Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

Riepilogo

I meccanismi che regolano la motilità interstiziale di cellule CD4 T effettrici in siti di infiammazione sono relativamente sconosciuti. Presentiamo un approccio non invasivo per visualizzare e manipolare cellule CD4 T vitro -primed nel derma dell'orecchio infiammate, permettendo studio del comportamento dinamico di queste cellule in situ.

Abstract

La capacità delle cellule T CD4 per svolgere funzioni effettrici dipende dalla migrazione rapida ed efficiente di queste cellule in tessuti periferici infiammati attraverso un meccanismo non ancora definito. L'applicazione della microscopia multiphoton allo studio del sistema immunitario fornisce uno strumento per misurare la dinamica delle risposte immunitarie all'interno tessuti intatti. Qui vi presentiamo un protocollo per l'imaging non invasivo intravitale multifotonica delle cellule T CD4 nel derma per le orecchie del mouse infiammate. Uso di una piattaforma di imaging personalizzato e un catetere venoso permette la visualizzazione delle dinamiche di cellule CD4 T nell'interstizio dermico, con la possibilità di interrogare queste cellule in tempo reale mediante l'aggiunta di anticorpi bloccanti di componenti molecolari coinvolti nella motilità. Questo sistema fornisce vantaggi rispetto ai due modelli in vitro e procedure di imaging invasivi di tipo chirurgico. La comprensione dei percorsi utilizzati dalle cellule T CD4 per la motilità può infine fornire una conoscenza delle basifunzione c di cellule CD4 T e patogenesi di entrambe le malattie autoimmuni e patologia da infezioni croniche.

Introduzione

The effector function of CD4 T cells is critically dependent on their ability to rapidly enter and traverse a wide variety of peripheral tissues to survey for damage, locate foci of infection, or cause pathology from chronic infection or autoimmunity. While the processes of homing to inflamed sites^1-4 and extravasation^5-7 from the vasculature into tissues have been well-characterized, the factors that drive and regulate the interstitial motility of T cells remain undefined. The migration of T cells in complex 3D environments has been studied in vitro through the use of artificial matrices^8-10 or microfluidic devices^11,12, but these fail to recapitulate the complex and dynamic environment of an in vivo system. It is only recently, with the advent of high-resolution multi-color intravital imaging that it has become possible to study the dynamic behavior of immune cells in situ, allowing for a better understanding of intact immune responses.

Over a decade ago, several influential studies were published that first utilized multiphoton microscopy to address immunological questions. Early studies focused on the behavior of immune cells within explanted lymphoid organs^13-16, which were soon followed by techniques to image exposed lymph nodes in anesthetized mice¹⁷. Imaging allowed for new fundamental observations about the stages of lymph node priming of T cells¹⁸, the mechanisms by which T cells migrate in secondary lymphoid organs¹⁹, T cell interactions with other immune cells^20,21, and dynamic T cell positioning within the lymph node²². Although many early studies focused on lymph node dynamics, intravital imaging has been since been utilized to image the immune response in many peripheral tissues, including the brain^23-25, liver²⁶, lung²⁷, and skin^28-30.

The mouse ear dermis is particularly well poised for imaging, due to the thinness of ear skin, a relative lack of hair, and the ease with which it can be isolated from respiratory movements³¹. Indeed, the ear dermis has been used to image the interstitial behavior of dendritic cells^32,33, T cells^28,29,34,35, and neutrophils^36,37, and is a well-established site for studying dermal inflammation. Increasingly, non-invasive procedures have been replacing surgical preparations of the skin, including split dermis^38,39, flank^39,40, or dorsal skin flap window^39,41 models, that can induce changes to the local inflammatory milieu. The use of transferred, in vitro-primed, antigen-specific CD4 effector T cells allows for the study of a homogenous population of cells in the context of a dermal inflammatory response³⁰. Here we describe a non-invasive imaging procedure that allows for the visualization of antigen-specific effector CD4 T cells in the dermal interstitium of the inflamed mouse ear, and the ability to manipulate these cells in real-time by introducing blocking antibodies through a venous catheter. We show that this model is effective for tracking the movement of CD4 T cells in the dermis and for querying the mechanisms that govern this motility.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono i topi sono stati approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali dell'Università di Rochester, e condotte in stretta conformità con la legge sulla protezione degli animali e la politica Public Health Service su Humane cura e l'uso di animali da laboratorio amministrato dal National Institutes della Salute, Ufficio di laboratorio Animal Welfare.

1. Preparazione di cellule effettrici T CD4

NOTA: BALB / c topi DO11.10 TCR-transgenici che riconoscono specificamente un peptide da ovalbumina uovo di gallina (POVA: ISQAVHAAHAEINEAGR). Altri sistemi di TCR-transgenici possono essere sostituiti, con il peptide cognate appropriata al posto di POVA dove indicato.

