La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

Resumen

Los mecanismos que regulan la motilidad intersticial de las células T CD4 efectoras en sitios de inflamación son relativamente desconocidos. Se presenta un enfoque no invasivo para visualizar y manipular en las células T CD4 in vitro -primed en la dermis para los oídos inflamados, lo que permite el estudio del comportamiento dinámico de estas células in situ.

Resumen

La capacidad de las células CD4 T para llevar a cabo funciones efectoras depende de la migración rápida y eficiente de estas células en los tejidos periféricos inflamados a través de un mecanismo que aún no definido. La aplicación de la microscopía multifotónica para el estudio del sistema inmune proporciona una herramienta para medir la dinámica de la respuesta inmune dentro de tejidos intactos. Aquí se presenta un protocolo para no invasiva de imágenes multifotónica intravital de las células T CD4 + en la dermis del oído del ratón inflamadas. El uso de una plataforma de formación de imágenes a medida y un catéter venoso permite la visualización de la dinámica de células T CD4 en el intersticio dérmica, con la capacidad de interrogar a estas células, en tiempo real a través de la adición de anticuerpos de bloqueo a los componentes moleculares clave que participan en la motilidad. Este sistema ofrece ventajas sobre ambos modelos in vitro y procedimientos de imagen invasivos de tipo quirúrgico. Comprensión de las vías utilizadas por las células T CD4 para la motilidad última instancia, puede dar una idea de las Basic función de las células CD4 T, así como la patogénesis de ambas enfermedades autoinmunes y patología de las infecciones crónicas.

Introducción

The effector function of CD4 T cells is critically dependent on their ability to rapidly enter and traverse a wide variety of peripheral tissues to survey for damage, locate foci of infection, or cause pathology from chronic infection or autoimmunity. While the processes of homing to inflamed sites^1-4 and extravasation^5-7 from the vasculature into tissues have been well-characterized, the factors that drive and regulate the interstitial motility of T cells remain undefined. The migration of T cells in complex 3D environments has been studied in vitro through the use of artificial matrices^8-10 or microfluidic devices^11,12, but these fail to recapitulate the complex and dynamic environment of an in vivo system. It is only recently, with the advent of high-resolution multi-color intravital imaging that it has become possible to study the dynamic behavior of immune cells in situ, allowing for a better understanding of intact immune responses.

Over a decade ago, several influential studies were published that first utilized multiphoton microscopy to address immunological questions. Early studies focused on the behavior of immune cells within explanted lymphoid organs^13-16, which were soon followed by techniques to image exposed lymph nodes in anesthetized mice¹⁷. Imaging allowed for new fundamental observations about the stages of lymph node priming of T cells¹⁸, the mechanisms by which T cells migrate in secondary lymphoid organs¹⁹, T cell interactions with other immune cells^20,21, and dynamic T cell positioning within the lymph node²². Although many early studies focused on lymph node dynamics, intravital imaging has been since been utilized to image the immune response in many peripheral tissues, including the brain^23-25, liver²⁶, lung²⁷, and skin^28-30.

The mouse ear dermis is particularly well poised for imaging, due to the thinness of ear skin, a relative lack of hair, and the ease with which it can be isolated from respiratory movements³¹. Indeed, the ear dermis has been used to image the interstitial behavior of dendritic cells^32,33, T cells^28,29,34,35, and neutrophils^36,37, and is a well-established site for studying dermal inflammation. Increasingly, non-invasive procedures have been replacing surgical preparations of the skin, including split dermis^38,39, flank^39,40, or dorsal skin flap window^39,41 models, that can induce changes to the local inflammatory milieu. The use of transferred, in vitro-primed, antigen-specific CD4 effector T cells allows for the study of a homogenous population of cells in the context of a dermal inflammatory response³⁰. Here we describe a non-invasive imaging procedure that allows for the visualization of antigen-specific effector CD4 T cells in the dermal interstitium of the inflamed mouse ear, and the ability to manipulate these cells in real-time by introducing blocking antibodies through a venous catheter. We show that this model is effective for tracking the movement of CD4 T cells in the dermis and for querying the mechanisms that govern this motility.

Protocolo

Todos los procedimientos que implican los ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Rochester, y llevaron a cabo en estricta conformidad con la Ley de Bienestar Animal y la Política de Servicio de Salud Pública sobre la Integridad Personal Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio administrado por los Institutos Nacionales de Salud, Oficina de Bienestar de Animales de Laboratorio.

1. Preparación de las células T efectoras CD4

NOTA: BALB / c ratones transgénicos TCR DO11.10 que reconocen específicamente un péptido de la ovoalbúmina de huevo de gallina (Pova: ISQAVHAAHAEINEAGR). Otros sistemas de TCR transgénicos pueden ser sustituidos, utilizando el péptido cognado apropiado en lugar del Pova donde se indica.

