Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

Résumé

Nous présentons une méthode pour isoler l'organe de Corti adulte que trois tours intactes cochléaires (APEX, milieu, et de la base). Nous démontrons également une procédure pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l'étude des cellules ciliées, cellules de soutien, et d'autres types de cellules trouvées dans la cochlée.

Résumé

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

Introduction

La cochlée en forme de spirale de l'oreille interne, contenue dans l'os temporal, abrite l'organe de Corti, la sensibilité auditive organe final chez les mammifères. La cochlée est tonotopically organisé et souvent divisé en apicale, un milieu et basale tours correspondant à différentes régions de fréquence avec détection de son à haute fréquence dans la base et la détection de basse fréquence dans l'apex ^1. Les cellules ciliées, les cellules mécano de l'organe de Corti, courent tout le long de la cochlée, qui est d'environ 6 mm de long chez la souris ^2,3. Ces cellules convertissent l'énergie mécanique des ondes sonores, qui sont transmis à travers le labyrinthe membraneux rempli de fluide, en des signaux neuronaux qui sont traitées par les structures auditives centrales. La technique décrite ici concerne un procédé pour la préparation de supports entiers de l'organe de Corti après calcification de la cochlée est complète (pour les échantillons allant de 1 semaine d'âge et l'âge adulte). Nous présentons également une méthode pour immunostaining le tout monté tissus cochléaire. Montures entières cochléaires sont cruciales pour la visualisation de toutes les cellules de cheveux et entourant les cellules de soutien dans leurs arrangements spatiaux naturelles et permettent l'analyse en trois dimensions avec l'utilisation de la microscopie confocale.

Drs. Hans Engstrom et Harlow Ades décrits à l'origine un ensemble de monter méthode de dissection cochléaire en 1966. Ils ont décrit une technique pour fixer rapidement et disséquer cochleae calcifiée immergée dans un liquide à partir d'une variété de mammifères, la préservation de courts segments intacts de l'organe de Corti pour analyse microscopique ^4. La dissection, une cochlée de rat calcifiée non fixée a également été illustré dans une vidéo d'instruction ^5. Drs. Barbara Bohne et Gary Harding à l'Université de Washington ont fait plusieurs modifications importantes à cette méthode. Dans leur version de la méthode de montage toute cochléaire, l'os temporal était adoucie, noyée dans le plastique, et cinq demi-tours ou dix quarts de tours étaient dissectionTed ^6,7. Dr Charles Liberman et ses collègues de Eaton Peabody laboratoires, Massachusetts Eye and Ear Infirmary, modifiés cette technique afin que le plastique intégration n'a pas été nécessaire ^8. Une modification supplémentaire de la technique a eu lieu dans le laboratoire du Dr Jian Zuo recherche de l'Hôpital pour enfants St. Jude ^9-12 qui a informé la méthode de dissection présenté ici. On utilise une stratégie différente pour avoir accès à l'organe de Corti et que Bohne Liberman, ce qui permet l'isolement de toutes les apical, au milieu et à tour de rôle de base. Ainsi le tissu disséqué est plus grande et moins susceptibles d'être perdus ou endommagés pendant les processus de dissection ou immunocoloration. De plus, le procédé actuel facilite la mesure de la distance à partir de l'extrémité apicale ou basale crochet pour identifier une région de fréquence.

Bien que de nombreux laboratoires effectuent un marquage de tissu cochléaire, on ne sait pas où cette méthode est originaire. En conséquence, il existe plusieurs recettes pour bloquer Buffers et incubation des anticorps tampons qui peuvent affecter la performance des anticorps primaires individuels. Ici, nous présentons une méthode pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence qui est applicable à des anticorps les plus couramment utilisés dans le domaine auditif.