1. Purificare cellule T CD4 naive
   1. Eutanasia un 6-8 settimane di età femminile / c del mouse DO11.10 BALB esponendolo alla 2 L / min CO ₂ fino a quando il mouse non mostra segni di movimento o di respirazione per 1 min, seguita da dislocazione cervicale, o in relazione allale linee guida della Commissione istituzionale cura degli animali e uso locale. Spruzzare il mouse con una soluzione di etanolo al 70% e fare un'incisione circa 7 cm di pelle dal mento del topo a 2/3 della discesa dell'addome. Rendere 2-3 incisioni cm pelle dall'estremità dell'incisione nell'addome verso i piedi posteriori. Fare attenzione a non tagliare nel peritoneo.
   2. separare con cura la pelle dal peritoneo tirando delicatamente con una pinza. I linfonodi inguinali si trovano sulla pelle vicino alla giunzione delle zampe posteriori con il corpo. Togliere afferrando e tirando con una pinza e posto in 8 ml di HBSS integrate con il 2% di siero di vitello neonato (NCS).
   3. Raccogliere le ascellari e linfatici brachiale nodi dal mouse afferrando e tirando delicatamente con una pinza. Mettere in HBSS + 2% NCS con i linfonodi inguinali.
   4. Raccogliere i linfonodi cervicali profondi e superficiali situate nel collo del mouse con una pinza e posto in HBSS + 2% NCS con l'oti suoi linfonodi.
   5. Delicatamente tagliare nel peritoneo, facendo attenzione a non tagliare nell'intestino. Afferrare il cieco e del colon con una pinza ed esporre i linfonodi mesenterici che si trovano proprio lungo il colon. Rimuovere con attenzione i linfonodi mesenterici con una pinza e posizionare con gli altri linfonodi.
   6. Individuare la milza nella cavità peritoneale e rimuovere con cautela, tenendola con una pinza e taglio del tessuto connettivo via con un paio di forbici chirurgiche. Posizionare la milza con linfonodi.
   7. Preparare una sospensione di cellule singole versando i + 2% NCS HBSS contenenti i milza e nei linfonodi in un colino di metallo collocato in un piatto di coltura di 60 x 15 mm. schiacciare delicatamente i milza e nei linfonodi attraverso il filtro metallico con lo stantuffo di una siringa da 10 ml in HBSS + 2% NCS.
   8. Utilizzando una pipetta, spostare la sospensione cellulare in un tubo da 50 ml centrifuga pulita. Lavare il filtro in metallo e piatto di cultura, con altri 10 ml di HBSS + 2% NCS, ucantare una pipetta e posizionare questa soluzione nello stesso 50 ml provetta da centrifuga come sospensione cellulare.
   9. Spin le cellule a 600 xg per 5 minuti per agglomerare le cellule e risospendere in 10 ml di HBSS + 2% NCS pipettando delicatamente. Salvo diversa indicazione, tutti centrifugazione deve essere eseguita a 600 xg per 5 min.
   10. Diluire 10 ml di sospensione cellulare in 90 ml di 0,1% trypan blu in PBS per una diluizione 1:10. Trasferire 10 ml di cellule in trypan blu su un emocitometro pipettando la soluzione nella scanalatura sul bordo del emocitometro. Contare le cellule bianche del sangue nella griglia centro del emocitometro, ignorando gli eritrociti che appaiono come leggermente più piccolo, rotondo, globuli rossi-color e blu morti / cellule morenti. Moltiplicare il numero di cellule contate da 10 ^4, per il fattore di diluizione (10), e il volume delle celle (10 ml) per determinare il numero totale di cellule raccolte nella provetta da centrifuga da 50 ml.
   11. Per arricchire di cellule T CD4, centrifugare lacelle a pellet e risospendere le cellule a 2x10 ⁷ cellule / ml in una soluzione contenente circa 1 ug / ml di anti-CD8 (clone 3.155), 1 mg / ml di anti-MHC di classe II (clone M5 / 114), e 1 mg / ml di anti-CD24 (clone) J11d anticorpi in HBSS + 2% NCS pipettando delicatamente.
       NOTA: Gli anticorpi utilizzati in questa fase sono derivati ​​in-house da linee cellulari di ibridoma e le concentrazioni sono approssimate. La concentrazione e il volume di questi anticorpi ideali per complemento lisi sono stati determinati empiricamente e varieranno tra laboratori. In alternativa, diversi kit disponibili in commercio sono disponibili per la purificazione delle cellule CD4 T naive e possono essere sostituiti per la lisi del complemento e processo di purificazione CD62L + qui rappresentata. Se si utilizza un altro metodo per purificare le cellule CD4 T naive, questo protocollo può essere continuata a partire dal punto 1.2.
   12. Incubare in ghiaccio per 30 min. Alla fine di questa incubazione, rapidamente scongelare complemento di cavia mettendo a 37 ° C dell'acqua bath per circa 2 min. Aggiungere 100 ml di complemento per ogni 1 ml di cellule in soluzione di anticorpo pipettando complemento direttamente nella sospensione cellulare. Incubare le cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C per 30 min.
   13. Aggiungere HBSS + 2% NCS per portare le cellule ad un volume totale di 20 ml in provetta da centrifuga. Strato in 8 ml di RT supporti densità centrifugazione (densità 1,086 g / ml) sotto le cellule. centrifugare immediatamente le cellule a 1400 xg a temperatura ambiente per 15 minuti con il freno centrifuga off.
   14. Raccogliere le cellule a livello di interfaccia utilizzando un sierologici cellule pipetta e trasferire in un nuovo tubo da 50 ml centrifuga. Lavare le cellule portando il volume nella provetta da centrifuga da 50 ml con HBSS + 2% NCS e centrifugazione.
   15. Risospendere le cellule in tampone MACS (PBS integrato con il 2% NCS e 2 mm EDTA) pipettando delicatamente e contare come in precedenza, al punto 1.1.10.
