成体マウス蝸牛のホールマウント解剖および免疫蛍光

要約

私たちは3無傷の蝸牛ターン（頂点、ミドル、ベース）としてコルチ大人の臓器を分離する手法を提案します。また、蛍光タグ付き抗体で免疫染色するための手順を示しています。一緒に、これらの技術は、蝸牛に見出さ有毛細胞、支持細胞、および他の細胞型の研究を可能にします。

要約

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

概要

側頭骨内に含まれている内耳の螺旋状の蝸牛は、コルティ、哺乳類における聴覚感覚終末器官の器官を収容します。蝸牛はtonotopically編成、一般頂端、中間に分割され、基礎ベースの高周波音検出と頂点¹における低周波検出に異なる周波数領域に対応するオン。れます有毛細胞、コルチ器官の機械刺激細胞は、マウス^2,3で約6mmの長さである蝸牛の長さを実行します。これらの細胞は、中枢聴覚構造によって処理された神経信号に、液体で満たされた膜迷路を介して送信された音波の機械的エネルギーを変換します。ここに記載された技術は、蝸牛の石灰化は、（1週齢から成人期までのサンプルのため）が完了した後にコルチ器官の全体のマウントを製造する方法を提供します。また、immunostaための方法を提示全体ining蝸牛組織を搭載しています。蝸牛全体のマウントは、その自然の空間配置内のすべての有毛細胞と周囲の支持細胞の可視化のために重要であると共焦点顕微鏡を用いた三次元で分析が可能。

博士。ハンス・エングストロームハーローアデスは、もともと彼らは急速に顕微鏡分析⁴のためにコルチ器官の短い無傷のセグメントを維持し、固定し、哺乳類の様々な液体に浸さ石灰化蝸牛を分析する手法を詳述し1966年に全体のマウント蝸牛切開法を説明しました。未固定、石灰化したラットの蝸牛の解剖も教育ビデオ⁵に示されています。博士。バーバラBohneとワシントン大学のゲーリー・ハーディングは、この方法にはいくつかの重要な修正を行いました。蝸牛全体のマウント方法の彼らのバージョンでは、側頭骨は、脱灰したプラスチックに埋め込まれ、5ハーフターンまたは10四半期ターンはdissecましたテッド^6,7。プラスチック埋め込 ​​みが^{8を必要とし}ていなかったように、イートンピーボディ研究所、マサチューセッツ州アイ、耳診療所での博士チャールズ・リーベルマンらは、この手法を変更しました。技術のさらなる変更はここに提示解剖法を知らさセントジュード小児研究病院^9-12博士建祚の研究室で発生しました。我々は完全な頂端、中間、基底ターンの単離を可能にするBohneとリーベルマンよりコルチ器官へのアクセスを得るために異なる戦略を使用しています。したがって、解剖組織が大きく、解剖や免疫染色工程中に紛失または破損しにくくなります。さらに、現在の方法は、周波数領域を特定するために先端チップ部または基底フックとの距離の測定を容易にします。

多くのラボでは蝸牛組織の免疫染色を行うが、この方法は、元の場所、それは不明です。その結果、ブフェを遮断するための様々なレシピがあります個々の一次抗体の性能に影響を与える可能性のRSおよび抗体インキュベーションバッファー。ここでは、聴覚分野において最も一般的に使用される抗体に適用することができる蛍光タグ付き抗体で免疫染色するための1つの方法を提示します。

蝸牛の複雑な形状、コルチ器官の繊細な構造、および骨の箱詰めは、組織学的および生化学分析のための課題を提供しています。種々の技術は、現在、これらの困難な特徴を克服し、それ自身の利点と欠点を有するコルチ、各技術の臓器内の細胞を可視化するために聴覚分野で使用されています。ここに提示されたプロトコルは、全体の成体マウス蝸牛の解剖マウントを可能にし、わずかな修正を加えて、潜在的な分野で使用される他のモデル生物の様々な蝸牛内の重要な構造を調べるために使用することができます。