1. Purificar las células T CD4 vírgenes
   1. La eutanasia a un 6-8 semanas de edad / c hembras de ratón BALB DO11.10 mediante la exposición a 2 L / min de CO ₂ hasta que el ratón no muestra signos de movimiento o respiración durante 1 min, seguido por dislocación cervical, o de acuerdo con ladirectrices del comité local institucional Cuidado de Animales y el empleo. Pulverizar el ratón con una solución de etanol al 70% y hacer una incisión de aproximadamente 7 cm en la piel de la barbilla del ratón a 2/3 del camino hacia abajo el abdomen. Hacer 2-3 incisiones cm de la piel desde el extremo de la incisión en el abdomen hacia las patas traseras. Tenga cuidado de no cortar el peritoneo.
   2. Con cuidado, separar la piel del peritoneo tirando suavemente con fórceps. Los ganglios linfáticos inguinales se encuentran en la piel cerca de la unión de las patas traseras con el cuerpo. Eliminar agarrando y tirando con fórceps y lugar en 8 ml de HBSS suplementado con suero de ternera recién nacida al 2% (NCS).
   3. Cosechar los ganglios axilares y braquial nodos del ratón agarrando y tirando suavemente con fórceps. Colocar en el HBSS + 2% NCS con los ganglios linfáticos inguinales.
   4. Cosechar las profundas y superficiales ganglios linfáticos cervicales localizadas en el cuello del ratón con fórceps y el lugar en el HBSS + 2% NCS con el otsus ganglios linfáticos.
   5. cortar suavemente en el peritoneo, teniendo cuidado de no cortar ninguno de los intestinos. Agarre el ciego y el colon con unas pinzas y exponer a los ganglios linfáticos mesentéricos que están ubicadas justo a lo largo del colon. Retirar con cuidado los ganglios linfáticos mesentéricos con una pinza y coloque con el resto de los ganglios linfáticos.
   6. Busque el bazo en la cavidad peritoneal y quitar con cuidado, sosteniendo con unas pinzas y cortar el tejido conectivo de distancia con un par de tijeras quirúrgicas. Coloque el bazo con los ganglios linfáticos.
   7. Preparar una suspensión de células individuales mediante el vertido de los + 2% NCS HBSS que contenía el bazo y los ganglios en un colador de metal colocado en una placa de cultivo de 60 x 15 mm. puré suavemente el bazo y los ganglios a través del colador de metal con el émbolo de una jeringa de 10 ml en el + 2% NCS HBSS.
   8. Con una pipeta, proponer la suspensión celular en un tubo de centrífuga limpio de 50 ml. Enjuague el colador de metal y placa de cultivo con 10 ml adicionales de HBSS + 2% NCS, ucantar una pipeta, y colocar esta solución en el mismo tubo de centrífuga de 50 ml como la suspensión celular.
   9. Girar las células a 600 xg durante 5 min para sedimentar las células y resuspender en 10 ml de HBSS + 2% NCS pipeteando suavemente. A menos que se especifique lo contrario, todos centrifugación debe realizarse a 600 xg durante 5 min.
   10. Diluir 10 l de la suspensión de células en 90 l de 0,1% de azul de tripano en PBS para una dilución 1:10. Colocar 10 l de las células en azul de tripano en un hemocitómetro pipeteando la solución en la ranura en el borde de la hemocitómetro. Contar las células blancas de la sangre en la cuadrícula centro del hemocitómetro, haciendo caso omiso de los eritrocitos que aparecen como un poco más pequeña, redonda, glóbulos rojos de tonos y las células azules muertas / moribundos. Multiplicar el número de células contadas por 10 ^4, por el factor de dilución (10), y por el volumen de las células (10 ml) para determinar el número total de células recogidas en el tubo de centrífuga de 50 ml.
   11. Para enriquecer en células T CD4, centrifugar lacélulas para sedimentar y resuspender las células en 2x10 ⁷ células / ml en una solución que contiene aproximadamente 1 mg / ml anti-CD8 (clon 3.155), 1 mg / ml anti-MHC de clase II (clon M5 / 114), y 1 g / ml anticuerpos anti-CD24 (clon J11d) en HBSS + 2% NCS pipeteando suavemente.
       NOTA: Los anticuerpos utilizados en este paso se derivan de la casa a partir de líneas celulares de hibridoma y las concentraciones son aproximadas. La concentración y el volumen de estos anticuerpos ideales para la lisis del complemento se determinaron empíricamente y varían dependiendo del laboratorio. Alternativamente, varios kits disponibles en el mercado están disponibles para la purificación de las células CD4 T ingenuas y pueden ser sustituidos por la lisis de complemento y el proceso de purificación CD62L + representado aquí. Si se utiliza otro método para purificar las células T CD4 vírgenes, este protocolo se puede continuar desde el paso 1.2.
   12. Incubar en hielo durante 30 min. Al final de esta incubación, descongelar rápidamente complemento de cobaya mediante la colocación en un 37 ° C el agua bath durante aproximadamente 2 min. Añadir 100 l de complemento para cada 1 ml de células en la solución de anticuerpo pipeteando el complemento directamente en la suspensión celular. Se incuban las células en un baño de agua a 37 ° durante 30 min.
   13. Añadir HBSS + 2% NCS para llevar las células a un volumen total de 20 ml en el tubo de centrífuga. Capa en 8 ml de RT medios centrifugación de densidad (densidad 1,086 g / ml) por debajo de las células. Inmediatamente centrifugar las células a 1400 xg a TA durante 15 min con el freno de la centrífuga fuera.
   14. Recoger las células en la interfase utilizando una pipeta serológica células y la transferencia a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Se lavan las células por lo que el volumen en el tubo de centrífuga de 50 ml con HBSS + 2% NCS y la centrifugación.
   15. Resuspender las células en tampón MACS (PBS suplementado con 2% de NCS y EDTA 2 mM) pipeteando y contar como anteriormente, en el paso 1.1.10 suavemente.