   16. Per arricchire di cellule T CD4 naive, sospendere nuovamente le cellule a 2x10 ⁷ cellule / ml in una soluzionedi 2,5 ug / ml biotina-coniugato anticorpo anti-CD62L in tampone MACS, in base al numero contato nel passaggio 1.1.16. Incubare per 30 minuti in ghiaccio.
   17. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml MACS buffer, centrifugazione le cellule. Risospendere le cellule a 10 ⁷ cellule / 100 microlitri di tampone MACS e aggiungere perline separazione magnetica streptavidina coniugata ad una diluizione 1:10 direttamente alle cellule. Incubare in ghiaccio per 20 min.
   18. Lavare le cellule come prima, nel passaggio 1.1.17, e risospendere le cellule a 2x10 ⁸ cellule / ml in tampone MACS, in un volume minimo di 500 microlitri.
   19. Inserire una colonna di separazione magnetica nel supporto del magnete e lavare la colonna lasciando 3 ml MACS buffer di fluire attraverso. Applicare le cellule per la colonna con una pipetta.
   20. Lavare la colonna per rimuovere le cellule non vincolati dalla colonna magnetica pipettando 3 ml MACS tampone sulla colonna e permettendo il buffer MACS di fluire attraverso, e ripetere per 3 volte. Gettare il flusso attraverso frazione.
   21. Remove la colonna dal supporto magnetico e rinviare un nuovo tubo da 50 ml centrifuga. Pipettare 5 ml di tampone MACS nella colonna e utilizzare lo stantuffo in dotazione con la colonna per spingere i MACS tampone attraverso la colonna per liberare le celle della colonna legato e raccogliere il flusso attraverso che contiene le cellule T CD4 naive arricchito.
   22. Centrifugare le cellule e risospendere in 10 ml RPMI supplementato con 10% siero fetale di vitello (FCS), 100 IU / ml penicillina, 100 ug / ml di streptomicina, 2 mM L-glutammina e 50 mM 2-mercaptoetanolo (RPMI-10). Contare le celle di prima, al punto 1.1.10.
   23. Regolare la concentrazione finale delle cellule T CD4 naive a 6x10 ⁵ / ml in RPMI-10.
2. Purificare T-cellule impoverito APC milza
   1. Euthanize un 6-8 settimane di età femminile wild-type BALB / c del mouse come al punto 1.1.1.
   2. Spruzzare il mouse con una soluzione di etanolo al 70% ed esporre la milza facendo un'incisione di circa 3 cm sul lato sinistro della abdome del topon. Taglio aperto lo strato peritoneale e rimuovere la milza afferrandola delicatamente con una pinza e taglio via dal tessuto connettivo sottostante con un paio di forbici chirurgiche.
   3. Posizionare la milza in 8 ml di HBSS + 2% NCS.
   4. Preparare una sospensione di cellule singole schiacciando milza, lavare e contare le cellule, come prima, in passi 1.1.7-1.1.10
   5. Deplezione delle cellule T dal giro delle cellule a 600 xg per 5 min a pellet, e risospendere le cellule a 2x10 ⁷ in una soluzione di circa 1 mg / ml anticorpo anti-Thy1.2 (J1J clone) pipettando delicatamente. Incubare le cellule in ghiaccio per 30 min.
      NOTA: L'anticorpo è stato derivato in-house da una linea cellulare di ibridomi e la concentraton è approssimata. La concentrazione e il volume di questo anticorpo ideale per complemento lisi è stato determinato empiricamente e varieranno tra laboratori. Altri metodi per APC di purificazione da splenociti possono essere sostituiti se lo si desidera. le cellule T naive e APC devono essere preparati in cultoure dal punto 1.3.
   6. Aggiungere complemento cavia, incubare, e separare le cellule su un supporto gradiente di densità centrifugazione come prima, nei passaggi 1.1.13-1.1.14.
   7. Risospendere le cellule in 10 ml di RPMI-10 e irradiare le APC ponendo le cellule in una provetta da centrifuga da 50 ml in un irradiatore gamma per una lunghezza di tempo che esporre le cellule a 25 Gy radiazioni. Questo periodo di tempo può variare in base alla irradiatore e dovrà essere calcolato ogni volta che le cellule sono irradiate.
   8. Contare le cellule su un emocitometro come prima, nel passaggio 1.1.10, e regolare le cellule APC ad una concentrazione finale di 2.4x10 ⁶ cellule / ml in RPMI-10.
3. Stimolare le cellule e differenziare le cellule T CD4 ad un fenotipo Th1 in una cultura di 5 giorni.
   NOTA: Anche se vi presentiamo qui un protocollo per la preparazione e l'imaging effettori Th1 generati dalle cellule CD4 T naive, questo protocollo può essere regolato per differenziare le cellule naive ad un fenotipo diverso, o to utilizzare altri tipi di cellule, come le cellule T CD8. Condizioni per priming e differenziazione dovranno essere determinati empiricamente.
   1. In ogni pozzetto di un piatto della cultura 24 pozzetti, unire 500 ml di cellule CD4 T naive e 500 l di APC irradiati in ogni pozzetto, per un totale di 3x10 ⁵ cellule T e 1.2x10 ⁶ APC per bene.
   2. Preparare una soluzione in RPMI-10 contenente 2 mM cognate peptide OVA, 20 U / ml IL-2 ricombinante, 80 ug / ml di anti-IL-4 (clone 11B11) e 40 ng / ml ricombinante IL-12 e del filtro con un 0,2 Filtro siringa micron. Aggiungere 1 ml di questa soluzione in ogni pozzetto di cellule, per un volume totale di 2 ml in ciascun pozzetto.
   3. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° al 5% di CO ₂ per 3 giorni.
   4. Il giorno 3, dividere le culture pipettando delicatamente per risospendere le cellule e lo spostamento 1 ml di ogni bene in una nuova cultura bene. Portare ciascun pozzetto per un volume finale di 2 ml aggiungendo 1 ml / pozzetto di RPMI-10 + 20 U / ml IL-2 ricombinante.
   5. Riportare le piastre per l'incubatore e permettono alle cellule di espandersi fino al giorno 5.

