Всего горе Вскрытие и Иммунофлуоресценции взрослых мышей улитки

Резюме

Мы представляем метод, чтобы изолировать взрослых орган Корти, как три неповрежденных кохлеарных поворотов (вершины, середины и основания). Мы также продемонстрировать процедуру иммуноокрашивания с флуоресцентно меченых антител. Вместе эти методы позволяют изучать волосковых клеток, поддерживающих клеток, и другие типы клеток, найденный в улитку.

Аннотация

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

Введение

Спираль-образный улитка внутреннего уха, содержащиеся в височной кости, находится орган Корти, слуховой сенсорной конечного органа у млекопитающих. Улитки tonotopically организованы и обычно делится на апикальной, средней и базальной поворачивает соответствующие различным частотных областей с обнаружением звукового высокочастотного в основании и низкой частоты обнаружения в вершине ^1. Клетки волос, механосенсорные клетки органа Корти, запустите длину улитки, который давно примерно 6 мм у мышей ^2,3. Эти клетки преобразуют механическую энергию звуковых волн, которые передаются через заполненный жидкостью перепончатого лабиринта, в нервные сигналы, обработанные посредством центральных слуховых структур. Описанная методика здесь обеспечивает способ получения тотальных органа Корти после кальцификации улитки завершения (для образцов от одной недели возраста к взрослой жизни). Мы также представляем метод для immunostaоцен- ками в целом установлен кохлеарной ткани. Кохлеарные тотальных являются критическими для визуализации всех клеток и волос окружающие поддерживающие клетки в их естественной пространственным расположением и позволяют анализа в трех измерениях с использованием конфокальной микроскопии.

Доктора. Ханс Engstrom и Харлоу Адес первоначально описан целый монтировать кохлеарной метод вскрытия в 1966 году они подробно технику, чтобы быстро исправить и анализировать кальцинированная cochleae погруженный в жидкость из различных млекопитающих, сохраняя нетронутыми короткие сегменты органа Корти для микроскопического анализа ^4. Рассечение незафиксированного, кальцинированная крысы улитки также были проиллюстрированы в качестве учебного ^видео 5. Доктора. Барбара Bohne и Гэри Хардинг в Университете Вашингтона сделал несколько важных изменений в этом методе. По их версии всей метода кохлеарной горе, временная кость декальцифицировали, встроенные в пластик, и пять полуоборотов или десять четверть-оборота были dissecТед ^6,7. Доктор Чарльз Либерман и его коллеги Eaton Пибоди, Массачусетс Laboratories глаз и ухо лазарете, модифицированный эту технику так, что пластик вложение не требуется ^8. Кроме того модификация техники произошел в лаборатории доктора Цзянь Цзо в исследовательского госпиталя Святого Иуды детей ^9-12, которые сообщили метод вскрытия представленные здесь. Мы используем различные стратегии, чтобы получить доступ к органа Корти, чем Bohne и Либермана, который позволяет изоляцию полной верхушечные, середине и базальных поворотов. Таким образом, расчлененный ткани больше и менее вероятно, чтобы быть потеряны или повреждены во время вскрытия или иммуноокрашивания процессов. Кроме того, в настоящее время метод облегчает измерение расстояния от апикальной наконечником или базальной крюк, чтобы определить область частот.

Хотя многие лаборатории выполняют иммунное кохлеарной ткани, непонятно, где этот метод возник. В результате существуют различные рецепты для блокирования BuffeRS и антитела инкубации буферы, которые могут повлиять на производительность отдельных первичных антител. Здесь мы представляем один метод для иммуноокрашивания с флуоресцентно меченых антител, которые применяется к наиболее часто используемых антител в слуховой области.

Сложная форма улитки, нежная структура органа Корти, и костлявая обделки обеспечить вызов для гистологического и биохимического анализа. Разнообразие методов в настоящее время используется в области слуха преодолеть эти трудные функции и визуализировать клетки внутри органа Корти, каждого метода с собственными преимуществами и недостатками. Протокол, представленные здесь позволяет всей горе вскрытии улитки взрослых мышей, и с небольшим изменением, потенциально могут быть использованы для изучения критических структур внутри cochleae из различных других модельных организмов, используемых в этой области.

протокол

О себе этика: Процедуры с участием животных предметы были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в университете Южного Иллинойса школа медицины.