   16. Para enriquecer en células T CD4 vírgenes, volver a suspender las células a 2x10 ⁷ células / ml en una soluciónde / ml de anticuerpo anti-CD62L conjugado con biotina 2,5 mg en tampón MACS, basado en el número contado en el paso 1.1.16. Incubar durante 30 minutos en hielo.
   17. Se lavan las células por adición de 10 ml de tampón MACS, y luego centrifugación de las células. Resuspender las células en 10 ⁷ células / 100 l en tampón MACS y añadir perlas de separación magnética con estreptavidina conjugada a una dilución 1:10 directamente a las células. Incubar en hielo durante 20 min.
   18. Lavar las células como antes, en el paso 1.1.17, y resuspender las células en 2x10 ⁸ células / ml en tampón de MACS, en un volumen mínimo de 500 l.
   19. Coloque una columna de separación magnética en el soporte de imán y lavar la columna dejando que fluya tampón MACS 3 ml a través. Aplicar las células a la columna con una pipeta.
   20. Lavar la columna para eliminar las células no unidas por la columna magnética pipeteando 3 ml de tampón MACS a la columna y permitiendo que el tampón MACS fluya a través de, y repetir 3 veces. Desechar el flujo a través de fracción.
   21. Remove la columna del soporte magnético y mantenga sobre un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Pipeta de 5 ml de tampón MACS a la columna y utilizar el émbolo cerrado con la columna para empujar el búfer de MACS a través de la columna para liberar las células unidas de la columna y recoger el flujo a través que contiene las células CD4 T ingenuas enriquecido.
   22. Centrifugar las células y resuspender en 10 ml de RPMI suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS), 100 UI / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, y 50 mM 2-mercaptoetanol (RPMI-10). Contar las células como antes, en el paso 1.1.10.
   23. Ajustar la concentración final de las células CD4 T ingenuas a 6x10 ⁵ / ml en RPMI-10.
2. Purificar T esplénicas APCs empobrecido células
   1. La eutanasia a un 6-8 semanas de edad, hembra de tipo salvaje ratón BALB / c como en el paso 1.1.1.
   2. Pulverizar el ratón con una solución de etanol al 70% y exponer el bazo al hacer una incisión de aproximadamente 3 cm en el lado izquierdo de abdome del ratónnorte. Cortar abrir la capa peritoneal y extirpar el bazo agarrando suavemente con fórceps y se corta lejos del tejido de conexión subyacente con unas tijeras quirúrgicas.
   3. Coloque el bazo en 8 ml de HBSS + 2% NCS.
   4. Preparar una suspensión de células individuales por maceración el bazo, lavado, y contar las células, como antes, en los pasos 1.1.7-1.1.10
   5. Agotar las células T haciendo girar las células a 600 xg durante 5 min para sedimentar y resuspender las células en 2x10 ⁷ en una solución de aproximadamente 1 mg / ml de anticuerpo anti-Thy1.2 (clon J1J) pipeteando suavemente. Se incuban las células en hielo durante 30 min.
      NOTA: Este anticuerpo se deriva de la casa de una línea celular de hibridoma y la concentraton se aproxima. La concentración y el volumen de este anticuerpo ideal para lisis de complemento se determinó empíricamente y variarán entre laboratorios. Otros métodos para la purificación de APC a partir de esplenocitos pueden ser sustituidos si se desea. células T vírgenes y las CPA deben estar preparados en el cultoure desde el paso 1.3.
   6. Añadir complemento de cobaya, incubar, y separar las células en un gradiente de densidad de los medios de comunicación de la centrifugación como antes, en los pasos 1.1.13-1.1.14.
   7. Resuspender las células en 10 ml de RPMI-10 e irradiar las APC mediante la colocación de las células en un tubo de centrífuga de 50 ml en un irradiador gamma de una longitud de tiempo que va a exponer las células a 25 Gy de radiación. Este período de tiempo puede variar en función del irradiador y tendrá que ser calculado cada vez que se irradian las células.
   8. Contar las células en un hemocitómetro como antes, en el paso 1.1.10, y ajustar las células APC a una concentración final de 2.4x10 ⁶ células / ml en RPMI-10.
3. Estimular las células y diferenciar las células T CD4 a un fenotipo Th1 en un cultivo de 5 días.
   NOTA: A pesar de que aquí se presenta un protocolo para la preparación y formación de imágenes efectores Th1 generadas a partir de células T CD4 vírgenes, este protocolo se puede ajustar para diferenciar las células de los animales a un fenotipo diferente, o to utilizar otros tipos de células, como las células T CD8. Condiciones para el cebado y la diferenciación tendrán que ser determinado empíricamente.
   1. En cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos, se combinan 500 l de las células T CD4 vírgenes y 500 l de las APC irradiadas en cada pocillo, para un total de 3x10 ⁵ células T y 1.2x10 ⁶ APC por pocillo.
   2. Preparar una solución en RPMI-10 que contiene 2 mM de péptido cognado OVA, 20 U / ml IL-2 recombinante, 80 mg / ml anti-IL-4 (clon 11B11) y 40 ng / ml IL-12 recombinante y el filtro utilizando un 0,2 filtro de jeringa de micras. Añadir 1 ml de esta solución a cada pocillo de células, para un volumen total de 2 ml en cada pocillo.
   3. Se incuban las células en una incubadora a 37 ° en 5% de CO ₂ durante 3 días.
   4. El día 3, dividir las culturas pipeteando suavemente para resuspender las células y en movimiento 1 ml de cada pocillo a una nueva cultura también. Llevar cada pocillo para un volumen final de 2 ml por la adición de 1 ml / pocillo de RPMI-10 + 20 U / ml recombinante IL-2.
   5. Volver las placas a la incubadora y permitir que las células se expanden hasta día 5.