La forme complexe de la cochlée, la structure délicate de l'organe de Corti, et enrobage osseuse constituent un défi pour l'analyse histologique et biochimique. Une variété de techniques sont actuellement utilisés dans le domaine de l'audition de surmonter ces caractéristiques difficiles et visualiser les cellules à l'intérieur de l'organe de Corti, chaque technique avec ses propres avantages et inconvénients. Le protocole présenté ici permet pour toute la dissection de montage de la cochlée de souris adulte et, avec une légère modification, peut potentiellement être utilisé pour examiner les structures critiques au sein de la cochlée d'une variété d'autres organismes modèles utilisés dans le domaine.

Protocole

Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et l'utilisation Comité à l'École de médecine de l'Université Southern Illinois.

1. Extraction des temporelles Bones

1. Identifier les os temporaux dans la base du crâne de la souris ^{13 et} gratter les nerfs crâniens aide de pinces de modèle standard.
2. Placez la pince de modèle standard à la pointe de la capsule otique et avec le pouce de la presse à main opposée sur le canal semi-circulaire postérieur pour déloger la cochlée encapsulé.
3. Libérez la moitié inférieure de l'os temporal du crâne manuellement avec le pouce et l'index ou en utilisant 10,5 cm de ciseaux fins.

2. Post-temporelles fixer Bones

1. Placer os temporal dans 2 ml contenant des tubes de microcentrifugation de 250 à 500 pi de paraformaldehyde à 4% (PFA) dilué dans 10 mM de tampon phosphate salin (PBS) de pH 7,4 et Incubmangé à RT pour les 2 - 20 heures.
   NOTE: Aucune ouverture de la coiffe apicale ou l'injection de PFA dans la ronde ou fenêtre ovale est nécessaire. Recommander utilisant du méthanol libre, ultra-pure, la microscopie électronique (EM) de grade PFA qui peuvent être achetés à une concentration de 16% dans des flacons de verre. Une fois que le flacon est ouvert et dilué à 1: 4 dans du PBS, en faisant une solution à 4%, il peut être utilisé pour 2 semaines lors d'un stockage ^à 4 ° C (Certains anticorps nécessitent court fixation et d'autres peuvent tolérer O / N (O / N) de fixation).

3. détartrer temporelles Bones

1. Après fixation, retirez PFA aide d'une pipette et le remplacer avec de l'acide 120 mM éthylènediaminetétraacétique (EDTA), un peu plus de 2 ml. Assurez-vous de remplir la totalité de microtube de 2 ml pour éviter les bulles d'air lorsque le tube est fermé.
   1. Si non détartrage immédiatement, replacez PFA avec PBS 10 mM pH 7,4 et stocker des échantillons ^à 4 o C.
      NOTE: Après fixation, os temporaux peuvent être stockés pendant variabLe élève de temps avant la décalcification selon les antigènes en cours d'examen.
2. Placer les tubes sur la fin-sur-end rotateurs et tournent à 4 min à température ambiante. Changer solution d'EDTA quotidiennement à l'aide d'une pipette. Durée de décalcification dépend de l'âge de l'échantillon et la préférence du scientifique faisant la dissection.
   1. Incuber os temporaux en EDTA utilisant les directives suivantes pour les durées d'incubation:
      Pour les échantillons postnatale jour (P) 8 à P15: 2 - 4 h; Pour les échantillons P15 à P21: O / N; Pour les échantillons P21 à P30: 2 O / N; Pour les échantillons de plus de P30: 3 ou plus O / N.
      Remarque: Les temps de décalcification sont soumis à la préférence des utilisateurs et peuvent être prolongés si nécessaire. Temps de décalcification peut être réduite par modification de la solution d'EDTA deux fois par jour, environ 8 heures d'intervalle. Certains laboratoires ajouter 1% de PFA à la solution d'EDTA un détartrage pendant plus de 3 jours pour éviter la contamination.
3. Pour déterminer si l'échantillon est suffisamment détartrer, placez os temporaux ona silicium enduit d'élastomère plat de dissection et appuyez doucement forceps sur la cochlée forme d'escargot. Si le tissu est spongieuse, puis décalcification est terminée.
4. Une fois décalcification est terminée, retirez EDTA aide d'une pipette et ajouter 500 -1 000 pi de PBS 10 mM pH 7,4. Conserver les échantillons à 4 ^{° C} jusqu'au moment de disséquer.

