Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

Résumé

Les mécanismes qui régissent la motilité interstitielle des cellules CD4 T effecteurs aux sites d'inflammation sont relativement peu connus. Nous présentons une approche non invasive pour visualiser et manipuler dans des cellules in vitro -primed T CD4 dans le derme de l' oreille enflammée, ce qui permet pour l' étude du comportement dynamique de ces cellules in situ.

Résumé

La capacité des cellules T CD4 à exercer des fonctions effectrices dépend de la migration rapide et efficace de ces cellules dans les tissus périphériques enflammés par un mécanisme non encore défini. L'application de la microscopie multiphotonique à l'étude du système immunitaire fournit un outil pour mesurer la dynamique des réponses immunitaires dans les tissus intacts. Nous présentons ici un protocole pour l'imagerie multiphotonique intravitale non-invasif des cellules T CD4 dans le derme inflammation de l'oreille de la souris. Utilisation d'une plate-forme d'imagerie personnalisée et un cathéter veineux permet la visualisation de la dynamique des cellules T CD4 dans l'interstitium cutanée, avec la possibilité d'interroger ces cellules en temps réel par l'ajout d'anticorps bloquants à des composants moléculaires clés impliqués dans la motilité. Ce système offre des avantages sur les deux modèles in vitro et des procédures d'imagerie chirurgicale invasive. Comprendre les voies utilisées par les cellules T CD4 pour la motilité peut finalement donner un aperçu des basic fonction des lymphocytes T CD4 ainsi que la pathogenèse de maladies auto-immunes et les pathologies des infections chroniques.

Introduction

The effector function of CD4 T cells is critically dependent on their ability to rapidly enter and traverse a wide variety of peripheral tissues to survey for damage, locate foci of infection, or cause pathology from chronic infection or autoimmunity. While the processes of homing to inflamed sites^1-4 and extravasation^5-7 from the vasculature into tissues have been well-characterized, the factors that drive and regulate the interstitial motility of T cells remain undefined. The migration of T cells in complex 3D environments has been studied in vitro through the use of artificial matrices^8-10 or microfluidic devices^11,12, but these fail to recapitulate the complex and dynamic environment of an in vivo system. It is only recently, with the advent of high-resolution multi-color intravital imaging that it has become possible to study the dynamic behavior of immune cells in situ, allowing for a better understanding of intact immune responses.

Over a decade ago, several influential studies were published that first utilized multiphoton microscopy to address immunological questions. Early studies focused on the behavior of immune cells within explanted lymphoid organs^13-16, which were soon followed by techniques to image exposed lymph nodes in anesthetized mice¹⁷. Imaging allowed for new fundamental observations about the stages of lymph node priming of T cells¹⁸, the mechanisms by which T cells migrate in secondary lymphoid organs¹⁹, T cell interactions with other immune cells^20,21, and dynamic T cell positioning within the lymph node²². Although many early studies focused on lymph node dynamics, intravital imaging has been since been utilized to image the immune response in many peripheral tissues, including the brain^23-25, liver²⁶, lung²⁷, and skin^28-30.

The mouse ear dermis is particularly well poised for imaging, due to the thinness of ear skin, a relative lack of hair, and the ease with which it can be isolated from respiratory movements³¹. Indeed, the ear dermis has been used to image the interstitial behavior of dendritic cells^32,33, T cells^28,29,34,35, and neutrophils^36,37, and is a well-established site for studying dermal inflammation. Increasingly, non-invasive procedures have been replacing surgical preparations of the skin, including split dermis^38,39, flank^39,40, or dorsal skin flap window^39,41 models, that can induce changes to the local inflammatory milieu. The use of transferred, in vitro-primed, antigen-specific CD4 effector T cells allows for the study of a homogenous population of cells in the context of a dermal inflammatory response³⁰. Here we describe a non-invasive imaging procedure that allows for the visualization of antigen-specific effector CD4 T cells in the dermal interstitium of the inflamed mouse ear, and the ability to manipulate these cells in real-time by introducing blocking antibodies through a venous catheter. We show that this model is effective for tracking the movement of CD4 T cells in the dermis and for querying the mechanisms that govern this motility.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des souris ont été approuvées par le soin et l'utilisation Commission institutionnelle animale de l'Université de Rochester, et réalisées en stricte conformité avec la Loi sur la protection des animaux et de la Politique sur les services de santé publique sur Humane soin et l'utilisation des animaux de laboratoire administré par le National Institutes de la Santé, Bureau de la protection des animaux de laboratoire.

1. Préparation des effecteurs T CD4 cellules

NOTE: BALB / c TCR transgénique DO11.10 souris qui reconnaissent spécifiquement un peptide à partir d'ovalbumine d'oeuf de poulet (POVA: ISQAVHAAHAEINEAGR). D'autres systèmes TCR-transgéniques peuvent être substitués, en utilisant le peptide apparenté approprié à la place de POVA l'endroit indiqué.