2. La transferencia de células y la inducción de la inflamación

NOTA: Para obtener el número de células óptimas para la formación de imágenes, 5x10 ⁶ células Th1 marcados con fluorescencia deben ser transferidos a cada ratón en un volumen total de 200 l de PBS. Las células que aquí se etiquetan con la CFSE tinte verde o el tinte CMTMR casi rojo, aunque se pueden usar otros tintes rastreador celular. CFSE y células marcadas con CMTMR pueden co-transferidos a permitir el seguimiento de dos poblaciones CD4 distinto efectoras.

1. Las células T efectoras etiqueta con CFSE
   1. Recoger las células de las placas de cultivo pipeteando enérgicamente las células en cada pocillo y transferir a un tubo de centrífuga de 50 ml estéril con una pipeta. Contar las células como en el paso 1.1.10, después centrifugar y resuspender las células en 10 ⁷ células / ml en PBS + 5% NCS.
   2. Diluir 5 mM solución madre CFSE 1: 100 enPBS. Añadir 110 l solución CFSE por cada 1 ml de las células mediante la colocación de una gota de solución de CFSE en el lado del tubo y luego rápidamente de oscilación del tubo hacia atrás y adelante para mezclar a fondo.
   3. Se incuban las células durante 5 min a RT, a continuación, enfriar rápidamente la CFSE mediante la adición de 5 ml de suero de ternera fetal (FCS) directamente al tubo de las células. Llevar el volumen a 50 ml con PBS + 5% NCS.
   4. Centrifugar las células y resuspender el precipitado en 20 ml de PBS + 5% NCS. Repetir este proceso dos veces más para lavar las células 3 veces en total. Contar las células en un hemocitómetro, como antes, en el paso 1.1.10, y resuspender las células en PBS estéril a 2,5 x 10 ⁷ células / ml para la transferencia a ratones.
2. Las células T efectoras etiqueta con CMTMR
   1. Recoger las células como anteriormente en la etapa 2.1.1, a continuación, contar, centrifugar y resuspender las células en 10 ⁷ células / ml en RPMI-10.
   2. Añadir CMTMR mM solución madre 10 directamente a las células para una concentración final de 10 mM. º rápidamente pipetacélulas e para mezclar a fondo en el CMTMR y evitar la precipitación del colorante.
   3. Incubar 30 minutos en un baño de agua a 37 °. Lavar las células 3 veces en PBS + 5% NCS como antes, en el paso 2.1.3-2.1.4. Contar y resuspender las células en PBS estéril a 2.5x10 ⁷ células / ml para la transferencia a ratones.
3. las células T efectoras de transferencia de ingenua de edad ratones hembra de 6-8 semanas BALB / c.
   1. Dibujar la suspensión de células (paso 2.1.4 o 2.2.3) en una jeringa, teniendo cuidado de eliminar todas las burbujas manteniendo la jeringa de la aguja lado plano, agitando suavemente el lado de la jeringa y mover el émbolo hacia arriba y abajo, si es necesario .
   2. Coloque los ratones en una jaula limpia y calentar suavemente bajo una lámpara de calor hasta que la vena de la cola aparece vasodilatados. Coloque el ratón en un dispositivo de retención y limpie la cola con un algodón con alcohol. inyectar lentamente 200 l de la suspensión celular en la vena lateral de la cola. No debería haber ninguna resistencia a la inyección o burbujeo visible bajo la piel.
4. Inducir la inflamación dérmica mediante la inmunización con adyuvante completo de Freund (CFA)
   NOTA: En este protocolo, la inflamación es inducida por inyección intradérmica de CFA emulsiona con el antígeno, ya sea afín o no afines. Otros modelos inflamatorios pueden ser sustituidos, aunque tendrá que ser ajustado empíricamente el número de células necesarias para la transferencia y el momento de formación de imágenes.
   1. Preparar una solución de 200 mM de péptido OVA en PBS estéril en un tubo de microcentrífuga. Pipet un volumen equivalente de CFA en la parte superior de la solución de péptido.
   2. Emulsionar la solución dibujando en una jeringa / 2 insulina 28 G1 y luego sumergirse la solución de nuevo en el tubo de microcentrífuga, a continuación, repetir esta acción de aproximadamente 20 veces. Cuando está completamente emulsionado, el CFA y solución de péptido formarán una mezcla espesa y opaca.
      NOTA: es esencial utilizar una jeringa de insulina con aguja fija para formar la emulsión, ya que la emulsión se perderá en el espacio muerto en una needl no fijoe jeringa.
   3. Prueba de la emulsión dejando caer una pequeña cantidad en agua colocada en una placa de Petri. La emulsión debe permanecer intacto y no dispersarse en el agua.
   4. Dibuje la emulsión en una jeringa G1 / 2 300 l de insulina 28 y presione hacia abajo con fuerza el émbolo para eliminar grandes burbujas de aire.
   5. Inmediatamente después de la transferencia de la etiqueta fluorescente las células T efectoras, anestesiar a los ratones mediante inyección ip de 2,2,2-tribromoetanol a 240 mg / kg. Evaluar la anestesia por una pizca dedo del pie suave, la administración de más de 2,2,2-tribromoetanol en incrementos de 1 mg, si es necesario.
      NOTA: otros anestésicos aprobados puede ser sustituido por el 2,2,2-tribromoetanol.
   6. Coloque un dedal en el dedo índice izquierdo y agarrar con cuidado la oreja del ratón entre el pulgar y el dedo índice izquierdo con la oreja ventral hacia arriba. Asegúrese de no ejercer una presión excesiva en el oído, lo que puede causar daños mecánicos en la piel.
   7. Deslice la aguja que contiene el correo CFAemulsión en la dermis, con el lado cónico hacia arriba, e inyecte lentamente 10 l de la emulsión en el oído. La colocación de la inyección debe estar en el exterior 1/3 del pabellón auricular, ligeramente fuera del centro para permitir la formación de imágenes óptima.
   8. Monitorear los ratones hasta que la anestesia ha desaparecido y los ratones son capaces de enderezarse y son ambulatorios. los ratones de imagen de 3 días después de la inmunización, proporcionando tiempo para la inflamación y para desarrollar las células T transferidas al tráfico a la dermis del oído.
      NOTA: Los ratones no pueden ser dejados solos en ningún momento mientras está bajo anestesia.