プロトコル

倫理の声明：動物を対象とする手順は、医学のサザンイリノイ大学での施設内動物管理使用委員会によって承認されています。

頭骨の1の抽出

1. マウスの頭蓋骨^{13のベース}に頭骨を識別し、標準パターン鉗子を使用して脳神経を削り取ります。
2. カプセル化された蝸牛を取り除くために、耳のカプセルの先端に、下後部三半規管に反対ハンドプレスの親指で標準パターン鉗子を置きます。
3. 親指と人​​差し指で、または10.5センチメートル細かいハサミを使用して手動で頭蓋骨から頭骨の下半分を解放します。

2.ポストフィックス頭骨

1. 10mMのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.4とincubで希釈し、500μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA） - 250を含む2 mlのマイクロ遠心チューブに頭骨を配置20時間 - 2 RTで食べました。
   注：円形または楕円形のウィンドウにPFAの頂端キャップまたは注射のいかなる開口部は必要ありません。ガラスバイアル中に16％の濃度で購入することができ、メタノール無料、超純、電子顕微鏡（EM）グレードPFAを使用することをお勧めします。バイアルを開け、1に希釈された後：PBS中4 ⁴ O C（いくつかの抗体は、短い固定等を必要とする/ O（O / Nを許容することができるで保存した場合、4％の溶液を作り、それは最大2週間のために使用することができますN）固定）。

3.脱灰頭骨

1. 固定後、ピペットを用いてPFAを削除し、120 mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、少し以上の2mlで交換してください。管が閉じているときに空気が気泡を防ぐために、全体の2ミリリットルのマイクロチューブを記入してください。
   1. すぐに脱灰されていない場合は、4 ^O℃で10mMのpH7.4のPBSと店舗のサンプルでPFAを交換
      注：固定した後、側頭骨はvariab保存することができます検査されている抗原に応じて脱灰前の時間のル量。
2. 転倒型回転器の上に置い管、室温で4 rpmで回転させます。ピペットを用いて毎日EDTA溶液を変更します。脱灰の長さは、サンプルの年齢および解剖をやって科学者の好みに依存します。
   1. インキュベーション時間については、次のガイドラインを使用して、EDTA中で頭骨をインキュベート：
      8 P15のサンプル生後日（P）の場合：2から4時間。 P21のサンプルP15の場合：O / N。 P30のサンプルP21の場合：2 O / N。 3以上のO / N：P30より古いサンプルについて。
      注：脱灰時間は、ユーザーの好みの対象となり、必要に応じて拡張することができます。脱灰時間は約8時間離れて、一日二回EDTA溶液を変化させることによって低減することができます。汚染を防止するために、より長い3日間脱灰すると、一部のラボでは、EDTA溶液に1％PFAを追加します。
3. サンプルが十分に脱灰であるかどうかを判断するには、側頭骨のOを配置シリコンエラストマーで被覆された解剖皿をNAと優しくカタツムリ状の蝸牛に鉗子を押してください。組織がspongeyである場合、脱灰は完了です。
4. 脱灰が完了すると、ピペットを用いて、EDTAを除去し、10mMのpH7.4のPBSの500 -1000μlを添加します。解剖準備ができるまで4 ^{O Cで保存}サンプル。

4.シリコーンエラストマーで被覆された解剖皿を作成します。

1. ベースとシリコーンエラストマー封止キットの硬化剤は、製造者の指示に従って結合し、十分に混合します。
2. ソリューションが黒になるまで粉末木炭の大さじ3、よく混ぜる - 約2を追加します。
   注：液体インクまたは液体木炭を溶液と混合せず、使用することはできません。シリコーンエラストマー封止キットは、ステップ4.2を省略することができるように、黒で購入することができます。
3. 被覆に十分な底部を充填し、60 mmのガラスまたはプラスチック製のペトリ皿に溶液を注ぎます。 BU場合bblesは、表面上の空気とパフ存在しています。設定するには、室温で少なくとも24時間放置し。
   注：シリコーンエラストマーで被覆された料理は何年も繰り返し使用することができます。これはシリコーンエラストマーに亀裂が発生しますしかし、洗浄のためにエタノールを使用しないでください。