1. Добыча височных костей

1. Определить временные кости в основании черепа мыши ^{13 и} соскрести черепных нервов, используя стандартную схему щипцы.
2. Поместите стандартная схема щипцы на кончике слухового капсулы и большим пальцем противоположной руки надавите на задней полукружных каналов, чтобы сместить инкапсулированный улитку.
3. Освободите нижнюю половину височной кости из черепа вручную с большим и указательным пальцем или с помощью 10,5 см тонкие ножницы.

2. После исправить височных костей

1. Поместите височных костей в 2 мл микроцентрифужных пробирках, содержащих 250 - 500 мкл 4% параформальдегида (PFA), разбавленного в 10 мМ фосфатно-солевым буфером (PBS), рН 7,4, и incubели при КТ в течение 2 - 20 ч.
   Примечание: Нет открытие апикальной крышкой или инъекции PFA в круглой или овальной окна не требуется. Рекомендуется использовать метанол бесплатно, ультра-чистое, электронная микроскопия (ЭМ) класса PFA, которые можно приобрести в концентрации 16% в стеклянных флаконах. После того, как флакон открыт и разводили 1: 4 в PBS, делая 4% раствор, его можно использовать в течение 2 недель при хранении при 4 ^{° С} (Некоторые антитела требует короткого фиксации и другие могут переносить O / N (/ N) крепление).

3. ДЕКАЛЬЦ височных костей

1. После фиксации удалите PFA с помощью пипетки и заменить 120 мм этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), чуть больше, чем 2 мл. Убедитесь, чтобы заполнить весь 2 мл микроцентрифужных трубку для предотвращения пузырьков воздуха, когда труба закрыта.
   1. Если не легкое, сразу замените PFA 10 мМ PBS, рН 7,4, и хранить образцы при температуре 4 ^{° С.}
      Примечание: После фиксации височных костей можно хранить в течение variabле составляет времени, прежде чем декальцинация в зависимости от антигенов рассматривается.
2. Место трубки на конец над конец ротатора и вращать при 4 мин при комнатной температуре. Изменить ЭДТА в день с помощью пипетки. Длина декальцинации зависит от возраста образца и предпочтения ученого делает вскрытие.
   1. Выдержите височных костей в ЭДТА, используя следующие руководящие принципы для инкубационного периода:
      Для образцов послеродовой день (P) 8 до P15: 2 - 4 ч; Для образцов P15 на P21: O / N; Для образцов P21 P30 на: 2 O / N; Для образцов старше P30: 3 или более O / N.
      ПРИМЕЧАНИЕ: раз декальцинация подлежат предпочтения пользователей и может быть продлен в случае необходимости. Время Декальцификация может быть уменьшено путем изменения ЭДТА два раза в день, около 8 ч друг от друга. Некоторые лаборатории добавить 1% PFA в ЭДТА, когда легкое, более чем на 3 дня, чтобы предотвратить загрязнение.
3. Чтобы определить, если образец адекватно декальцинированной, разместить височных костей она кремний эластомер покрытием рассечение блюдо и осторожно нажмите на щипцы улитки-формы улитки. Если ткань spongey, то декальцинации завершена.
4. После завершения удаления накипи, удалить ЭДТА с помощью пипетки и добавить 500 -1000 мкл 10 мМ PBS, рН 7,4. Образцы хранят при температуре 4 ^{° С} до готовности анализировать.

4. Создать силиконового эластомера покрытием Dissection блюдо

1. Объедините основы и отвердителя из инкапсулянта комплект силиконового эластомера в соответствии с инструкциями изготовителя и тщательно перемешать.
2. Добавить примерно 2 - 3 столовые ложки порошка древесного угля, пока раствор не черный и хорошо перемешать.
   Примечание: жидкие чернила или жидкий уголь не будут смешиваться с раствором и не могут быть использованы. Силиконового эластомера инкапсулирующие наборы можно приобрести в черном, что позволяет шаг от 4,2 до быть опущены.
3. Залейте раствор в 60 мм стеклянных или пластиковых чашках Петри, достаточно заполнения, чтобы покрыть дно. Если буbbles присутствуют, слоеного воздухом на поверхности. Дайте постоять, по крайней мере 24 ч при комнатной температуре, чтобы установить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: силиконовый эластомер покрытием блюда можно использовать повторно в течение многих лет. Однако не следует использовать этанол для очистки, так как это приведет к тому, силиконовый эластомер взломать.