3. Preparación del ratón de la Imagen

1. Preparar un catéter
   1. Retire cuidadosamente la aguja de metal de un / 2 tuberculina (TB) de la aguja de la jeringa 30 G1 con pinzas y limpie cualquier exceso de pegamento, usando un microscopio de disección para visualizar que el pegamento se elimina por completo.
   2. Corte la punta de aguja de la jeringa de otro / 2 TB 30 G1, asegurándose de que la aguja restante sigue siendo patent mediante inspección visual. Slip una pieza 18 cm de PE-10 tubos médicos en la aguja recortado, y se coloca cuidadosamente la aguja de metal desnudo aproximadamente 5 mm en el otro extremo de la tubería, la creación de un catéter.
2. Enjuague el catéter por llenar una jeringa TB 1 ml con PBS estéril, la eliminación de las burbujas de aire. colocar suavemente el catéter en la punta de la jeringa y empuje PBS suavemente pesar de que el catéter para eliminar las burbujas en el tubo.
   NOTA: al empujar fluido a través del catéter, es esencial para mantener el catéter en la jeringa para evitar que la presión del fluido de empujar el catéter fuera de la jeringa.
3. Coloque los ratones en una jaula limpia y calentar suavemente bajo una lámpara de calor hasta que la vena de la cola aparece vasodilatados. Anestesiar al ratón con una mezcla de aire de la habitación y isoflurano (5% de inducción, mantenimiento 1-2%, en 2 L / min velocidad de flujo), entregada a través del conjunto del cono de nariz que se ha unido al vaporizador de isoflurano. Asegúrese de que el ratón se anestesia with una pizca dedo del pie suave. Incrementalmente aumentar la tasa de flujo de isoflurano por 0,1% si se observa el movimiento. Cubra los ojos con pomada oftálmica para evitar el secado y la lesión, mientras que el ratón se anestesia.
   NOTA: Es esencial que los ratones no dejar desatendidos mientras están anestesiadas. Los ratones se debe supervisar con frecuencia para la anestesia suficientes por pizca dedo del pie suave.
4. Inmovilizar la cola en la base con un par de pinzas, y luego limpie la cola con un algodón con alcohol. deslice con cuidado el catéter en la vena lateral de la cola y comprobar la permeabilidad empujando suavemente el émbolo de la jeringa. No debería haber ninguna resistencia al movimiento y sin burbujeo visible de PBS debajo de la piel si se coloca adecuadamente. Colocar el catéter a la cola mediante la aplicación de 1-2 gotas de adhesivo tisular de cianoacrilato al sitio de inyección y dejar secar, aproximadamente 30 seg.
5. Con cuidado, recortar el pelo de la parte posterior y los lados de la oreja con un par de tijeras, teniendo cuidado de no dañar el sken. Recortar los bigotes también. El uso de un hisopo de algodón, humedezca la superficie interior de la oreja con PBS.
6. Girar el ratón y el oído en un cubre de vidrio Nº 1.5 24 x 50 mm. Con unas pinzas, aplanar un poco la oreja sobre la hoja de la cubierta, mover el ratón, si es necesario para asegurar que el oído esté al ras con el vidrio. Eliminar el exceso de PBS desde el oído secando suavemente con un pañuelo de papel limpia.
   NOTA: Asegúrese de no presionar demasiado firmemente en el oído, como la piel fina puede dañarse fácilmente con una presión excesiva.
7. El uso de dos pares de pinzas curvas, agarre una de aproximadamente 20 mm de largo trozo de cinta de tela longitudinalmente en las esquinas superiores. Coloque la parte inferior de la cinta en el cubreobjetos en la parte superior de la oreja del ratón y rodar la cinta adhesiva sobre el resto de la oreja, empujando el exceso de pelo fuera del camino con las pinzas si es necesario para colocar la oreja para el cubreobjetos. Presione suavemente en la cinta alrededor de la oreja con un hisopo de algodón seco para asegurar un sello hermético, teniendo cuidado de no presionar sobre el propio oído.
8. Fije la plataforma de imágenes a un bloque de calentamiento 37 ° C con cinta adhesiva. Aplicar grasa de vacío a ambos lados de la zona del oído de la plataforma de formación de imágenes. Girar el ratón para colocar el cubreobjetos sobre la plataforma de formación de imágenes, teniendo cuidado de alinear el oído en el centro del fieltro.
   NOTA: Evite que la grasa de vacío en la cinta, ya que esto hará que venga separada de la hoja de la cubierta de vidrio.
9. Encaje la ojiva isoflurano en el soporte de la plataforma de imágenes, asegurando que la ojiva es seguro y que cubre por completo la nariz del ratón. Corre la grasa de vacío bajo el cubreobjetos, presionando firmemente pero con cuidado el cubreobjetos sobre la plataforma de imágenes con un hisopo de algodón limpio y seco.
10. Colocar el cubreobjetos a la plataforma con dos 20 mm trozos de cinta y dos piezas más largas de cinta envuelta alrededor de la parte superior de la plataforma. Si las burbujas de aire están presentes entre el oído y el cubreobjetos, que se pueden eliminar suavemente pulsando en la oreja desde abajo with un pedazo de papel doblado.
    NOTA: Es muy importante no utilizar papel demasiado grueso o para presionar con firmeza, ya que esto puede causar daños en los tejidos y el escaldado, lo que complica los resultados.
11. Mover el ratón a la platina del microscopio y asegure la plataforma con cinta adhesiva. Pipe una doble capa de grasa de vacío en el cubreobjetos alrededor de la oreja para servir como un depósito para el objetivo de inmersión en agua.
12. Envuelva una manta eléctrica llena de agua alrededor del ratón a través de la plataforma de imágenes. Llene el depósito con agua a 37ºC destilada. Asegúrese de que todo lo que se asegura a la etapa con cinta adhesiva y que la jeringa del catéter es de fácil acceso.