4. Créer un élastomère de silicone revêtu Dish Dissection

1. Mélanger la base et le durcisseur d'un kit d'encapsulation d'élastomère de silicone selon les instructions du fabricant et bien mélanger.
2. Ajouter environ 2 - 3 cuillères à soupe de poudre de charbon jusqu'à ce que la solution est noir et bien mélanger.
   REMARQUE: Encre liquide ou de charbon liquide ne se mélangent pas avec la solution et ne peuvent pas être utilisés. Kits élastomère d'encapsulation en silicone peuvent être achetés en noir, ce qui permet à l'étape 4.2 être omis.
3. Versez la solution dans 60 mm de verre ou des boîtes de Petri en plastique, suffisamment copieux pour recouvrir le fond. Si bubbles sont présents, gonflent avec de l'air à la surface. Laisser reposer au moins 24 heures à la température ambiante à définir.
   REMARQUE: plats enduits d'élastomère de silicone peuvent être utilisés de façon répétée pendant des années. Cependant, ne pas utiliser l'éthanol pour le nettoyage, car cela provoquerait l'élastomère de silicone à se fissurer.

5. Mont entiers Dissection de la cochlée (pour P7 et anciens échantillons)

1. Séparer le tour basal de tours moyen / apical
   1. Placez un os temporal adoucie dans un plat de dissection élastomère de silicone revêtu rempli aux deux tiers avec du PBS 10 mM pH 7,4 et utiliser un microscope de dissection stéréo pour les étapes suivantes.
   2. Tenir l'os temporal dans la région vestibulaire avec n ° 4 ou n ° 5 des pinces de bijoutier droite et en utilisant 5 mm Vannas-Tübingen ciseaux à ressort, couper l'excédent de tissu de la capsule otique sur les côtés et au-dessus de l'apex.
   3. Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, insérer une lame dans la fenêtre ovale et de faire plusieurs petites coupures le long de la spirale ligament / latéraleparoi de la tour basal.
   4. Utilisation de 5 mm Vannas-Tübingen ciseaux à ressort, insérer une lame dans la région il suffit de couper et placer l'autre lame à l'extérieur de l'os temporal, en dedans de la fenêtre ovale. Cette coupe sépare le tour basal de virages moyens et apical.
2. Dissection complète du tour basal.
   1. Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, couper les fibres nerveuses du ganglion spiral qui se connectent à l'modiolus pour relâcher la tension dans la tour basal et couper en dessous de la tour basal de se séparer de organes vestibulaires.
   2. Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, faire une série de petites coupures pour supprimer le / paroi latérale spirale ligament du dessus et en dessous l'organe de Corti. Utilisez # 4 ou # 5 pince de bijoutier droite pour guider le tissu. Epingler les fibres nerveuses ganglionnaires spirale vers le plat de dissection d'enduit d'élastomère de silicone, mais ne tenez pas sur cette région que le tissu se déchire.
   3. Au cours des étapes précédentes, une partie de la Membran de Reissnere va souvent être retiré. Si tout reste encore, saisir la membrane de Reissner avec une pince de n ° 4 ou n ° 5 droite bijoutier et se détache de l'organe de Corti.
      NOTE: La membrane de Corti est rarement visible et flotte généralement distance sans nécessiter une étape spécifique pour l'enlèvement.
   4. Faire Enfin plusieurs coupes de réduire l'épaisseur des axones du ganglion spiral, pour faire le tour le plus plat possible et utiliser n ° 4 ou n ° 5 des pinces de bijoutier droit de transférer le tour basal disséqué, en saisissant les axones restants du ganglion spiral, à une plaque de 48 puits (ou lame de chambre) contenant ~ 500 pi de PBS 10 mM pH 7,4.
3. Moyen séparée et tours apical
   1. Placez les deux-tiers restants de la cochlée, côté apical vers le bas.
   2. Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, insérer une lame dans les médias de Scala où le tour Moyen utilisé pour être connecté à la tour basal, et de faire plusieurs petites coupures le long de la paroi spirale ligament / latérale de ee spire médiane.
   3. Utilisation de 5 mm Vannas-Tübingen ciseaux à ressort, insérer une lame dans la région il suffit de couper avec le tour Moyen placé sur le dessus de la lame, et placer l'autre lame à l'extérieur du labyrinthe osseux, à un angle de la pointe apicale 90 ^o. Cela sépare le tour du milieu de la tour apicale.
4. Dissection complète du tour milieu d'une manière similaire à la tour basal (voir les étapes 5.2.2 à 5.2.4).
5. Dissection complète du tour apicale.
   1. Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, ouvrir le capuchon qui couvre le tour apicale. Dissection complète d'une manière similaire à la tour basal (voir les étapes 5.2.2 à 5.2.4).
      NOTE: disséqué tours cochléaires peuvent être stockés dans PBS 10 mM pH 7,4 dans une plaque de 48 puits (ou lame de chambre) ^à 4 o C pendant plusieurs semaines avant immunocoloration. Cependant PBS s'évaporer et doit être réapprovisionné périodiquement et le stockage de plus de 2 - 3 semaines peut conduire à la croissance bactérienne ou fongique sur latissu qui peut diminuer la qualité de l'image. Nous recommandons un stockage à long terme des échantillons que os temporaux undissected.