（P7と古いサンプル用）蝸牛の5ホールマウント解剖

1. 頂端/ミドルターンから基底回転を分離
   1. 10mMのpH7.4のPBSで三分の二のフル充填シリコーンエラストマーで被覆された解剖皿に1脱灰頭骨を置き、次のステップのためのステレオ解剖顕微鏡を使用しています。
   2. ＃4または＃5ストレート宝石商の鉗子を用いて前庭地域の頭骨を持ち、5ミリメートルVannas-テュービンゲン春のはさみを使用して、側面に沿って頂点上記過剰耳のカプセル組織を切り取ります。
   3. 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、楕円形のウィンドウに1ブレードを挿入し、スパイラル靭帯/横に沿っていくつかの小さなカットを作ります基底回転の壁。
   4. 5ミリメートルVannas-テュービンゲン春のはさみを使用して、ちょうど卵円窓に正中、側頭骨の外に他のブレードをカットし、配置領域に1ブレードを挿入します。このカットは、中間および頂端ターンから基底回転を分離します。
2. 基底回転の完全解剖。
   1. 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、基底回転の緊張を解放し、前庭器官から分離するために基底回転の下にカットする蝸牛軸に接続し、螺旋神経節神経繊維をカット。
   2. 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、コルチ器官の上および下の両方からスパイラル靭帯/側壁を除去するために、小さなカットのシリーズを作ります。組織を導くために、＃4、＃5ストレート宝石商の鉗子を使用してください。シリコーンエラストマー被覆解剖皿にらせん神経節神経線維をピンが、組織が裂けるように、この領域に保持していません。
   3. 前の手順、ライスナーのmembranのいくつかの中にeは、多くの場合、削除されます。いずれかがまだ残っている場合は、＃4、＃5ストレート宝石商の鉗子でライスナーの膜を把握し、コルチ器官から引き離します。
      注：被蓋膜がまれに表示され、一般的に除去するための具体的なステップを必要とせずに離れて浮きます。
   4. 最後に、できるだけ平坦ターンを行い、スパイラル神経節の残りの軸索を把握することで、解剖基底回転を転送するために＃4または＃5ストレート宝石商の鉗子を使用するように、スパイラル神経節軸索の厚さを減らすためにいくつかのカットを作ります10mMのpH7.4のPBSの〜500μLを含む48ウェルプレート（またはチャンバースライド）。
3. 個別の真ん中と頂端ターン
   1. 蝸牛の残りの三分の二、頂端側を下に置きます。
   2. 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、中間ターンは基底回転に接続するために使用される中央階に1ブレードを挿入して、目のスパイラル靭帯/側壁に沿っていくつかの小さなカットを作ります電子真ん中のターン。
   3. 5ミリメートルVannas-テュービンゲン春のはさみを使用して、単に刃の上に置かミドルターンで切断領域に1ブレードを挿入し、先端チップ部から90 ^Oの角度で、骨迷路の外に他のブレードを配置します。これは、頂回転の中からターンを分離します。
4. 基底回転と同様に、中間ターンの完全な解剖（5.2.4へのステップ5.2.2を参照）。
5. 頂回転の完全解剖。
   1. 2.5ミリメートルVannas春のはさみを使用して、頂回転を覆うキャップを開きます。基底回転と同様に完全解剖（5.2.4へのステップ5.2.2を参照）。
      注：解剖蝸牛ターンは免疫染色の前に数週間^4°Cの時に48ウェルプレート（またはチャンバースライド）に10mMのpH7.4のPBSに格納することができます。しかし、PBS長い2よりも蒸発し、定期的に補充する必要があり、記憶されます - 3週間で、細菌または真菌の増殖をもたらすことができます画像の品質を低下させることができる組織。我々はundissected頭骨などの試料の長期保存をお勧めします。

蛍光タグ付き抗体による免疫染色6.