5. Всего горе Рассечение улитки (для Р7 и пожилых образцов)

1. Отделите базальной поворот от средних оборотов / верхушечных
   1. Разместите один декальцинированной височной кости в силиконовый эластомер покрытием рассечение блюдо, заполнены на две трети с 10 мМ PBS, рН 7,4 и использовать стерео рассечение микроскоп для следующих шагов.
   2. Держите височной кости в вестибулярной области с # 4 или # 5 щипцы прямо ювелира и с использованием 5 мм Vannas-Тюбингене весенние ножницы, вырезать излишки ушной капсулы ткани по бокам и над вершиной.
   3. Использование 2,5 мм Vännäs весенние ножницы, вставьте одно лезвие в овальное окно и сделайте несколько небольшие порезы вдоль спиральных связки / боковаяСтенка базального оборота.
   4. Использование 5 мм Vannas-Тюбингене весенние ножницы, вставьте одно лезвие в область только вырезать и поместить другое лезвие на внешней височной кости, медиально к овального окна. Это сокращение отделяет базальной поворот от средних и апикальных оборотов.
2. Полное рассечение базальной свою очередь.
   1. Использование 2,5 мм Vännäs весенние ножницы, вырезать спирального ганглия нервные волокна, которые подключаются к Modiolus чтобы снять напряжение в базисной свою очередь и сократить ниже базальной свою очередь отделить от вестибулярных органов.
   2. Использование 2,5 мм Vännäs весенние ножницы, сделать серию небольших разрезов, чтобы удалить спираль связок / боковую стенку от выше и ниже органа Корти. Используйте # 4 или # 5 щипцы прямо ювелира, чтобы направлять ткань. Pin спирального ганглия нервные волокна к силиконового эластомера покрытием рассечение блюдо, но не удержать этой области, как ткань будет рваться.
   3. Во время предыдущих этапов, некоторые из мембранных Рейснерае часто будет удалена. Если какой-либо до сих пор остается, понять мембраны Рейсснера щипцами # 4 или # 5 прямых ювелирных и оторваться от органа Корти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: покровная мембрана редко видно и, как правило уплывает, не требуя определенного шаг для удаления.
   4. Наконец сделать несколько сокращений, чтобы уменьшить толщину спирального ганглия аксоны, чтобы сделать поворот как можно более плоскими и использовать # 4 или # 5 щипцы прямо ювелира перенести расчлененный базальной очередь, путем захвата оставшихся аксоны спирального ганглия, чтобы 48-луночный планшет (или камера слайд), содержащих ~ 500 мкл 10 мМ PBS, рН 7,4.
3. Отдельная среднего и вершинные повороты
   1. Поместите оставшиеся две трети улитки, апикальной стороной вниз.
   2. Использование 2,5 мм Vännäs весенние ножницы, вставьте одно лезвие в Scala средах, где средний оборот используется для подключения к базальной свою очередь, и сделать несколько небольшие порезы вдоль спиральных связок / боковой стенки гое среднего очередь.
   3. Использование 5 мм Vannas-Тюбингене весенние ножницы, вставьте одно лезвие в область просто вырезать со средним свою очередь помещается в верхней части клинка, и поместите другое лезвие на внешней костного лабиринта, в 90 ^о углом апикальной наконечником. Это отделяет средний поворот от апикальной свою очередь.
4. Полное рассечение средний опорный аналогичным способом к базовой свою очередь (см шаги 5.2.2 5.2.4).
5. Полное рассечение апикальной свою очередь.
   1. Использование 2,5 мм Vännäs весенние ножницы, откройте крышку, закрывающую верхушечный поворот. Полное рассечение таким же образом к базальной свою очередь (см шаги 5.2.2 5.2.4).
      Примечание: рассекали кохлеарные повороты могут быть сохранены в 10 мМ PBS, рН 7,4 в 48-луночный планшет (или камеры слайда) в 4 ^{° С} в течение нескольких недель до иммунной окраски. Однако PBS будет испаряться, и нужно периодически пополняться и хранение более чем на 2 - 3 недель может привести к бактериальной или грибковой роста наткани, которые могут снизить качество изображения. Мы рекомендуем долгосрочное хранение образцов как undissected височных костей.