2. Il trasferimento di cellule e induzione di infiammazione

NOTA: per il numero di cellule ottimali per l'imaging, 5x10 ⁶ cellule Th1 fluorescente dovrebbero essere trasferiti in ogni mouse in un volume totale di 200 microlitri di PBS. Le cellule qui sono etichettati con il CFSE colorante verde o la tintura CMTMR quasi rosso, anche se altri coloranti Tracker cellulare può essere utilizzato. CFSE e le cellule CMTMR-etichettati possono essere co-trasferite per consentire il monitoraggio di due popolazioni distinte CD4 effettrici.

1. Le cellule T effettrici Etichetta con CFSE
   1. Raccogliere le cellule dai piatti della cultura vigorosamente pipettando le cellule in ciascun pozzetto e trasferimento in un tubo da 50 ml centrifuga sterile con una pipetta. Contare le cellule come al punto 1.1.10, quindi centrifugare e risospendere le cellule a 10 ⁷ cellule / ml in PBS + 5% NCS.
   2. Diluire 5 mM soluzione madre CFSE 1: 100 inPBS. Aggiungere 110 microlitri soluzione CFSE per ogni 1 ml di cellule mettendo una goccia di soluzione CFSE sul lato del tubo e poi rapidamente dondolo tubo avanti e indietro per mescolare completamente.
   3. Incubare le cellule per 5 min a temperatura ambiente, quindi spegnere il CFSE aggiungendo 5 ml di siero fetale di vitello (FCS) direttamente al tubo di cellule. Portare al volume di 50 ml con PBS + 5% NCS.
   4. Centrifugare le cellule e risospendere il pellet in 20 ml di PBS + 5% NCS. Ripetere questa operazione altre due volte per lavare le cellule 3 volte totale. Contare le cellule su un emocitometro, come prima, nel passaggio 1.1.10, e risospendere le cellule in PBS sterile a 2.5 x 10 ⁷ cellule / ml per il trasferimento in topi.
2. Le cellule T effettrici Etichetta con CMTMR
   1. Raccogliere le cellule come sopra al punto 2.1.1, poi contare, centrifugare e risospendere le cellule a 10 ⁷ cellule / ml in RPMI-10.
   2. Aggiungere 10 mM soluzione stock CMTMR direttamente alle cellule per una concentrazione finale di 10 pM. esimo rapidamente pipettae cellule per mescolare completamente nel CMTMR e impediscono la precipitazione del colorante.
   3. Incubare 30 min in un bagno d'acqua C 37 °. Lavare le cellule 3x in PBS + 5% NCS come prima, al punto 2.1.3-2.1.4. Contare e risospendere le cellule in PBS sterile a 2.5x10 ⁷ cellule / ml per il trasferimento a topi.
3. cellule T effettrici di trasferimento per Naïve 6-8 settimane di età femminile topi BALB / c.
   1. Tracciare la sospensione cellulare (fase 2.1.4 o 2.2.3) in una siringa, avendo cura di rimuovere tutte le bolle tenendo la siringa side-up, muovendo delicatamente il lato della siringa e spostando il pistone su e giù, se necessario .
   2. Mettere i topi in una gabbia pulita e il calore dolcemente sotto una lampada di calore fino a quando la vena della coda appare vasodilated. Posizionare il mouse in un dispositivo di ritenuta e pulire la coda con un tampone imbevuto di alcool. Iniettare lentamente 200 ml di sospensione cellulare nella vena della coda laterale. Non ci dovrebbe essere nessuna resistenza a iniezione o immissione visibile sotto la pelle.
4. Indurre l'infiammazione cutanea immunizzando con adiuvante completo di Freund (CFA)
   NOTA: In questo protocollo, l'infiammazione è indotta da iniezione intradermica di CFA emulsionato con l'antigene o affine o non cognate. Altri modelli infiammatori possono essere sostituiti, anche se sarà necessario regolare empiricamente il numero di cellule necessario per il trasferimento e la tempistica di imaging.
   1. Preparare una soluzione 200 micron di OVA peptide in PBS sterile in una provetta. Pipettare un volume equivalente di CFA in cima alla soluzione peptide.
   2. Emulsionare la soluzione disegnando in un 28 G1 / 2 di insulina siringa e poi precipitare la soluzione nella provetta, quindi ripetendo questa azione di circa 20 volte. Quando è completamente emulsionato, la CFA e soluzione peptide formeranno un impasto denso e opaco.
      NOTA: è indispensabile utilizzare una siringa con ago fisso insulina per formare l'emulsione, come l'emulsione verrà perso nel spazio morto in un needl non fissae siringa.
   3. Testare l'emulsione facendo cadere una piccola quantità su acqua posto in una capsula di Petri. L'emulsione deve rimanere intatto e non disperdere in acqua.
   4. Disegnare l'emulsione in un 300 ml 28 G1 / 2 siringa da insulina e premere bruscamente lo stantuffo per rimuovere grosse bolle d'aria.
   5. Subito dopo il trasferimento di fluorescente cellule T effettrici, anestetizzare i topi mediante iniezione ip di 2,2,2-tribromoethanol a 240 mg / kg. Valutare l'anestesia da un pizzico punta dolce, la somministrazione di più 2,2,2-tribromoethanol con incrementi di 1 mg, se necessario.
      NOTA: altri anestetici approvati può essere sostituito per l'2,2,2-tribromoethanol.
   6. Collocare un ditale sul dito indice sinistro e afferrare attenzione orecchio del mouse tra il pollice sinistro e l'indice con l'orecchio ventrale rivolto verso l'alto. Assicurarsi di non esercitare una pressione eccessiva su un orecchio, che può causare danni meccanici alla pelle.
   7. Far scorrere l'ago che contiene il CFA emulsion nel derma, lato smusso rivolto verso l'alto, e iniettare lentamente 10 ml di emulsione nell'orecchio. Posizionamento del iniezione deve essere in esterna 1/3 del padiglione auricolare, leggermente fuori centro per consentire l'imaging ottimale.
   8. Monitorare i topi fino a quando l'anestesia ha portato fuori e topi sono in grado di destra se stessi e sono ambulatoriale. topi Immagine 3 giorni seguenti la vaccinazione, fornendo il tempo per l'infiammazione di sviluppare e le cellule T trasferite al traffico al derma per le orecchie.
      NOTA: I topi non possono essere lasciati incustoditi in qualsiasi momento mentre sotto anestesia.