1. Purifier les cellules T CD4 naïfs
   1. Euthanasier un 6-8 week-vieille femelle DO11.10 souris BALB / c en exposant à 2 L / min CO ₂ jusqu'à ce que la souris ne montre aucun signe de mouvement ou de la respiration pendant 1 min, suivie par dislocation cervicale, ou en fonction de lales lignes directrices du comité institutionnel de protection et de l'utilisation des animaux locaux. Pulvériser la souris avec une solution d'éthanol à 70% et de faire une incision cm environ 7 dans la peau du menton de la souris à 2/3 du chemin vers le bas de l'abdomen. Faire 2-3 cm incisions de la peau de l'extrémité de l'incision dans l'abdomen vers les pieds arrière. Veillez à ne pas couper dans le péritoine.
   2. Séparez délicatement la peau du péritoine en tirant doucement avec une pince. Les ganglions lymphatiques inguinaux sont situés sur la peau près de la jonction des pattes arrière avec le corps. Retirer en saisissant et en tirant avec une pince et dans 8 ml de HBSS additionné de 2% de sérum de veau nouveau-né (NCS).
   3. Récolter les axillaires et les ganglions brachial nœuds de la souris en saisissant et en tirant doucement avec une pince. Placer dans le HBSS + 2% de NCS avec les ganglions lymphatiques inguinaux.
   4. Récolter les ganglions lymphatiques cervicaux profonds et superficiels situés dans le cou de la souris avec des pinces et les placer dans le HBSS + 2% NCS avec le otses ganglions lymphatiques.
   5. couper délicatement dans le péritoine, en prenant soin de ne pas couper dans les intestins. Saisir le caecum et le côlon avec une pince et d'exposer les ganglions lymphatiques mésentériques qui sont situés tout le long du côlon. Retirez délicatement les ganglions lymphatiques mésentériques avec une pince et placer avec les autres ganglions lymphatiques.
   6. Localisez la rate dans la cavité péritonéale et retirez avec précaution, en tenant avec une pince et coupe le tissu conjonctif loin avec une paire de ciseaux chirurgicaux. Placer la rate avec les ganglions lymphatiques.
   7. Préparer une suspension cellulaire unique en versant le HBSS + 2% NCS contenant les ganglions lymphatiques et la rate dans une passoire métallique placée dans une boîte de culture de 60 x 15 mm. écraser légèrement les ganglions lymphatiques et la rate à travers le tamis métallique avec le piston d'une seringue de 10 ml dans le HBSS + 2% de NCS.
   8. En utilisant une pipette, la suspension de cellules dans un 50 ml tube de centrifugeuse propre. Rincer le tamis métallique et la boîte de culture avec 10 ml supplémentaires de HBSS + 2% de NCS, uchanter une pipette, et introduire cette solution dans le même 50 ml tube de centrifugeuse de la suspension cellulaire.
   9. Faites tourner les cellules à 600 xg pendant 5 min pour sédimenter les cellules et remettre en suspension dans 10 ml de HBSS + 2% NCS par pipetage. Sauf indication contraire, toute centrifugation doit être effectuée à 600 xg pendant 5 min.
   10. Diluer 10 ul de la suspension cellulaire dans 90 ul de 0,1% de bleu trypan dans du PBS pour une dilution de 1:10. Introduire 10 pi de cellules en bleu Trypan sur un hémocytomètre par pipetage de la solution dans la rainure au niveau du bord de l'hémocytomètre. Compter le nombre de globules blancs dans la grille centrale du hémocytomètre, en ignorant les globules rouges qui apparaissent comme étant légèrement plus petit, rond, les globules rouges teintes bleues et les cellules mortes / mourantes. Multiplier le nombre de cellules comptées par 10 ^4, par le facteur de dilution (10), et par le volume des cellules (10 ml) pour déterminer le nombre total de cellules récupérées dans le tube de centrifugation de 50 ml.
   11. Pour enrichir les cellules T CD4, centrifuger ledes cellules de pastilles, et remettre en suspension les cellules à 2x10 ⁷ cellules / ml dans une solution contenant environ 1 pg / ml d' anticorps anti-CD8 (clone 3,155), 1 pg / ml d' anticorps anti-CMH de classe II (clone M5 / 114), et 1 pg / ml anti-CD24 (clone J11d) anticorps dans HBSS + 2% NCS par pipetage.