1. 解剖後、10mMのpH7.4のPBSの〜500μlの中に沈め、48ウェルプレート（またはチャンバースライド）で別々のウェル中の各蝸牛ターンを格納します。以下の各ステップについて蝸牛ターンは、液体中に浸漬されなければならない上に浮いていないか、ウェルの側面に付着しました。
   注：各ウェルから液体を除去すると、それは蝸牛のターンを失うか、ピペットチップでそれを吸うのは簡単です。解剖スコープを使用して、200μlのピペットチップでソリューションを変更すると、これを防ぐことができます。
2. ピペットを用いて、各ウェルからPBSを除去し、置き換える〜200と - /ブロッキング透過化溶液（ウェルあたり300μlの1％トリトンX-100、1％ウシ血清アルブミン（BSA）、及び10％正常ヤギ血清（NGS） 10mMのPBS Pに希釈H 7.4）。 3D回転体に室温で1時間インキュベートします。
   注：使用される任意の一次抗体は、ヤギのホストで行われた場合、二次抗ヤギ抗体が必要とされ、NGSは、ステップのいずれかに使用することはできません。正常ウマ血清をNGSの代替として使用することができます。
3. ピペットを用いてブロッキング/透過処理溶液を除去し、一次抗体溶液をウェル当たり〜100μlで置き換える（0.1％トリトンX-100、10mMのPBS（pH7.4）中に希釈し、1％BSAおよび5％NGS）。各一次抗体のための希釈率が変化します。 3D回転体に4 ^O℃で O / N（最低14時間）インキュベートします。
   注：複数の一次抗体を使用している場合は、すべてのインキュベーションのために、同じ溶液中に組み合わせることができ、ちょうど各一次抗体は、別のホストを持っていることを確認してください。
4. ピペットを用いて、一次抗体溶液を除去し、ウェル当たり〜500μlので10mMのpH7.4のPBSの3回の洗浄を行います。各洗浄は、3D回転体に室温で5分間の最小値をインキュベートします。
5. 最後のPを削除しますBSは、ピペットを用いて洗浄し、二次抗体溶液（0.1％トリトンX-100、1％BSAおよび5％の10mM PBS pH7.4中で希釈したNGS）のウェル当たり〜100μlで置き換えます。それぞれについて、希釈係数は、蛍光二次抗体をタグ付け、通常は1：500または1：1,000。光から蛍光タグ付き二次抗体を保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを置きます。 3D回転体に室温で3時間 - 2をインキュベートします。
   注：複数の二次抗体を必要とする場合は、インキュベーションのために、同じ溶液中に組み合わせることができます。 （ 例えば 、ヤギ抗ウサギおよびニワトリ抗ヤギ二次抗体を用いて）は、クロス標識の可能性がないことを確認してください
6. ピペットを用いて、二次抗体溶液を除去し、ウェル当たり〜500μlので10mMのpH7.4のPBSの3回の洗浄を行います。 3D回転体に室温で5分間の最低各洗浄をインキュベートします。光から保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを保管してください。
7. ピペットを使用して、最後のPBS洗浄を外し、Hoecのウェル当たり〜100μlの置き換え核を標識する：HST 33342（10mMのpH7.4のPBSで2000倍に希釈）。 3D回転体に室温で20分 - 15インキュベートします。光から保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを保管してください。 20分以上インキュベートしないでください。
8. ピペットを用いて、ヘキスト溶液を除去し、ウェル当たり〜500μlので10mMのpH7.4のPBSの3回の洗浄を行います。 3D回転体に室温で5分間の最低各洗浄をインキュベートします。光から保護するために、ブラックボックスに48ウェルプレートを保管してください。
9. 必要に応じて、すべてのステップは、数時間、ヘキストインキュベーション以外は、拡張することができます。 2日後に-ちょうど10mMのPBS pH7.4のの〜500 ulの中のサンプルを沈め、プロトコル時間を再開する準備または1まで^4°Cの時に48型ウェルプレート（またはチャンバースライド）を保存、いずれかの段階で反応を一時停止するには。
   