3. Preparazione del mouse for Imaging

1. Preparare un catetere
   1. Rimuovere con attenzione l'ago di metallo da 30 G1 / 2 tubercolinico (TB) ago della siringa con una pinza e pulire la colla in eccesso, utilizzando un ambito dissezione di visualizzare che la colla è completamente rimosso.
   2. Tagliare la punta di un altro / 2 TB ago della siringa 30 G1, assicurando che l'ago rimanente è ancora patent mediante ispezione visiva. Infilare un pezzo 18 cm di PE-10 tubo medico sull'ago rifilato, e con attenzione inserire l'ago di metallo nudo circa 5 mm nell'altra estremità del tubo, creando un catetere.
2. Lavare il catetere compilando un TB siringa da 1 ml con PBS sterile, rimuovendo eventuali bolle d'aria. Posizionare delicatamente il catetere sulla punta della siringa e spingere delicatamente PBS se il catetere per eliminare le bolle nel tubo.
   NOTA: quando si spinge il fluido attraverso il catetere, è essenziale per mantenere il catetere sulla siringa per evitare che la pressione del fluido di spingere il catetere fuori della siringa.
3. Mettere i topi in una gabbia pulita e il calore dolcemente sotto una lampada di calore fino a quando la vena della coda appare vasodilated. Anestetizzare il mouse con una miscela di aria ambiente e isoflurano (5% induzione, 1-2% manutenzione, a 2 L / min di portata), erogata attraverso il gruppo nosecone che sono stati associati al vaporizzatore isoflurano. Assicurarsi che il mouse è anestetizzato with un pizzico punta dolce. Aumentare in misura apprezzabile la portata isoflurano dello 0,1% se si osserva il movimento. Coprire gli occhi con pomata oftalmica per prevenire l'essiccazione e lesioni mentre il mouse è anestetizzato.
   NOTA: E 'essenziale che i topi mai essere lasciati incustoditi durante anestetizzato. I topi deve essere frequentemente monitorato per l'anestesia sufficienti per gentile pizzico punta.
4. Immobilizzare la coda alla base con un paio di pinze, e quindi pulire la coda con un tampone imbevuto di alcool. Far scorrere delicatamente il catetere nella vena della coda laterale e controllare la pervietà spingendo delicatamente lo stantuffo della siringa. Non ci dovrebbe essere alcuna resistenza al movimento e non spumeggiante visibile di PBS sotto la pelle, se è opportunamente collocato. Fissare il catetere alla coda applicando 1-2 gocce di tessuto adesivo cianoacrilato al sito di iniezione e lasciare asciugare, di circa 30 sec.
5. Rifilare con cura i capelli dalla parte posteriore e laterale dell'orecchio con un paio di forbici, facendo attenzione a non danneggiare la ska. Tagliare i baffi pure. Usando un tampone di cotone, inumidire la superficie interna dell'orecchio con PBS.
6. Ruotare il mouse e orecchio su un 24 x 50 mm copertura in vetro No. 1.5 slittamento. Utilizzando pinze, appiattire delicatamente l'orecchio sul vetrino, spostando il mouse, se necessario per garantire che l'orecchio è a filo con il vetro. Rimuovere l'eccesso di PBS dall'orecchio tamponando delicatamente con un tessuto wipe.
   NOTA: Assicurarsi di non premere troppo saldamente sull'orecchio, come la pelle sottile può essere facilmente danneggiato con una pressione eccessiva.
7. Utilizzando due coppie di pinze curve, afferrare un lungo circa 20 mm pezzo di nastro adesivo in tessuto longitudinalmente negli angoli superiori. Posizionare la parte inferiore del nastro sul vetrino in cima dell'orecchio del mouse e ruotare il nastro sul resto dell'orecchio, spingendo i capelli in eccesso fuori strada con la pinza se necessario apporre l'orecchio alla coprioggetto. Premere delicatamente sul nastro intorno all'orecchio con un batuffolo di cotone asciutto per garantire una perfetta tenuta, facendo attenzione a non premere sul orecchio stesso.
8. Fissare la piattaforma di imaging ad un 37 ° C blocco riscaldante con nastro adesivo. Applicare grasso vuoto su entrambi i lati della zona dell'orecchio della piattaforma di imaging. Ruotare il mouse per posizionare il coprioggetto sulla piattaforma di imaging, facendo attenzione ad allineare l'orecchio al centro del feltro.
   NOTA: evitare di ottenere grasso per vuoto sul nastro, come questo farà sì che a venire staccato dal vetrino di vetro.
9. Far scattare il nosecone isoflurano nel supporto sulla piattaforma di imaging, assicurando che la nosecone è sicuro e che copre completamente il naso del mouse. Stendere il grasso per vuoto sotto il vetrino premendo con fermezza ma con cautela il vetrino sulla piattaforma di imaging con un tampone di cotone asciutto e pulito.
10. Fissare il vetrino alla piattaforma con due 20 millimetri pezzi di nastro e due pezzi lunghi di nastro avvolto attorno alla porzione superiore della piattaforma. Se le bolle d'aria sono presenti tra l'orecchio e il coprioggetto, possono essere rimossi delicatamente premendo sull'orecchio dal basso with un pezzo di carta piegata.
    NOTA: E 'essenziale non usare carta troppo spessa o di premere con forza, in quanto ciò può causare il tessuto scottatura e danni, complicando risultati.
11. Muovi il mouse per palco microscopio e fissare la piattaforma con il nastro adesivo. Tubo un doppio strato di grasso per vuoto sul vetrino intorno all'orecchio per servire come serbatoio per l'obiettivo immersione in acqua.
12. Avvolgere un riscaldamento coperta piena d'acqua in tutto il mouse attraverso la piattaforma di imaging. Riempire il serbatoio con 37 ° C acqua distillata. Assicurarsi che tutto è fissato al palco con nastro adesivo e che la siringa del catetere è facilmente accessibile.