6. Immunocoloration avec par fluorescence Tagged Anticorps

1. Après la dissection, stocker chaque tour cochléaire dans un puits séparé dans une plaque de 48 puits (ou lame de chambre), immergé dans ~ 500 pi de PBS 10 mM pH 7,4. Pour chacune des étapes suivantes de la tour cochléaire doit être immergé dans un liquide, non flottant au-dessus ou collé sur le côté du puits.
   REMARQUE: Lors du retrait de liquide de chaque puits, il est facile de perdre les tours cochléaires ou sucer dans la pointe de la pipette. Modification de solutions avec une pointe de pipette 200 pi en utilisant un champ de dissection aidera à prévenir cela.
2. En utilisant une pipette, retirer PBS de chaque puits et le remplacer par ~ 200 - 300 pi par puits de bloquer / solution de perméabilisation (1% de Triton X-100, 1% de sérum albumine bovine (BSA), et 10% de sérum de chèvre normal (NGS) dilué dans 10 mM de PBS pH 7,4). Incuber 1 heure à température ambiante sur un rotateur 3D.
   NOTE: Si un anticorps primaire utilisé a été faite dans un hôte de chèvre, puis un anticorps secondaire anti-chèvre sera nécessaire et NGS ne doit PAS être utilisé pour toutes les étapes. De sérum de cheval normal peut être utilisé comme un remplacement pour NGS.
3. Retirer la solution de blocage / de perméabilisation en utilisant une pipette et le remplacer par ~ 100 pi par puits de solution d'anticorps primaire (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, 5% de NGS et diluées dans du PBS 10 mM pH 7,4). Le facteur de dilution pour chaque anticorps primaire varie. Incuber O / N (minimum 14 heures) ^à 4 ° C sur un agitateur 3D.
   NOTE: Si plus d'un anticorps primaire est utilisé, tous peuvent être combinés dans la même solution pour l'incubation, assurez-vous que chaque anticorps primaire a un hôte différent.
4. Retirer la solution d'anticorps primaire à l'aide d'une pipette et effectuer 3 lavages de PBS 10 mM pH 7,4 à ~ 500 ul par puits. Chaque lavage couve un minimum de 5 min à température ambiante sur un rotateur 3D.
5. Retirer P dernièreBS laver avec une pipette et le remplacer avec ~ 100 pi par puits d'une solution d'anticorps secondaire (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, et 5% NGS dilué dans 10 mM PBS pH 7,4). Le facteur de dilution pour chaque étiqueté par fluorescence anticorps secondaire est habituellement de 1: 500 ou 1: 1000. Placez la plaque de 48 puits dans une boîte noire pour protéger fluorescence marqués Anticorps secondaires de la lumière. Incuber 2 - 3 heures à température ambiante sur un rotateur 3D.
   REMARQUE: si plus d'un anticorps secondaire est nécessaire, ils peuvent être combinés dans la même solution pendant l'incubation. Assurez-vous qu'il n'y a pas de possibilité de contre-étiquetage (par ex., En utilisant chèvre anti-lapin et de poulet anti-chèvre Anticorps secondaires)
6. Retirer la solution d'anticorps secondaire à l'aide d'une pipette et effectuer 3 lavages de PBS 10 mM pH 7,4 à ~ 500 pi par puits. Incuber chaque lavage pendant au moins 5 min à température ambiante sur un agitateur 3D. Gardez plaque de 48 puits dans une boîte noire à l'abri de la lumière.