7.マウント蝸牛は、スライドをオンにします

1. ラベルは、使用した試料と抗体に関する適切な情報を摺動します。
2. ピペット取り付けメディアの〜50μlの各スライドの上にと注意してください気泡を防止します。任意の気泡を除去するために取り付けたメディアを含むチューブを遠心。
3. ＃4または＃5ストレート宝石商の鉗子を使用して、ゆっくりと取り付けメディアにスライドし、場所に48ウェルプレートから1蝸牛ターンを転送するために、螺旋神経節の軸索を把握。マウントイメージングプロセス中に露光し、光退色を防止するために、スライドごとに1蝸牛ターン。
4. 蝸牛ターンは、折り畳まれたねじれた、または気泡の近くにされていないことを確実にするために、ステレオ解剖顕微鏡を使用してください。これらの条件のいずれかが発生した場合は、＃4を使用するか、＃5ストレート宝石商の鉗子は、蝸牛ターンを再配置します。
5. スライド上のカバーガラスの一端を置き、静かにカバーガラスの落下させるために解放します。
6. 蝸牛ターンは、折り畳まれたねじれた、または気泡の近くにされていないことを確認するために、ステレオ解剖顕微鏡を使用してください。これらの条件のいずれかが発生した場合は、そっと蝸牛ターンを再配置するために、前後にカバースリップを移動します。
7. 場所スライドようにスライドフォルダにそれらが平らに横たわっていました。マウントしてみましょうメディア硬化O / RTでN（DARKておきます）
8. C ^O RTでマニキュアと店舗クリアまたは-20でシールしたカバー画像化まで。スライドは、スライドフォルダまたはスライドボックスに格納することができます。
   注：スライドは、C ^O -20 ^{O Cまたは} -80で長期に保存することができ、蛍光は、数ヶ月のために維持されます。
9. 免疫染色の手順の間に使用される二次抗体に基づく適切な波長を有する共焦点顕微鏡を用いた画像スライド。明るさとコントラストの調整は、共焦点ベンダーによって提供イメージングソフトウェアを用いて行うことができます。

結果

我々は、開発の出生後第1週の間に。の石灰化を図1に示すキー解剖の手順で、石灰化である蝸牛組織から3無傷の蝸牛ターン（頂点、ミドル、ベース）とコルチ器官を単離するための方法を提示マウス蝸牛は不完全であり、より簡単な切開方法^13を使用することができます。新生児全体を使用すると、P7から蝸牛と涙とコルチ器官の細断の高齢マウ?...

ディスカッション

成功した全体のマウント解剖および免疫染色のためにいくつかの重要なステップがあります。これらの方法のいずれかが実行される前に、しかし、蝸牛組織の適切な固定が必要とされています。我々は、超純粋な遊離メタノール、EMグレードPFAを使用することをお勧めします。 PFAは、メタノールおよび免疫蛍光の品質を低下させる不安定なpH値の痕跡を持つことができる粉末から作られ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard  pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	can be purchased from other vendors
10.5 cm fine scissors	Fine Science Tools	14060-11	can be purchased from other vendors
2 ml microcentrifuge tubes	MidSci	AVSS2000	can be purchased from other vendors
16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade	Polysciences	18814	TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.
PBS pH 7.4	Sigma	P3813-10PAK	can be purchased from other vendors
EDTA	Fisher	BP118-500	can be purchased from other vendors
end-over-end tube rotator	Fisher	05-450-127	can be purchased from other vendors
60 mm petri dish	Fisher	50-202-037	can be purchased from other vendors
Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
activated charcoal	Fisher	AC134372500	can be purchased from other vendors
stereo dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000	can be purchased from other vendors
Dumont #4 jeweler's forceps	Fine Science Tools	11241-30
Dumont #5 jeweler's forceps	Fine Science Tools	11251-20
2.5 mm Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08	curved
5 mm Vannas-Tubingen spring scissors	Fine Science Tools	15003-08	straight
48 well plates	Fisher	08-772-52	can be purchased from other vendors
8 well chamber slides	Fisher	1256518	can be purchased from other vendors
Triton X-100	Sigma	X100-500	can be purchased from other vendors
BSA, fraction V	Fisher	BP1605	can be purchased from other vendors
NGS	Vector labs	S-1000	can be purchased from other vendors
NHS	Vector labs	S-2000	can be purchased from other vendors
3D rotator	Midsci	R3D-710	can be purchased from other vendors
Western blot incubation box XL	Licor	929-97401
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	can be purchased from other vendors
Prolong gold antifade mounting media	Life Technologies	P36930	can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching
Superfrost Plus Slides	Fisher	12-550-15	can be purchased from other vendors
coverslips 22 x 22 x 1	Fisher	12-548-B	can be purchased from other vendors
clear nail polish	Local drug store		can be purchased from other vendors
cardboard slide folder	Fisher	12-587-10	can be purchased from other vendors
plastic slide box	Fisher	03-448-10	can be purchased from other vendors