4. In Vivo Time-lapse imaging e per via endovenosa anticorpo Amministrazione

NOTA: Questo protocollo richiede l'uso di un microscopio multifotone dotato di Ti: Sa sistema laser. L'obiettivo utilizzato è una lente di ingrandimento 25x con 1,05 NA, apposto con un oggettoriscaldatore ive impostato a 40 ° C. La temperatura ottimale per questo riscaldatore è stato determinato empiricamente per essere la temperatura appropriata per mantenere il derma per le orecchie a 37 ° C, e può essere necessario un aggiustamento per l'uso in altri sistemi di imaging. Il software di acquisizione utilizzato può variare tra gli strumenti e le modifiche al protocollo può essere fatta funzionare su sistemi in modo diverso configurati. Assicurarsi che le immagini possono essere salvate in un formato che è compatibile con qualsiasi software di analisi desiderato.

1. Individuare il derma attraverso gli oculari posizionando l'obiettivo sopra il centro dell'orecchio e abbassando l'obiettivo solo fino a contatto con la superficie dell'acqua nel serbatoio. Uso di una sorgente luminosa esterna, guardare attraverso gli oculari e continuare ad abbassare lentamente all'obiettivo finché la superficie dell'orecchio è a fuoco. Abbassare le tende interne ed esterne in tutto il palco microscopio.
2. Determinare le impostazioni microscopio e individuare un'area per l'imaging
   1. prima Imaging, configurare il laser per l'eccitazione massima e la rilevazione dei fluorofori desiderati regolando la lunghezza d'onda del laser a 900 nm nella finestra MP controller laser, la potenza del laser nella impostazione di acquisizione: la finestra del laser, e le tensioni PMT nella finestra di acquisizione Image Control .
      NOTA: Questa procedura utilizza una lunghezza d'onda di eccitazione di 900 nm con filtri per rilevare generazione di seconda armonica (420-460 nm), CFSE (495-540 nm), e CMTMR (575-630 nm). Altre configurazioni possono essere utilizzati per rilevare differenti fluorofori come desiderato.
   2. Impostare il microscopio per la risoluzione di 512 x 512 pixel, con un tempo di sosta 2 msec / pixel nella impostazione di acquisizione: Windows Dimensione e modalità. Attivare una modalità di imaging dal vivo per permettere la scansione attraverso il tessuto per una superficie di immagine cliccando su "repeat XY". Idealmente, l'area dovrebbe essere relativamente uniforme, senza bolle d'aria, ed evitando aree di follicoli piliferi dense.
      NOTA: L'emulsione CFA è autofluorescenti brillantemente nel verde e necanali ar-rosso e deve essere evitato. Un campo ottimale può essere trovato solitamente circa 3 mm dal bordo della emulsione. Circa 10 - 100 cellule possono essere monitorati in una singola immagine. Se troppe cellule sono presenti, software di monitoraggio generalmente incontrano errori nel tentativo di separare le cellule strettamente situati, portando a tracce di cellule accorciato e / o inesatte.
   3. Una volta che un campo di imaging appropriata è stato localizzato, determinare la regione Z che verrà ripreso individuando la cellula "alto" nel derma, l'impostazione della Z-posizione a 0 facendo clic sul pulsante "Set 0", e scorrendo verso il basso nella Z direzione per misurare misura della profondità delle cellule. Una profondità di imaging di 35-75 micron è tipico. Impostare le posizioni di partenza e finale nella sezione Impostazione di acquisizione: la finestra microscopio. Regolare lo strumento tensioni PMT e potenza del laser nella finestra "luminosa Z" per ottimizzare la visualizzazione delle cellule tutta la profondità del campo dell'imaging.
      NOTA: Evitare di sollevare la laspotere er superiore ai 25 mW a campione, livelli di potenza più in alto può causare danni dovuti al calore e lesioni sterili al derma. Il livello di potenza massima appropriato per ogni microscopio varierà e dovrà essere misurata. Va notato che aumentando la potenza laser o tensioni PMT con la profondità del tessuto non consente confronto quantitativo di luminosità dell'immagine a diverse profondità di analisi post-acquisizione.
   4. Controllare i pulsanti "Time" "profondità" e sotto il pulsante "Scan" nella finestra di acquisizione del controllo Immagine. Impostare un filtro di Kalman per acquisire l'immagine 3 volte per riga nel Acquisizione di immagini di controllo: finestra Modalità filtro e regolare la profondità Z-fetta nell'acquisizione Image: Finestra microscopio in modo che ci vuole circa 1 minuto per catturare uno stack completo, come notato nella finestra TimeView.
      NOTA: L'intervallo tra pile non dovrebbe richiedere più di circa 1 minuto, come intervalli più lunghi impediscono il tracciamento delle cellule in rapida migrazione. A seconda the tipo di cellule essere ripreso, questo intervallo potrebbe essere necessario modificare per consentire il corretto tracciamento delle cellule dal software di analisi. Z-fette dovrebbero essere non più di 5 micron. Generalmente 15-18 Z-fette tra 2-5 micron di spessore sono appropriate per un intervallo di imaging 1 min.
3. Catturare un'immagine time-lapse pre-anticorpo
   1. Catturare un'immagine time-lapse 5 min della zona per valutare la stabilità del tessuto impostando il numero di ripetizioni di "5" nelle impostazioni di acquisizione: finestra TimeScan e facendo clic sul pulsante "Scan".
      NOTA: Tissue "drift" può essere causato non consentendo tempo sufficiente per l'orecchio per raggiungere l'equilibrio termico, scarsa preparazione orecchio, o può essere causa di drift locale in una regione dell'orecchio. Se l'immagine 5 min non è stabile, un'immagine nuova regione nel derma. Se una seconda immagine in una nuova regione rimane instabile, è meglio ripetere accuratamente la preparazione orecchio e l'imaging dal punto 3.6 con un COV frescaerslip.