6. Иммуноокрашивание с флуоресцентно меченых антител

1. После вскрытия, хранить каждую кохлеарной поворот в отдельном колодце в 48-луночного планшета (или камеры), слайд погружен в ~ 500 мкл 10 мМ PBS, рН 7,4. Для каждого из следующих шагов улитки очередь должна быть погружена в жидкость, а не плавает на верхней или застряли в сторону скважины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При удалении жидкости из каждой лунки, это легко потерять кохлеарные очереди или сосать его на кончике пипетки. Изменение решения с кончика пипетки 200 мкл, используя рассечение сферу поможет предотвратить это.
2. С помощью пипетки, удалить PBS из каждой лунки и заменить ~ 200 - 300 мкл на лунку блокирующего / пермеабилизации раствора (1% Тритон Х-100, 1% бычий сывороточный альбумин (БСА) и 10% нормальной козьей сыворотки (NGS) разбавляют в 10 мМ PBS рН 7.4). Выдержите 1 час при комнатной температуре на 3D ротатора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если какой-либо первичное антитело используется было сделано в хозяине козьего, то вторичная анти-козел антитела будут необходимы и НГС не должны использоваться для какой-либо из этапов. Нормальный лошадиной сыворотки можно использовать в качестве замены для NGS.
3. Удалить блокирующий / проницаемости раствора с помощью пипетки и заменить ~ 100 мкл на лунку раствора антитела (первичного 0,1% Тритон Х-100, 1% BSA и 5% NGS разбавленные в 10 мМ PBS рН 7,4). Коэффициент разбавления для каждого первичного антитела меняется. Выдержите O / N (минимум 14 ч) при ⁴ ° С на 3D ротатора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется более чем один основной антитела, все могут быть объединены в том же растворе для инкубации, просто убедитесь, что каждый первичный антитело имеет различное множество.
4. Удалить решение первичное антитело с помощью пипетки и выполнять 3 моет 10 мм PBS рН 7,4 при ~ 500 мкл на лунку. Каждая промывка высиживает минимум 5 мин при комнатной температуре на 3D ротатора.
5. Удалить последний PBS мыть с помощью пипетки и заменить ~ 100 мкл на лунку раствора вторичного антитела (0,1% Тритон Х-100, 1% BSA и 5% NGS разбавленные в 10 мМ PBS рН 7,4). Коэффициент разбавления для каждой флуоресцентно помеченные вторичное антитело, как правило, 1: 500 или 1: 1,000. Поместите 48-луночный планшет в черный ящик, чтобы защитить флуоресцентно помеченные вторичных антител от света. Выдержите 2 - 3 ч при комнатной температуре на 3D ротатора.
   Примечание: Если более одного вторичного антитела необходимо, они могут быть объединены в том же растворе для инкубации. Убедитесь, что нет возможности кросс-маркировки (например., Используя козий анти-кролик и курица анти-козел вторичные антитела)
6. Удалить раствор вторичного антитела с помощью пипетки и выполнять 3 промывок 10 мм PBS, рН 7,4 при ~ 500 мкл на лунку. Инкубируйте каждой промывки в течение как минимум 5 мин при комнатной температуре на 3D ротатора. Держите 48-луночного планшета в черном поле, чтобы защитить от света.
7. Удалить последний PBS мыть с помощью пипетки и заменить ~ 100 мкл на лунку HoecHST 33342 (разбавленный 1: 2000 в 10 мМ PBS, рН 7,4), чтобы маркировать ядра. Инкубируют 15 - 20 мин при комнатной температуре на 3D ротатора. Держите 48-луночного планшета в черном поле, чтобы защитить от света. НЕ инкубировать дольше, чем 20 мин.
8. Удалить решение Hoechst с помощью пипетки и выполнять 3 моет 10 мм PBS рН 7,4 при ~ 500 мкл на лунку. Инкубируйте каждой промывки в течение как минимум 5 мин при комнатной температуре на 3D ротатора. Держите 48-луночного планшета в черном поле, чтобы защитить от света.
9. Все этапы могут быть расширены, за исключением того, Hoechst инкубации на несколько часов, если это необходимо. Чтобы приостановить реакцию на любой стадии, просто погрузите образцы в ~ 500 мкл 10 мМ PBS рН 7,4 и хранить 48 -ну пластину (или камеры) в слайд 4 ^{° С} до готовности возобновить часов протокола или 1 - 2 дня позже ,
   