       REMARQUE: Les anticorps utilisés dans cette étape sont dérivées en interne à partir de lignées cellulaires d'hybridome et les concentrations sont approchées. La concentration et le volume de ces anticorps idéales pour la lyse du complément ont été déterminées empiriquement et varient entre les laboratoires. En variante, plusieurs kits disponibles dans le commerce sont disponibles pour la purification des cellules T CD4 + naïves et peuvent être substituées à la lyse du complément et de purification CD62L + représentés ici. Si vous utilisez une autre méthode pour purifier les cellules T CD4 naïfs, ce protocole peut être poursuivi à l'étape 1.2.
   12. Incuber sur la glace pendant 30 min. A la fin de cette incubation, décongeler rapidement Guinée complément de porc en plaçant dans un 37 ° C l'eau bath pendant environ 2 min. Ajouter 100 ul de complément pour chaque 1 ml de cellules dans la solution d'anticorps par pipetage le complément directement dans la suspension cellulaire. Incuber les cellules dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 min.
   13. Ajouter HBSS + 2% de NCS pour amener les cellules à un volume total de 20 ml dans le tube de centrifugation. Couche dans 8 ml de RT milieu de centrifugation de densité (densité 1,086 g / ml) au-dessous des cellules. centrifuger immédiatement les cellules à 1400 x g à température ambiante pendant 15 min avec le frein centrifuge hors tension.
   14. Recueillir les cellules à l'interface à l'aide d'une pipette les cellules de transfert et sérologiques à un nouveau 50 ml tube de centrifugation. Laver les cellules en amenant le volume dans le tube à centrifuger de 50 ml avec du HBSS + 2% de NCS et la centrifugation.
   15. Resuspendre les cellules dans un tampon MACS (PBS supplémenté avec 2% NCS et 2 mM EDTA) par pipetage et compter comme précédemment, à l'étape 1.1.10.
   16. Pour enrichir les cellules T CD4 naïfs, remettre les cellules à 2x10 ⁷ cellules / ml dans une solutionde 2,5 pg / ml de biotine conjugué à un anticorps anti-CD62L dans un tampon MACS, sur la base du nombre compté à l'étape 01.01.16. Incuber pendant 30 min sur la glace.
   17. Laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon MACS, puis centrifuger les cellules. Remettre en suspension les cellules à 10 ⁷ cellules / 100 ul dans un tampon MACS et ajouter des perles de séparation magnétique streptavidine conjuguée à une dilution 1:10 directement aux cellules. Incuber sur la glace pendant 20 min.
   18. Laver les cellules comme précédemment, à l' étape 01/01/17, et remettre en suspension les cellules à 2x10 ⁸ cellules / ml dans un tampon MACS, dans un volume minimum de 500 ul.
   19. Placer une colonne de séparation magnétique dans le support d'aimant et laver la colonne en laissant le tampon MACS 3 ml traverser. Appliquer les cellules de la colonne avec une pipette.
   20. Laver la colonne pour éliminer les cellules non liées par la colonne magnétique par pipetage 3 ml MACS tampon sur la colonne et permettant le tampon MACS de circuler à travers, et répéter 3 fois. Jeter l'écoulement à travers la fraction.
   21. Remove la colonne du support magnétique et maintenez sur un nouveau 50 ml tube de centrifugeuse. Pipet 5 ml de tampon MACS sur la colonne et utiliser le piston joint à la colonne pour pousser les MACS tampon à travers la colonne pour libérer les cellules de la colonne liée et de recueillir l'écoulement à travers qui contient les cellules T CD4 naïfs enrichis.
   22. Centrifuger les cellules et remettre en suspension dans 10 ml de RPMI additionné de 10% sérum de veau foetal (FCS), 100 UI / ml de pénicilline, 100 pg / ml streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 50 pM de 2-mercaptoéthanol (RPMI-10). Compter les cellules comme avant, à l'étape 1.1.10.