7. Retirez dernier lavage PBS aide d'une pipette et le remplacer par ~ 100 pi par puits de HoecTVH 33342 (dilué 1: 2000 dans PBS 10 mM pH 7,4) pour marquer les noyaux. Incuber 15 - 20 min à température ambiante sur un rotateur 3D. Gardez plaque de 48 puits dans une boîte noire à l'abri de la lumière. Ne pas incuber plus de 20 minutes.
8. Retirer solution Hoechst aide d'une pipette et effectuer 3 lavages de PBS 10 mM pH 7,4 à ~ 500 pi par puits. Incuber chaque lavage pendant au moins 5 min à température ambiante sur un agitateur 3D. Gardez plaque de 48 puits dans une boîte noire à l'abri de la lumière.
9. Toutes les étapes peuvent être prolongés, sauf Hoechst incubation, de plusieurs heures si nécessaire. Pour interrompre la réaction à tout moment, simplement plonger échantillons dans ~ 500 ul de 10 mM PBS pH 7,4 et stocker la plaque 48 eh bien (ou chambre lame) ^à 4 o C jusqu'au moment de reprendre les heures de protocole ou 1 - 2 jours plus tard .
   

7. Mont Cochlear Active Diapositives

1. Étiquette glisse avec des informations pertinentes sur l'échantillon et les anticorps utilisés.
2. Pipette ~ 50 pi de milieu de montage sur chaque diapositive et soyez prudentpour éviter que des bulles. Centrifuger le tube contenant les milieux de montage pour éliminer les bulles.
3. Utilisation # 4 ou pince de # 5 droite bijoutier, saisir les axones du ganglion spiral de transférer en douceur un tour cochléaire de la plaque de 48 puits à la diapositive et le lieu dans les milieux de montage. Montez un tour cochléaire par diapositive pour éviter exposition à la lumière et photoblanchiment pendant le processus d'imagerie.
4. Utiliser un microscope de dissection stéréo pour assurer ce tour cochléaire soit pas plié, tordu, ou près d'une bulle d'air. Si l'une de ces situations se produit, les pinces d'utilisation n ° 4 ou n ° 5 droite bijoutier pour repositionner le tour cochléaire.
5. Placez une extrémité d'une lamelle sur la lame et relâchez doucement pour laisser la chute de lamelle.
6. Utilisez une dissection microscope stéréo pour garantir que le tour cochléaire soit pas plié, tordu, ou près d'une bulle d'air. Si l'une de ces situations se produit, déplacez doucement la lamelle d'avant en arrière pour repositionner le tour cochléaire.
7. Placer les lamesdans un dossier de diapositives afin qu'ils reposent à plat. Laissez montage remède médias O / N à température ambiante (garder dans l'obscurité)
8. Des lamelles de sceller avec vernis transparent de l'ongle et stocker à température ambiante ou à -20 ^{° C} jusqu'à ce imagés. Les diapositives peuvent être stockées dans un dossier de diapositives ou boîte de diapositive.
   REMARQUE: Les diapositives peuvent être stockées à long terme à -20 ^{° C ou} -80 ^{° C} et la fluorescence sera maintenu pendant plusieurs mois.
9. Glisse image en utilisant un microscope confocal à la longueur d'onde appropriée sur la base des anticorps secondaires utilisés durant la procédure d'immuno-coloration. Réglage de la luminosité et de contraste peuvent être effectuées en utilisant le logiciel d'imagerie fournie par le fournisseur confocale.