7. Установите Cochlear Включает Слайды

1. Этикетка слайды с актуальной информацией о пробе и антител используется.
2. Внесите ~ 50 мкл монтажных СМИ на каждом слайде и будьте осторожнычтобы предотвратить пузыри. Центрифуга пробирку, содержащую крепежные средства массовой информации, чтобы удалить любые пузырьки.
3. Использование # 4 или # 5 щипцы прямо ювелира, понять аксоны спирального ганглия мягко передачи одного кохлеарного поворот от 48-луночного планшета с горкой и место в монтажных средств массовой информации. Смонтируйте один кохлеарной очередь на слайд, чтобы предотвратить попадания света и фотообесцвечивания в процессе визуализации.
4. Используйте стерео микроскоп рассечение для того, чтобы кохлеарный очередь не сложена, не деформированы, или рядом с пузырьком воздуха. Если какой-либо из этих условий возникают, щипцы использование # 4 или # 5 прямых ювелир, чтобы переместить кохлеарной поворот.
5. Поместите один конец покровное на слайде и осторожно освободить, чтобы покровное осенью.
6. Использование стерео микроскопом рассечение для того, чтобы кохлеарный очередь не сложена, скручены или вблизи воздушного пузырька. Если какой-либо из этих условий возникают, осторожно двигаться покровное и обратно, чтобы переместить кохлеарной поворот.
7. Место слайдыв папке слайд так, чтобы они лежали плоские. Давайте монтажа СМИ вылечить O / N в РТ (держать в темноте)
8. Печать покровные с четким лака для ногтей и хранить при комнатной температуре или -20 ^{° С} до тех пор, пока образ. Слайды могут быть сохранены в папке слайдов или слайд-коробки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды можно хранить на долгий срок при -20 ^{° С} или -80 ^{° С} и флуоресценции будет поддерживаться в течение нескольких месяцев.
9. Слайды изображение, используя конфокальной микроскопии с соответствующей длиной волны на основе вторичных антител, используемых во время процедуры. Иммуноокрашивания Контрастности и яркости может быть выполнена с помощью программного обеспечения, обеспеченные конфокальной поставщика.

Результаты

Мы представляем метод, чтобы изолировать орган Корти, как три неповрежденных кохлеарных поворотов (вершины, середины и основания) с кохлеарной ткани, которая кальцинированная, с ключевых шагов рассечение, представленных на рисунке 1. Во время первой недели по...

Обсуждение

Есть несколько важных шагов для успешного всей горе вскрытии и иммунной окраски. Однако прежде любой из этих методов выполняются, собственно фиксация улитки ткани необходим. Мы рекомендуем использовать метанол бесплатно, ультра-чистое, Е. М. класса PFA. PFA изготовлен из порошка может ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard  pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	can be purchased from other vendors
10.5 cm fine scissors	Fine Science Tools	14060-11	can be purchased from other vendors
2 ml microcentrifuge tubes	MidSci	AVSS2000	can be purchased from other vendors
16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade	Polysciences	18814	TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.
PBS pH 7.4	Sigma	P3813-10PAK	can be purchased from other vendors
EDTA	Fisher	BP118-500	can be purchased from other vendors
end-over-end tube rotator	Fisher	05-450-127	can be purchased from other vendors
60 mm petri dish	Fisher	50-202-037	can be purchased from other vendors
Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
activated charcoal	Fisher	AC134372500	can be purchased from other vendors
stereo dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000	can be purchased from other vendors
Dumont #4 jeweler's forceps	Fine Science Tools	11241-30
Dumont #5 jeweler's forceps	Fine Science Tools	11251-20
2.5 mm Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08	curved
5 mm Vannas-Tubingen spring scissors	Fine Science Tools	15003-08	straight
48 well plates	Fisher	08-772-52	can be purchased from other vendors
8 well chamber slides	Fisher	1256518	can be purchased from other vendors
Triton X-100	Sigma	X100-500	can be purchased from other vendors
BSA, fraction V	Fisher	BP1605	can be purchased from other vendors
NGS	Vector labs	S-1000	can be purchased from other vendors
NHS	Vector labs	S-2000	can be purchased from other vendors
3D rotator	Midsci	R3D-710	can be purchased from other vendors
Western blot incubation box XL	Licor	929-97401
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	can be purchased from other vendors
Prolong gold antifade mounting media	Life Technologies	P36930	can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching
Superfrost Plus Slides	Fisher	12-550-15	can be purchased from other vendors
coverslips 22 x 22 x 1	Fisher	12-548-B	can be purchased from other vendors
clear nail polish	Local drug store		can be purchased from other vendors
cardboard slide folder	Fisher	12-587-10	can be purchased from other vendors
plastic slide box	Fisher	03-448-10	can be purchased from other vendors