   23. Ajuster la concentration finale des cellules T CD4 + naïves à 6x10 ⁵ / ml dans du RPMI-10.
2. Purifier T APC spléniques appauvries en cellules
   1. Euthanasier un 6-8 semaines, âgé de type sauvage souris BALB / c femelles comme à l'étape 1.1.1.
   2. Pulvériser la souris avec une solution d'éthanol à 70% et on expose la rate en faisant une incision de 3 cm environ sur le côté gauche de la abdome de la sourisn. Découper la couche péritonéale et enlever la rate en saisissant délicatement avec une pince et couper loin du tissu conjonctif sous-jacente avec des ciseaux chirurgicaux.
   3. Placez la rate dans 8 ml de HBSS + 2% NCS.
   4. Préparer une suspension cellulaire unique en écrasant la rate, se laver, et compter les cellules, comme avant, dans les étapes 1.1.7-1.1.10
   5. Appauvrir les lymphocytes T par centrifugation des cellules à 600 xg pendant 5 min à pastille, et remettre en suspension les cellules à 2x10 ⁷ dans une solution d'environ 1 ug / anticorps anti-Thy1.2 ml (clone J1J) en pipettant doucement. Incuber les cellules sur de la glace pendant 30 min.
      NOTE: Cet anticorps a été dérivé en interne à partir d'une lignée cellulaire d'hybridome et l'concentraton est approchée. La concentration et le volume de cet anticorps idéal pour la lyse du complément a été déterminé de manière empirique et varieront entre les laboratoires. D'autres méthodes de TTB purifiantes de splénocytes peuvent être substitués si on le désire. cellules et TTB T Naïf doivent être préparés culteure de l'étape 1.3.
   6. Ajouter Guinée complément de porc, laisser incuber, et on sépare les cellules sur un gradient de milieu de centrifugation de densité comme précédemment, dans les étapes 1.1.13-1.1.14.
   7. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de RPMI-10 et irradier les véhicules blindés en plaçant les cellules dans un tube de centrifugation de 50 ml dans un irradiateur gamma pendant une durée qui va exposer les cellules à 25 Gy radiation. Cette durée varie en fonction de l'irradiateur et devra être calculée à chaque fois que les cellules sont irradiées.
   8. Compter les cellules sur un hémocytomètre comme précédemment, à l' étape 01.01.10 et ajuster les cellules APC à une concentration finale de 2.4x10 ⁶ cellules / ml dans du RPMI-10.
3. Stimuler des cellules et de différencier les cellules T CD4 Th1 à un phénotype dans une culture de 5 jours.
   NOTE: Bien que nous présentons ici un protocole pour la préparation et l'imagerie effecteurs Th1 générées à partir de cellules T CD4 naïfs, ce protocole peut être ajusté pour différencier les cellules naïves à un phénotype différent, ou to utiliser d'autres types de cellules, comme les cellules T CD8. Conditions d'amorçage et la différenciation devront être déterminées empiriquement.
   1. Dans chaque puits d'une boîte de culture de 24 puits, mélanger 500 pi des cellules T CD4 naïfs et 500 pi des TTB irradiés dans chaque puits, pour un total de 3x10 ⁵ cellules T et 1,2x10 ⁶ TTB par puits.
   2. Préparer une solution dans du RPMI-10 contenant 2 uM cognât peptide OVA, 20 U / ml d'IL-2 recombinante, 80 pg / ml d'anticorps anti-IL-4 (clone 11B11) et 40 ng / ml d'IL-12 recombinante et le filtre en utilisant un 0,2 filtre à seringue pm. Ajouter 1 ml de cette solution à chaque puits de cellules, pour un volume total de 2 ml dans chaque puits.
   3. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° au niveau de 5% de CO ₂ pendant 3 jours.
   4. Le jour 3, diviser les cultures en pipetant doucement pour remettre en suspension les cellules et le déplacement de 1 ml de chaque puits dans une nouvelle culture bien. Amener chaque puits à un volume final de 2 ml par addition de 1 ml / puits de RPMI-10 + 20 U / ml d'IL-2 recombinante.
   5. Remettre les plaques dans l'incubateur et permettent aux cellules de se développer jusqu'à ce jour 5.