   2. Se il tessuto è stabile l'immagine 5 min, raccogliere immagini time-lapse di 30-45 minuti impostando il numero di ripetizioni a tra 30 e 45 nella impostazione di acquisizione: finestra TimeScan, il monitoraggio di qualsiasi deriva tessuto minore come l'immagine è raccolto. Salvare il file in un formato che è compatibile con il software di analisi da utilizzare.
      NOTA: A questo punto il protocollo, i passi 4.2.2 - 4.3.2 può essere ripetuto per immagini più posizioni nello stesso orecchio. Un singolo mouse non dovrebbero essere tenuti anestetizzato per più di 4 ore, come la morte è più probabile che si verifichi.
4. Iniettare anticorpi bloccanti e acquisire un'immagine post-anticorpo.
   1. Disegnare la miscela di anticorpi in una siringa da 1 TB ml e rimuovere l'ago, avendo cura di rimuovere tutte le bolle d'aria. Premere il pistone in modo che la soluzione di anticorpi forma una "goccia" alla fine della siringa.
   2. Sollevare le tende attorno al palco e individuare il catetere. Rimuovere l'originale PBS-contasiringa ining dal catetere. Se non si imposta il catetere verso il basso, fissare con cura la nuova siringa contenente gli anticorpi. Tenere l'estremità del catetere sulla siringa e iniettare lentamente la miscela di anticorpi nel catetere. Assicurarsi che non vi è alcuna resistenza a iniezione.
   3. Impostare il catetere verso il basso e abbassare le tende che circondano il palco microscopio. Nota momento dell'iniezione e immediatamente iniziare a raccogliere una nuova sequenza di imaging 20-40 min nella stessa posizione utilizzando le stesse impostazioni dello strumento come immagine di pre-anticorpo. Salvare il file in un formato appropriato per il software di analisi da utilizzare.
      NOTA: tra le immagini time-lapse, osservare il mouse per l'anestesia e la respirazione sufficiente. Non è raccomandato per l'immagine più di un campo in seguito alla somministrazione di anticorpi, come ci possono essere tassi variabili di spazio dell'anticorpo.
5. Iniettare destrano fluorescenza marcata per individuare i vasi sanguigni, valutare la pervietà del catetere, e misurare bpermeabilità nave lood
   1. Preparare una soluzione / ml 2 mg di destrano fluorescente coniugato (70.000 MW) in 100 microlitri di PBS sterile e disegnare in una siringa, rimuovendo eventuali bolle d'aria.
   2. Utilizzando la stessa tecnica in fase 4.4.1-4.4.2, posizionare la siringa sul catetere e iniettare la soluzione destrano per via endovenosa.
   3. Catturare una singola pila a una risoluzione di 1024 x 1024 pixel per cambiare la risoluzione nelle impostazioni di acquisizione: finestra del modo, con le stesse impostazioni PMT e laser come per le immagini time-lapse. Per raccogliere l'immagine, deselezionare il pulsante "Time" sotto il pulsante "Scan", e quindi facendo clic sul pulsante "Scan". L'immagine 3D consentirà alle cellule T di esclusione situate nel sistema vascolare e dimostrare che il catetere era brevetti e inserito correttamente. La diffusione di destrano fluorescente su navi può anche essere utilizzato per valutare la permeabilità vascolare locale.
      NOTA: Questo ad alta risoluzione (1024 x 1024) immagine statica viene utilizzata per prfinalità esentazione e può essere inoltre essere utilizzati per l'analisi dell'architettura del tessuto nella stessa area delle immagini time-lapse. In alternativa, un'immagine di 512 x 512 può essere preso, che può essere fusa con i time-lapse immagini utilizzando il software di analisi delle immagini. Tempo lapse imaging dell'amministrazione destrano può desiderare, a seconda delle esigenze di ricerca dei singoli laboratori. In questo caso, l'immagine deve essere impostato come nei passaggi 4.2.3-4.3.2.
6. Dopo l'imaging è completato, rimuovere con attenzione il mouse da sotto l'obiettivo e scartare la coperta d'acqua. Rimuovere il vetrino dalla piattaforma di imaging per il taglio del nastro e delicatamente sollevare il bicchiere fino a quando non si stacca. Mentre il mouse è ancora anestetizzato, staccare l'orecchio dal vetrino. Se questo è essere una procedura terminale, eutanasia il topo per dislocazione cervicale. Se il risparmio questo mouse per ripetere l'imaging, è tornare a una gabbia pulita separato da altri topi e osservare fino a quando il mouse può diritto stesso ed èambulatoriale. Una volta recuperato da anestesia, il mouse può essere restituito a una gabbia con altri animali.
7. Importare i file di imaging in un programma di analisi di immagine ed eseguire qualche correzione desiderata. Si raccomanda di evitare di miglioramenti non lineari e programmi di riduzione del rumore di levigatura o automatizzati e algoritmi. Tipicamente, le immagini hanno bisogno solo di una correzione del fondo minore, aumentando manualmente il punto nero dell'immagine prima dell'analisi. Analizzare i dati di imaging utilizzando un programma di cellula-automatizzato di monitoraggio con correzione manuale, come in Overstreet, Gaylo et al ^30.
   NOTA: Ci sono molte suite di analisi delle immagini disponibili, di origine sia proprietarie e open, che possono essere utilizzati per quantificare le dinamiche cellulari dalle immagini multiphoton derivati ​​da questo protocollo. Il metodo per l'analisi delle immagini e dei pacchetti software ottimali da utilizzare dipenderà dalle esigenze di ricerca dei singoli laboratori.