4. En vivo de imágenes de lapso de tiempo y la administración del anticuerpo intravenosa

NOTA: Este protocolo requiere el uso de un microscopio multifotónica equipado con un Ti: Sa sistema láser. El objetivo utilizado es una lente de aumento 25x con 1,05 NA, puesta con un objetoive calentador ajustado a 40 ° C. Se determinó la temperatura óptima para este calentador empíricamente a ser la temperatura adecuada para mantener la dermis del oído a 37 ° C, y puede ser necesario ajustar para su uso en otros sistemas de formación de imágenes. El software de adquisición utilizado puede variar entre los instrumentos y ajustes al protocolo puede tener que ser hecho para trabajar en sistemas configurados de forma diferente. Asegúrese de que las imágenes se pueden guardar en un formato que es compatible con cualquier software de análisis deseado.

1. Ubicar la dermis a través de los oculares mediante el posicionamiento del objetivo sobre el centro de la oreja y bajar el objetivo justo hasta que hace contacto con la superficie del agua en el depósito. El uso de una fuente de luz externa, mirar a través de los oculares y continúe bajando lentamente el objetivo hasta que la superficie de la oreja entra en el foco. Bajar las cortinas interiores y exteriores alrededor de la platina del microscopio.
2. Determinación de la configuración de microscopio y localizar un área para la formación de imágenes
   1. antes imaging, configurar el láser para la excitación máxima y la detección de los fluoróforos deseados mediante el ajuste de la longitud de onda de láser a 900 nm en la ventana de controlador de láser MP, la potencia del láser en el Marco de adquisición: ventana de láser, y las tensiones PMT en la ventana de control de adquisición de Image .
      NOTA: Este procedimiento utiliza una longitud de onda de excitación de 900 nm con filtros para detectar la generación de segundo armónico (420-460 nm), CFSE (495-540 nm), y CMTMR (575-630 nm). Otras configuraciones se pueden utilizar para detectar diferentes fluoróforos como deseado.
   2. Ajuste el microscopio a 512 x 512 píxeles de resolución, con un tiempo de permanencia de 2 microsegundos / pixel en el Marco de adquisición: El tamaño y el modo de Windows. Activar un modo de imágenes en directo para permitir la exploración a través del tejido de un área de imagen haciendo clic en "repetir XY". Idealmente, el área debe ser relativamente uniforme, sin burbujas de aire, y evitar las zonas de los folículos pilosos densos.
      NOTA: La emulsión de CFA es autofluorescent brillantes en el verde y necanales de ar-rojo y debe ser evitado. Un campo óptima se puede encontrar generalmente aproximadamente 3 mm desde el borde de la emulsión. Aproximadamente el 10 - 100 células pueden ser rastreados en una sola imagen. Si hay demasiadas células están presentes, software de seguimiento generalmente no se produzcan problemas al tratar de separar las células situadas cerca, lo que lleva a las pistas de células acortados y / o inexactas.
   3. Una vez que un campo de la imagen apropiada ha sido localizado, determinar la región Z que será reflejada por la localización de la célula "más alto" en la dermis, estableciendo la posición Z a 0 haciendo clic en el botón "Set 0", y el desplazamiento hacia abajo de la Z dirección para medir el grado de profundidad de la célula. Una profundidad de formación de imágenes de 35 a 75 micras es típica. Establecer las posiciones de inicio y fin en el Marco de adquisición: Microscopio ventana. Ajustar el PMT voltajes y potencia del láser en la ventana de "brillante Z" para optimizar la visualización de las células en toda la profundidad del campo de la imagen.
      NOTA: Evitar la formación de la Laser el poder por encima de 25 mW a la muestra, los niveles de potencia de hasta puede causar daño por calor y lesiones estéril a la dermis. El nivel máximo de potencia adecuado para cada microscopio variará y tendrá que ser medida. Debe tenerse en cuenta que el aumento de la potencia del láser o voltajes PMT con la profundidad de tejido no permite la comparación cuantitativa de brillo de la imagen a diferentes profundidades en el análisis post-adquisición.
   4. Compruebe los botones "Time" "Profundidad" y por debajo el botón "Scan" en la ventana de Control de Adquisición de imágenes. Establecer un filtro de Kalman para escanear la imagen 3 veces por línea en la adquisición de imágenes de control: la ventana del modo de filtro y ajustar la profundidad de Z-rebanada en la Adquisición de archivo: Ventana del microscopio de modo que tarda aproximadamente 1 minuto para capturar una pila completa, como se ha señalado en la ventana TimeView.
      NOTA: El intervalo entre las pilas no debe tardar más de aproximadamente 1 min, como los intervalos más largos evitan que el seguimiento de las células que migran rápidamente. Dependiendo de THe tipo de células que se explora, puede necesitar ser ajustado para permitir el seguimiento adecuado de las células por el software de análisis de este intervalo. Z-rebanadas deben ser no más de 5 micras. Generalmente 15-18 Z-rebanadas entre 2-5 micras de espesor son apropiadas para un intervalo de imágenes 1 min.
3. Capturar una imagen de lapso de tiempo pre-anticuerpo
   1. Capturar una imagen de lapso de tiempo de 5 minutos de la zona para evaluar la estabilidad del tejido estableciendo el número de repeticiones de "5" en el ajuste de adquisición: TimeScan ventana y haciendo clic en el botón "Scan".