2. Transfert des cellules et l'induction de l'inflammation

NOTE: Pour le nombre de cellules optimales pour l' imagerie, 5x10 ⁶ cellules Th1 marquées par fluorescence doivent être transférés à chaque souris dans un volume total de 200 ul de PBS. Les cellules ici sont étiquetés avec le CFSE de colorant vert ou CMTMR quasi-colorant rouge, bien que d'autres colorants tracker de cellules peuvent être utilisés. CFSE et les cellules marquées par CMTMR peuvent être co-transférées pour permettre le suivi de deux populations CD4 effectrices distinctes.

1. Étiquette effectrices des cellules T avec des CFSE
   1. Récolter les cellules des boîtes de culture par pipetage vigoureusement les cellules dans chaque puits, et transférer dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml avec une pipette. Compter les cellules comme dans l' étape 01/01/10, puis centrifugation et remettre en suspension les cellules à 10 ⁷ cellules / ml dans du PBS + 5% NCS.
   2. Diluer mM solution 5 stock CFSE 1: 100 dansPBS. Ajouter 110 ul de solution CFSE pour chaque 1 ml de cellules en plaçant une goutte de solution CFSE sur le côté du tube, puis rapidement à bascule le tube avant et en arrière pour bien mélanger.
   3. Incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante, puis étancher la CFSE en ajoutant 5 ml de sérum de foetus de veau (FCS) directement au tube de cellules. Amener le volume à 50 ml avec du PBS + 5% NCS.
   4. Centrifuger les cellules et resuspendre le culot dans 20 ml de PBS + 5% NCS. Répétez ce processus deux fois pour laver les cellules 3 fois au total. Compter les cellules sur un hémocytomètre, comme précédemment, à l' étape 01/01/10, et remettre en suspension les cellules dans du PBS stérile à 2,5 x 10 ⁷ cellules / ml pour le transfert à des souris.
2. Étiquette effectrices cellules avec CMTMR T
   1. Récolter les cellules comme ci - dessus à l' étape 2.1.1, puis compter, centrifugeuse et remettre les cellules à 10 ⁷ cellules / ml dans RPMI-10.
   2. Ajouter CMTMR mM de solution mère 10 directement aux cellules pour obtenir une concentration finale de 10 uM. e rapidement pipettese cellules pour bien mélanger dans le CMTMR et éviter la précipitation du colorant.
   3. Incuber pendant 30 minutes dans un bain-marie à 37 °. Laver les cellules 3x dans du PBS + 5% NCS comme avant, à l'étape 2.1.3-2.1.4. Compter et remettre en suspension les cellules dans du PBS stérile à 2,5x10 ⁷ cellules / ml pour le transfert à des souris.
3. cellules T effectrices de transfert à Naïf ancienne souris femelles BALB / c 6-8 semaines.
   1. Dessinez la suspension cellulaire (étape 2.1.4 ou 2.2.3) dans une seringue, en prenant soin d'enlever toutes les bulles en tenant la seringue aiguille côté-up, effleurant doucement du côté de la seringue et le déplacement du piston vers le haut et vers le bas, si nécessaire .
   2. Placez la souris dans une cage propre et chauffer doucement sous une lampe de chaleur jusqu'à ce que la veine de la queue semble vasodilated. Placez la souris dans un dispositif de retenue et essuyez la queue avec un tampon imbibé d'alcool. Injecter lentement 200 pi de la suspension cellulaire dans la veine caudale latérale. Il devrait y avoir aucune résistance à l'injection ou barbotage visible sous la peau.
4. Provoquer l'inflammation cutanée en immunisant avec l'adjuvant complet de Freund (CFA)
   NOTE: Dans ce protocole, l'inflammation est induite par injection intradermique de CFA émulsionnée avec l'antigène soit apparenté ou non apparenté. D'autres modèles inflammatoires peuvent être substitués, bien que le nombre de cellules nécessaires pour le transfert et la synchronisation de l'imagerie devra être ajustée de manière empirique.
   1. Préparer une solution 200 uM de peptide OVA dans du PBS stérile dans un tube de microcentrifugation. Une pipette volume équivalent de CFA au-dessus de la solution de peptide.
   2. Emulsionner la solution en tirant dans un / 2 seringue à insuline 28 G1 puis plongeant la solution dans le tube à centrifuger, puis en répétant cette action environ 20 fois. Une fois complètement émulsionnée, le CFA et la solution de peptide forment un mélange épais et opaque.
      Remarque: il est essentiel d'utiliser une seringue à insuline de l'aiguille fixe pour former l'émulsion, comme l'émulsion sera perdue dans l'espace mort dans une needl non fixéee seringue.
   3. Testez l'émulsion en laissant tomber une petite quantité sur de l'eau placée dans une boîte de Pétri. L'émulsion doit rester intact et ne pas se disperser dans l'eau.
   4. Dessinez l'émulsion dans un G1 / 2 seringue à insuline 300 pi 28 et appuyez fortement sur le piston pour éliminer les grosses bulles d'air.
   5. Immédiatement après le transfert de cellules marquées par fluorescence T effectrices, anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de 2,2,2-tribromoéthanol à 240 mg / kg. Évaluer l'anesthésie par un pincement de l'orteil douce, administrer plus 2,2,2-tribromoéthanol par incréments de 1 mg, si nécessaire.
      NOTE: autres anesthésiques approuvés peut être remplacé par le 2,2,2-tribromoéthanol.
   6. Placez un dé à coudre sur l'index gauche et de saisir attentivement l'oreille de la souris entre le pouce gauche et l'index avec l'oreille ventrale vers le haut. Assurez-vous de ne pas exercer une pression excessive sur l'oreille, ce qui peut causer des dommages mécaniques à la peau.
   7. Faites glisser l'aiguille contenant le CFA eemulsion dans le derme, côté conique vers le haut, et injecter lentement 10 pl de l'émulsion dans l'oreille. Le placement de l'injection doit être dans la partie extérieure 1/3 du pavillon, légèrement hors-centre pour permettre l'imagerie optimale.
   8. Surveiller la souris jusqu'à ce que l'anesthésie a cessé et les souris sont capables de se redresser et sont ambulatoires. souris Image 3 jours après la vaccination, en fournissant le temps de l'inflammation à développer et les cellules T transférées à la circulation dans le derme de l'oreille.
      NOTE: Les souris ne peuvent pas être laissés sans surveillance à tout moment sous anesthésie.