Risultati

La possibilità di studiare le risposte immunitarie in loco senza alterare l'ambiente immunitario è essenziale per lo studio delle interazioni in tempo reale delle cellule T effettrici con un tessuto infiammato. Imaging del derma orecchie intatte di questo protocollo, descritto nella Figura 1A e B, permette la visualizzazione di trasferire cellule T effettrici fluorescente nell'interstizio cutanea. Questo permette sia ad alta risoluzion...

Discussione

Importanza

Qui vi presentiamo un protocollo completo per la visualizzazione 4D di, antigene-specifica effettrici cellule Th1 trasferiti nel derma per le orecchie del mouse intatti. Questo metodo fornisce vantaggi rispetto alcune modalità di imaging correnti per diversi motivi. Con l'imaging del derma orecchie ventrali, siamo in grado di rinunciare depilazione che è necessario per i protocolli di imaging che coinvolgono altri siti cutanei. Anche se per la depilazione sono gener...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mice	Jackson Laboratories	000651	Mice used were bred in-house
DO11.10 mice	Jackson Laboratories	003303	Mice used were bred in-house
HBSS	Fisher	10-013-CV	Multiple Equivalent
Newborn Calf Serum (NCS)	Thermo/HyClone	SH30118.03	Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes
Guinea Pig Complement	Cedarlane	CL-5000
anti-CD8 antibody	ATCC	3.155 (ATCC TIB-211)	Antibodies derived from  this hybridoma
anti-MHC Class II antibody	ATCC	M5/114.15.2 (ATCC TIB-120)	Antibodies derived from  this hybridoma
anti-CD24 antibody	ATCC	J11d.2 (ATCC TIB-183)	Antibodies derived from  this hybridoma
anti-Thy1.2 antibody	ATCC	J1j.10 (ATCC TIB-184)	Antibodies derived from  this hybridoma
Ficoll (Fico/Lite-LM)	Atlanta Biologicals	I40650
PBS	Fisher	21-040-CV	Multiple Equivalent
EDTA	Fisher	15323591
biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14)	BD	553149
streptavidin magnetic separation beads	Miltenyi	130-048-101
MACS LS Separation Column	Miltenyi	130-042-401
recombinant human IL-2	Peprotech	200-02
recombinant mouse IL-4	Peprotech	214-14
recombinant mouse IL-12	Peprotech	210-12
anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2)	eBioscience	16-7311-85
anti-IL-4 antibody (clone 11b11)	eBioscience	16-7041-85
RPMI	VWR	45000-412
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15303641
L-glutamine	Fisher	15323671
2-mercaptoethanol	Bio-Rad	161-0710
ovalbumin peptide	Biopeptide		ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo/HyClone	SV30014.03	Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes
24-well culture plate	LPS	3526	Multiple Equivalent
CFSE	Life Technologies	C34554
CMTMR	Life Technologies	C2927
28 G1/2 insulin syringes, 1ml	BD	329420
28 G1/2 insulin syringes, 300μl	BD	309301
27 G1/2 TB syringes, 1ml	BD	309623
30 G1/2 needles	BD	305106
PE-10 medical tubing	BD	427400
cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
heating plate	WPI	61830
Heating plate controller	WPI	ATC-2000
Water blanket controller	Gaymar	TP500	No longer in production, newer equivalent available
water blanket	Kent Scientific	TP3E
Isoflurane vaporizer	LEI Medical	Isotec 4	No longer in production, newer equivalent available
isoflurane	Henry Schein		Ordered through Veterinary staff
microcentrifuge tubes	VWR	20170-038	Multiple Equivalent
medical tape	3M	1538-0
isoflurane nosecone			Built In-house, see Fig 2
imaging platform			Built In-house, see Fig 2
curved forceps	WPI	15915-G	Multiple Equivalent
scissors	Roboz	RS-6802	Multiple Equivalent
glass coverslips	VWR		Multiple Equivalent
high vacuum grease	Fisher	146355D
cotton swabs			Multiple Equivalent
delicate task wipes	Fisher	34155	Multiple Equivalent
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Olympus		call for quote
optical table with vibration control	Newport		call for quote
25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging	Olympus	XLPLN25XWMP2
objective heater	Bioptechs	PN 150815
Detection filter cube	Olympus	FV10-MRVGR/XR	Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics
anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1)	eBioscience	16-0291-85	Azide free, low endotoxin
anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3)	eBioscience	16-0611-82	Azide free, low endotoxin
Texas Red Dextran (70,000 MW)	Life Technologies	D-1830