      NOTA: Tejido "deriva" puede ser causada por no permitir suficiente tiempo para que el oído alcance el equilibrio térmico, la mala preparación del oído, o puede ser debido a la deriva local en una región de la oreja. Si la imagen de 5 minutos no es estable, una nueva imagen de la región en la dermis. Si una segunda imagen en una nueva región sigue siendo inestable, lo mejor es repetir cuidadosamente la preparación del oído y de imagen desde el paso 3.6 con una fresca coverslip.
   2. Si el tejido es estable la imagen de 5 min en, recoger la imagen de lapso de tiempo de un 30-45 min estableciendo el número de repeticiones de entre 30 y 45 en la configuración de Adquisición: Ventana TimeScan, el seguimiento de cualquier deriva del tejido de menor importancia que la imagen es recogido. Guarde el archivo en un formato que es compatible con el software de análisis que se utilizará.
      NOTA: En este punto en el protocolo, los pasos 4.2.2 - 4.3.2 se puede repetir reproducir varias ubicaciones en el mismo oído. Un solo ratón no deben ser mantenidos anestesiado durante más de 4 horas, ya que es más probable que ocurra la muerte.
4. Inyectar anticuerpos bloqueantes y capturar una imagen post-anticuerpo.
   1. Dibuje la mezcla de anticuerpos en una jeringa de 1 ml de TB y retirar la aguja, teniendo cuidado de eliminar todas las burbujas de aire. Pulse en el émbolo de manera que la solución de anticuerpo forma un "gotita" al final de la jeringa.
   2. Levantar las cortinas alrededor del escenario y localizar el catéter. Retire el original PBS-contajeringa caniza del catéter. Sin fijar el catéter hacia abajo, con cuidado colocar la nueva jeringa que contiene los anticuerpos. Mantenga el extremo del catéter a la jeringa e inyecte lentamente la mezcla de anticuerpos en el catéter. Asegúrese de que no hay resistencia a la inyección.
   3. Ajuste el catéter hacia abajo y bajar las cortinas que rodeaban la platina del microscopio. Tenga en cuenta el momento de la inyección y de inmediato comenzar a recoger una nueva secuencia de imágenes 20-40 min en el mismo lugar con la misma configuración de instrumentos como la imagen pre-anticuerpo. Guarde el archivo en un formato apropiado para el software de análisis para ser utilizado.
      NOTA: Entre las imágenes con lapso de tiempo, observar el ratón para la anestesia y respiración suficiente. No se recomienda a la imagen más de un campo después de la administración de anticuerpos, ya que puede haber tasas variables de eliminación del anticuerpo.
5. Se inyecta dextrano marcado con fluorescencia para localizar los vasos sanguíneos, evaluar la permeabilidad del catéter, y medir bpermeabilidad de los vasos lood
   1. Preparar una solución / ml 2 mg de dextrano fluorescente conjugado (70.000 MW) en 100 l de PBS estéril y dibujar en una jeringa, la eliminación de las burbujas de aire.
   2. Usando la misma técnica que en el paso 4.4.1-4.4.2, coloque la jeringa sobre el catéter y se inyecta la solución de dextrano por vía intravenosa.
   3. Capturar una sola pila en 1024 x 1024 píxeles de resolución al cambiar la resolución en el Marco de adquisición: Modo ventana, con la misma configuración de PMT y láser como para las imágenes con lapso de tiempo. Para recoger la imagen, desactive el botón "Time" debajo del botón "Scan" y haciendo clic en el botón "Scan". Esta imagen 3D permitirá que las células T de exclusión situadas en la vasculatura y mostrar que el catéter era de patentes y ha insertado correctamente. La difusión de dextrano fluorescente de los vasos puede ser también utilizado para evaluar la permeabilidad vascular local.
      NOTA: Este de alta resolución (1024 x 1024) imagen estática se utiliza para presentation fines y, además, pueden ser utilizar para el análisis de la arquitectura de los tejidos en la misma zona que las imágenes con lapso de tiempo. Por otra parte, una imagen de 512 x 512 se puede tomar, que se pueden combinar con las imágenes con lapso de tiempo utilizando el software de análisis de imágenes. También puede ser deseable Tiempo de formación de imágenes lapso de la administración de dextrano, dependiendo de las necesidades de investigación de laboratorios individuales. En este caso, la imagen debe ser configurado como en los pasos 4.2.3-4.3.2.
6. Una vez completada la imagen, retire con cuidado el ratón de debajo del objetivo y desenvolver la manta de agua. Retire el cubre desde la plataforma de imágenes mediante la reducción de la cinta y levantar suavemente el vaso hasta que se separe. Mientras que el ratón está todavía anestesiado, separar el oído del cubreobjetos. Si esto es ser un procedimiento terminal, la eutanasia el ratón por dislocación cervical. Si el ahorro de este ratón para obtener imágenes repetidas, devuélvalo a una jaula limpia separada de otros ratones y observar hasta que el ratón puede enderezarse y esambulatorio. Una vez recuperado de la anestesia, el ratón puede ser devuelto a una jaula con otros animales.
7. Importar los archivos de imagen en un programa de análisis de imagen y realizar las correcciones deseadas. Se recomienda evitar de mejoras no lineales y programas y algoritmos automatizados de reducción de suavizado o de ruido. Por lo general, las imágenes sólo necesitan una corrección de fondo menor al aumentar manualmente el punto negro de la imagen antes del análisis. Analizar los datos de imagen mediante el uso de un programa de seguimiento de la célula automatizada con corrección manual, como en Overstreet, Gaylo et al ^30.
   NOTA: Hay muchas suites de análisis de imágenes disponibles, tanto en código abierto y propietario, que se pueden utilizar para cuantificar la dinámica celular de las imágenes multifotónica derivados de este protocolo. El método exacto de análisis de imágenes y los paquetes de software óptimas para ser utilizados dependerá de las necesidades de investigación de los laboratorios individuales.

Resultados

La capacidad para estudiar las respuestas inmunes in situ, sin alterar el entorno inmunológico es esencial en el estudio de las interacciones en tiempo real de las células T efectoras con un tejido inflamado. Obtención de imágenes de la dermis del oído intactos mediante este protocolo, se indica en la Figura 1A y B, permite la visualización de las células efectoras T marcados con fluorescencia transferidos en el intersticio dérmica. Esto...

Discusión

Significado

Aquí se presenta un protocolo completo para la visualización de 4D, efectoras específicas de antígenos células Th1 transferidos en la dermis del oído del ratón intactas. Este método proporciona ventajas sobre algunas modalidades de imagen actuales para varias razones. Formando imágenes de la dermis del oído ventrales, somos capaces de renunciar a la eliminación del vello que se requiere para los protocolos de imágenes que incluye otros sitios de la piel. Aunq...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mice	Jackson Laboratories	000651	Mice used were bred in-house
DO11.10 mice	Jackson Laboratories	003303	Mice used were bred in-house
HBSS	Fisher	10-013-CV	Multiple Equivalent
Newborn Calf Serum (NCS)	Thermo/HyClone	SH30118.03	Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes
Guinea Pig Complement	Cedarlane	CL-5000
anti-CD8 antibody	ATCC	3.155 (ATCC TIB-211)	Antibodies derived from  this hybridoma
anti-MHC Class II antibody	ATCC	M5/114.15.2 (ATCC TIB-120)	Antibodies derived from  this hybridoma
anti-CD24 antibody	ATCC	J11d.2 (ATCC TIB-183)	Antibodies derived from  this hybridoma
anti-Thy1.2 antibody	ATCC	J1j.10 (ATCC TIB-184)	Antibodies derived from  this hybridoma
Ficoll (Fico/Lite-LM)	Atlanta Biologicals	I40650
PBS	Fisher	21-040-CV	Multiple Equivalent
EDTA	Fisher	15323591
biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14)	BD	553149
streptavidin magnetic separation beads	Miltenyi	130-048-101
MACS LS Separation Column	Miltenyi	130-042-401
recombinant human IL-2	Peprotech	200-02
recombinant mouse IL-4	Peprotech	214-14
recombinant mouse IL-12	Peprotech	210-12
anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2)	eBioscience	16-7311-85
anti-IL-4 antibody (clone 11b11)	eBioscience	16-7041-85
RPMI	VWR	45000-412
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15303641
L-glutamine	Fisher	15323671
2-mercaptoethanol	Bio-Rad	161-0710
ovalbumin peptide	Biopeptide		ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo/HyClone	SV30014.03	Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes
24-well culture plate	LPS	3526	Multiple Equivalent
CFSE	Life Technologies	C34554
CMTMR	Life Technologies	C2927
28 G1/2 insulin syringes, 1ml	BD	329420
28 G1/2 insulin syringes, 300μl	BD	309301
27 G1/2 TB syringes, 1ml	BD	309623
30 G1/2 needles	BD	305106
PE-10 medical tubing	BD	427400
cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
heating plate	WPI	61830
Heating plate controller	WPI	ATC-2000
Water blanket controller	Gaymar	TP500	No longer in production, newer equivalent available
water blanket	Kent Scientific	TP3E
Isoflurane vaporizer	LEI Medical	Isotec 4	No longer in production, newer equivalent available
isoflurane	Henry Schein		Ordered through Veterinary staff
microcentrifuge tubes	VWR	20170-038	Multiple Equivalent
medical tape	3M	1538-0
isoflurane nosecone			Built In-house, see Fig 2
imaging platform			Built In-house, see Fig 2
curved forceps	WPI	15915-G	Multiple Equivalent
scissors	Roboz	RS-6802	Multiple Equivalent
glass coverslips	VWR		Multiple Equivalent
high vacuum grease	Fisher	146355D
cotton swabs			Multiple Equivalent
delicate task wipes	Fisher	34155	Multiple Equivalent
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Olympus		call for quote
optical table with vibration control	Newport		call for quote
25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging	Olympus	XLPLN25XWMP2
objective heater	Bioptechs	PN 150815
Detection filter cube	Olympus	FV10-MRVGR/XR	Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics
anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1)	eBioscience	16-0291-85	Azide free, low endotoxin
anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3)	eBioscience	16-0611-82	Azide free, low endotoxin
Texas Red Dextran (70,000 MW)	Life Technologies	D-1830