3. Préparation de la souris pour l'imagerie

1. Préparer un cathéter
   1. Retirez délicatement l'aiguille métallique à partir d'un / 2 tuberculine (TB) aiguille de seringue 30 G1 avec des pinces et nettoyer tout excès de colle, en utilisant un champ de dissection pour visualiser ce que la colle est complètement enlevée.
   2. Couper l'extrémité hors d'un autre / 2 TB aiguille de seringue 30 G1, en veillant à ce que l'aiguille reste est encore pAtent par inspection visuelle. Glisser une pièce de 18 cm de PE-10 tube médical sur l'aiguille rognée et placer soigneusement l'aiguille métallique nu environ 5 mm dans l'autre extrémité du tube, créant ainsi un cathéter.
2. Rincer le cathéter en remplissant une seringue de 1 ml TB avec du PBS stérile, en éliminant les bulles d'air. Placez délicatement le cathéter sur la pointe de la seringue et pousser doucement PBS si le cathéter pour éliminer les bulles dans le tube.
   Remarque: lorsque l'on pousse le fluide à travers le cathéter, il est essentiel de maintenir le cathéter sur la seringue pour empêcher une pression de fluide de pousser le cathéter hors de la seringue.
3. Placez la souris dans une cage propre et chauffer doucement sous une lampe de chaleur jusqu'à ce que la veine de la queue semble vasodilated. Anesthésier la souris avec un mélange d'air ambiant et de l'isoflurane (5% de l'induction, l'entretien 1-2%, à 2 L / débit min) délivrée par l'ensemble de coiffe qui a été attaché à l'évaporateur isoflurane. Assurez-vous que la souris est anesthésiée with un pincement de l'orteil douce. Incrémentielle augmenter le débit isoflurane de 0,1% si le mouvement est observé. Couvrir les yeux avec une pommade ophtalmique pour éviter le dessèchement et les blessures alors que la souris est anesthésiée.
   NOTE: Il est essentiel que les souris jamais être laissés sans surveillance pendant anesthésié. Les souris doit être fréquemment contrôlée pour l'anesthésie suffisante par doux pincement de l'orteil.
4. Immobiliser la queue à la base avec une paire de pinces, puis essuyez la queue avec un tampon imbibé d'alcool. Faites glisser délicatement le cathéter dans la veine caudale latérale et vérifier la perméabilité en poussant doucement sur le piston de la seringue. Il devrait y avoir aucune résistance au mouvement et aucun bouillonnement visible de PBS sous la peau si elle est placée de manière appropriée. Fixer le cathéter à la queue en appliquant 1-2 gouttes de colle tissulaire à base de cyanoacrylate sur le site d'injection et laisser sécher, à environ 30 sec.
5. couper soigneusement les cheveux à l'arrière et les côtés de l'oreille avec une paire de ciseaux, en prenant soin de ne pas endommager le skdans. Coupez les moustaches aussi bien. En utilisant un coton-tige, humidifier la surface interne de l'oreille avec du PBS.
6. Tournez la souris et l'oreille sur un 24 x 50 mm No. 1,5 couvercle en verre de glissement. En utilisant des pinces, aplatissez doucement l'oreille sur la lamelle, en déplaçant la souris si nécessaire pour veiller à ce que l'oreille est au ras du verre. Enlever l'excès de PBS de l'oreille en tamponnant doucement avec un tissu essuyez.
   REMARQUE: Assurez-vous de ne pas appuyer trop fermement sur l'oreille, comme la peau mince peut facilement être endommagé avec une pression excessive.
7. L'utilisation de deux paires de pinces courbes, saisir un environ 20 mm de long morceau de ruban de tissu de la longueur dans les coins supérieurs. Placez le bas de la bande sur la lamelle en haut de l'oreille de la souris et rouler la bande sur le reste de l'oreille, poussant l'excès de poils sur la voie avec la pince si nécessaire pour fixer l'oreille à la lamelle. Appuyez doucement sur la bande autour de l'oreille avec un coton-tige sec pour assurer un joint étanche, en prenant soin de ne pas appuyer sur l'oreille elle-même.
8. Fixer la plate-forme d'imagerie à un bloc C de chauffage de 37 ° avec du ruban adhésif. Appliquer de la graisse à vide de part et d'autre de la zone de l'oreille de la plate-forme d'imagerie. Tourner la souris pour placer la lamelle sur la plate-forme d'imagerie, en prenant soin d'aligner l'oreille dans le centre du feutre.
   REMARQUE: Évitez d'obtenir la graisse à vide sur la bande, car cela va causer à venir détaché de la lamelle de verre.
9. Enclenchez le nosecone isoflurane dans le support sur la plate-forme d'imagerie, veiller à ce que la coiffe est sécurisé et couvrant complètement le nez de la souris. Répartir la graisse à vide sous la lamelle par fermement mais avec précaution en appuyant sur la lamelle sur la plate-forme d'imagerie avec un chiffon propre, coton-tige sec.
10. Apposer la lamelle à la plate-forme avec deux 20 mm morceaux de ruban adhésif et deux pièces plus longues de ruban enroulé autour de la partie supérieure de la plate-forme. Si des bulles d'air sont présentes entre l'oreille et la lamelle couvre-objet, ils peuvent être éliminés en pressant doucement sur l'oreille par le bas with un morceau de papier plié.
    NOTE: Il est essentiel de ne pas utiliser de papier trop épais ou presser fermement, car cela peut causer des tissus blanchissement et des dommages, ce qui complique les résultats.
11. Déplacez la souris sur la platine du microscope et de sécuriser la plate-forme avec du ruban adhésif. Tuyauterie une double couche de graisse à vide sur la lamelle autour de l'oreille pour servir de réservoir pour l'objectif d'immersion dans l'eau.
12. Enroulez une couverture chauffante remplie d'eau autour de la souris à travers la plate-forme d'imagerie. Remplir le réservoir avec 37 ° C de l'eau distillée. Assurez-vous que tout est fixé sur la scène avec du ruban adhésif et que la seringue du cathéter est facilement accessible.

4. In Vivo Time-lapse Imaging and intraveineux Antibody administration

NOTE: Ce protocole nécessite l'utilisation d'un microscope multiphoton équipé d'un Ti: Sa système laser. L'objectif utilisé est un objectif 25x de grossissement avec 1,05 NA, fixé avec un objetive de chauffage réglé à 40 ° C. La température optimale pour cet élément chauffant a été déterminé de manière empirique à la température appropriée pour maintenir le derme de l'oreille à 37 ° C, et peut devoir être ajusté pour être utilisé dans d'autres systèmes d'imagerie. Le logiciel d'acquisition utilisée peut varier entre les instruments et les ajustements au protocole peut être fait de travailler sur des systèmes configurés différemment. Veiller à ce que les images peuvent être enregistrées dans un format qui est compatible avec tous les logiciels d'analyse souhaitée.

1. Localiser le derme à travers les oculaires par le positionnement de l'objectif sur le centre de l'oreille et l'abaissement de l'objectif juste jusqu'à ce qu'il contacte la surface de l'eau dans le réservoir. L'utilisation d'une source de lumière externe, regarder à travers les oculaires et continuer à baisser lentement l'objectif jusqu'à ce que la surface de l'oreille est mis au point. Abaisser les rideaux intérieurs et extérieurs autour de la platine du microscope.
2. Déterminer les paramètres du microscope et de localiser une zone pour l'imagerie
   1. Avant imaging, configurer le laser pour l'excitation maximale et la détection des fluorophores désirées en réglant la longueur d'onde du laser à 900 nm dans la fenêtre Contrôleur laser MP, la puissance du laser dans le réglage d'acquisition: fenêtre à laser, et les tensions PMT dans l'image fenêtre de contrôle d'acquisition .
      NOTE: Cette procédure utilise une longueur d'onde d'excitation de 900 nm avec des filtres pour détecter génération de seconde harmonique (420-460 nm), CFSE (495-540 nm), et CMTMR (575-630 nm). D'autres configurations peuvent être utilisées pour détecter des fluorophores différents comme on le souhaite.
   2. Réglez le microscope à 512 x 512 pixels de résolution, avec un temps de séjour de 2 microsecondes / pixel dans le réglage Acquisition: Taille et Mode fenêtres. Activer un mode d'imagerie en temps réel pour permettre la numérisation à travers le tissu pour une zone d'image en cliquant sur "Répétition XY". Idéalement, la zone doit être relativement uniforme, sans bulles d'air, et en évitant les zones de follicules pileux denses.
      NOTE: L'émulsion CFA est autofluorescents brillamment dans le vert et near-rouge canaux et doit être évitée. Un champ optimal peut habituellement se trouve à environ 3 mm du bord de l'émulsion. Environ 10 - 100 cellules peuvent être suivis dans une seule image. Si trop de cellules sont présentes, le logiciel de suivi se rencontrent généralement des erreurs en essayant de séparer les cellules étroitement situées, menant à des pistes de cellules raccourcies et / ou inexactes.
   3. Une fois un champ d'imagerie approprié a été localisé, déterminer la région de Z qui sera imagée par localiser la cellule "plus haut" dans le derme, le réglage de la position Z à 0 en cliquant sur le bouton "Set 0", et le défilement vers le bas dans le Z direction afin de mesurer l'étendue de la profondeur de la cellule. Une profondeur de 35-75 um d'imagerie est typique. Définissez les positions de départ et de fin dans le Cadre d'acquisition: fenêtre Microscope. Ajustez les instruments tensions PMT et la puissance du laser dans la fenêtre "bright Z" pour optimiser la visualisation des cellules dans toute la profondeur du champ d'imagerie.
      REMARQUE: Ne pas soulever l'laspuissance er supérieure à 25 mW à l'échantillon, les niveaux de puissance aussi élevé peut causer des dommages à la chaleur et une blessure stérile au derme. Le niveau de puissance maximale appropriée pour chaque microscope variera et devra être mesurée. Il convient de noter que l'augmentation de la puissance du laser ou des tensions PMT avec la profondeur des tissus ne permet pas de comparaison quantitative de luminosité de l'image à différentes profondeurs dans l'analyse post-acquisition.
   4. Cochez la case "Profondeur" et les boutons "Time" sous le bouton "Scan" dans l'image fenêtre de contrôle d'acquisition. Définir un filtre de Kalman pour numériser l'image 3 fois par ligne dans l'acquisition d'images de contrôle: fenêtre du mode de filtre et d'ajuster la profondeur Z-slice dans l'acquisition de l'image: fenêtre Microscope de sorte qu'il faut environ 1 min pour capturer une pile complète, comme indiqué dans la fenêtre TimeView.
      REMARQUE: L'intervalle entre les piles ne devrait pas prendre plus de temps à environ 1 min, comme des intervalles plus longs empêchent le suivi des cellules qui migrent rapidement. En fonction de thtype de cellules e imagée, cet intervalle peut avoir besoin d'être ajusté pour permettre un suivi correct de la cellule par un logiciel d'analyse. Z tranches doivent pas être supérieure à 5 um. En général, 15-18 Z tranches entre 5/2 xm d'épaisseur sont appropriés pour l'imagerie d'un intervalle de 1 min.
3. Capturer une image pré-anticorps time-lapse
   1. Capturez une image de 5 min time-lapse de la région pour évaluer la stabilité du tissu en fixant le nombre de répétitions à «5» dans le réglage Acquisition: fenêtre TimeScan et en cliquant sur le bouton "Scan".
      NOTE: Tissue "dérive" peut être causée par ne pas laisser suffisamment de temps pour l'oreille pour atteindre l'équilibre thermique, une mauvaise préparation de l'oreille, ou peut être due à la dérive locale dans une région de l'oreille. Si l'image de 5 min est pas stable, l'image d'une nouvelle région dans le derme. Si une seconde image dans une nouvelle région reste instable, il est préférable de répéter soigneusement la préparation de l'oreille et de l'imagerie de l'étape 3.6 avec une nouvelle coverslip.
   2. Si le tissu est stable dans l'image 5 min, recueillir une image temps-lapse 30-45 min en réglant le nombre de répétitions entre 30 et 45 dans le Cadre d'acquisition: fenêtre TimeScan, la surveillance de toute dérive de tissu mineur comme l'image est recueillies. Enregistrez le fichier dans un format qui est compatible avec le logiciel d'analyse à utiliser.
      NOTE: A ce stade, dans le protocole, les étapes 4.2.2 - 4.3.2 peut être répétée à l'image de multiples endroits dans la même oreille. Un simple clic de souris ne doit pas être maintenu anesthésié pendant plus de 4 heures, comme la mort est plus susceptible de se produire.
4. Injecter anticorps bloquants et capturer une image post-anticorps.
   1. Dessinez le mélange d'anticorps dans un 1 ml TB seringue et retirer l'aiguille, en veillant à éliminer toutes les bulles d'air. Appuyer sur le piston de la solution d'anticorps de telle sorte que se forme une «goutte» à la fin de la seringue.
   2. Soulevez les rideaux autour de la scène et de localiser le cathéter. Retirez l'original PBS-contaSeringue ining du cathéter. Sans fixer le cathéter vers le bas, fixez soigneusement la nouvelle seringue contenant les anticorps. Maintenir l'extrémité du cathéter sur la seringue et d'injecter lentement le mélange d'anticorps dans le cathéter. Assurez-vous qu'il n'y a pas de résistance à l'injection.
   3. Réglez le cathéter vers le bas et abaisser les rideaux entourant la platine du microscope. Notez l'heure de l'injection et commencer immédiatement la collecte d'une nouvelle séquence d'imagerie 20-40 min dans le même emplacement en utilisant les mêmes réglages de l'instrument que l'image pré-anticorps. Enregistrez le fichier dans un format approprié pour le logiciel d'analyse à utiliser.
      NOTE: Entre images time-lapse, observer la souris pour l'anesthésie et la respiration suffisante. Il est recommandé de ne pas l'image plus d'un champ après l'administration d'anticorps, comme il peut y avoir des taux variables de la clairance de l'anticorps.
5. Injecter dextran marqué par fluorescence pour localiser les vaisseaux sanguins, d'évaluer la perméabilité du cathéter, et mesurer brécipient de perméabilité Lood
   1. Préparer une solution de dextran fluorescent conjugué (70.000 MW) dans 100 ul de PBS stérile / ml 2 mg et de tirer dans une seringue, enlever les bulles d'air.
   2. En utilisant la même technique que dans l'étape 4.4.1-4.4.2, placer la seringue sur le cathéter et injecter la solution de dextran par voie intraveineuse.
   3. Capture d'une seule pile à 1024 x 1024 pixels de résolution en modifiant la résolution dans le réglage Acquisition: fenêtre Mode, avec les mêmes paramètres PMT et laser comme pour les images de time-lapse. Pour récupérer l'image, décochez le bouton "Time" sous le bouton "Scan", puis en cliquant sur le bouton "Scan". Cette image 3D va permettre aux lymphocytes T d'exclusion situés dans le système vasculaire et montrent que le cathéter a été correctement inséré et brevet. La diffusion de dextran fluorescent hors des vaisseaux peut également être utilisée pour évaluer la perméabilité vasculaire locale.
      NOTE: Cette haute résolution (1024 x 1024) image statique est utilisé pour presentation fins et peuvent être en outre être utilisés pour l'analyse de l'architecture du tissu dans la même zone que les images de time-lapse. Alternativement, une image 512 x 512 peut être prise, qui peut être fusionné avec les images en accéléré en utilisant un logiciel d'analyse d'image. Time lapse imagerie de l'administration de dextrane peut également être souhaitable, en fonction des besoins de recherche des laboratoires individuels. Dans ce cas, l'image doit être mis en place comme dans les étapes 4.2.3-4.3.2.
6. Après l'imagerie est terminée, retirez soigneusement la souris sous l'objectif et déplier la couverture de l'eau. Enlever les lamelles de la plate-forme d'imagerie en coupant le ruban et doucement en soulevant le verre jusqu'à ce qu'il se détache. Alors que la souris est toujours anesthésié, détacher l'oreille de la lamelle. Si cela doit être une procédure terminal, euthanasier la souris par dislocation cervicale. Si vous enregistrez cette souris pour l'imagerie répétée, revenir à une cage propre séparer des autres souris et observer jusqu'à ce que la souris peut se redresser et estambulatoire. Une fois récupéré de l'anesthésie, la souris peut être renvoyé dans une cage avec d'autres animaux.
7. Importez les fichiers d'imagerie dans un programme d'analyse d'image et effectuer toutes les corrections souhaitées. Prévention des améliorations non-linéaires et lissage ou le bruit des programmes et algorithmes automatisés réduction est recommandé. En règle générale, les images ont seulement besoin d'une correction de fond mineure en augmentant manuellement le point de l'image noire avant l'analyse. Analyser les données d'imagerie en utilisant un programme cellulaire suivi automatisé avec correction manuelle, comme dans Overstreet, