-037	can be purchased from other vendors
Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
activated charcoal	Fisher	AC134372500	can be purchased from other vendors
stereo dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000	can be purchased from other vendors
Dumont #4 jeweler's forceps	Fine Science Tools	11241-30
Dumont #5 jeweler's forceps	Fine Science Tools	11251-20
2.5 mm Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08	curved
5 mm Vannas-Tubingen spring scissors	Fine Science Tools	15003-08	straight
48 well plates	Fisher	08-772-52	can be purchased from other vendors
8 well chamber slides	Fisher	1256518	can be purchased from other vendors
Triton X-100	Sigma	X100-500	can be purchased from other vendors
BSA, fraction V	Fisher	BP1605	can be purchased from other vendors
NGS	Vector labs	S-1000	can be purchased from other vendors
NHS	Vector labs	S-2000	can be purchased from other vendors
3D rotator	Midsci	R3D-710	can be purchased from other vendors
Western blot incubation box XL	Licor	929-97401
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	can be purchased from other vendors
Prolong gold antifade mounting media	Life Technologies	P36930	can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching
Superfrost Plus Slides	Fisher	12-550-15	can be purchased from other vendors
coverslips 22 x 22 x 1	Fisher	12-548-B	can be purchased from other vendors
clear nail polish	Local drug store		can be purchased from other vendors
cardboard slide folder	Fisher	12-587-10	can be purchased from other vendors
plastic slide box	Fisher	03-448-10	can be purchased from other vendors