Résultats

Nous présentons une méthode pour isoler l'organe de Corti que trois tours intactes cochléaires (de sommet, milieu, et la base) à partir de tissu cochléaire qui est calcifiée, avec des étapes de dissection clés présentés dans la figure 1. Pendant la première semaine postnatale du développement, la calcification de la cochlée de souris est incomplète et une méthode de dissection plus simple peut être utilisé ^13. En utilisant...

Discussion

Il ya plusieurs étapes cruciales pour la réussite de toute la dissection de montage et immunologique. Cependant, avant l'une de ces méthodes sont exécutées, fixation appropriée du tissu cochléaire est nécessaire. Nous vous recommandons d'utiliser le méthanol libre, ultra-pure, de qualité EM PFA. PFA fait à partir de poudre peut avoir des traces de méthanol et un pH instable qui diminue la qualité de l'immunofluorescence. D'autres groupes ont également montré que les dissections simil...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard  pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	can be purchased from other vendors
10.5 cm fine scissors	Fine Science Tools	14060-11	can be purchased from other vendors
2 ml microcentrifuge tubes	MidSci	AVSS2000	can be purchased from other vendors
16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade	Polysciences	18814	TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.
PBS pH 7.4	Sigma	P3813-10PAK	can be purchased from other vendors
EDTA	Fisher	BP118-500	can be purchased from other vendors
end-over-end tube rotator	Fisher	05-450-127	can be purchased from other vendors
60 mm petri dish	Fisher	50-202-037	can be purchased from other vendors
Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
activated charcoal	Fisher	AC134372500	can be purchased from other vendors
stereo dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000	can be purchased from other vendors
Dumont #4 jeweler's forceps	Fine Science Tools	11241-30
Dumont #5 jeweler's forceps	Fine Science Tools	11251-20
2.5 mm Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08	curved
5 mm Vannas-Tubingen spring scissors	Fine Science Tools	15003-08	straight
48 well plates	Fisher	08-772-52	can be purchased from other vendors
8 well chamber slides	Fisher	1256518	can be purchased from other vendors
Triton X-100	Sigma	X100-500	can be purchased from other vendors
BSA, fraction V	Fisher	BP1605	can be purchased from other vendors
NGS	Vector labs	S-1000	can be purchased from other vendors
NHS	Vector labs	S-2000	can be purchased from other vendors
3D rotator	Midsci	R3D-710	can be purchased from other vendors
Western blot incubation box XL	Licor	929-97401
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	can be purchased from other vendors
Prolong gold antifade mounting media	Life Technologies	P36930	can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching
Superfrost Plus Slides	Fisher	12-550-15	can be purchased from other vendors
coverslips 22 x 22 x 1	Fisher	12-548-B	can be purchased from other vendors
clear nail polish	Local drug store		can be purchased from other vendors
cardboard slide folder	Fisher	12-587-10	can be purchased from other vendors
plastic slide box	Fisher	03-448-10	can be purchased from other vendors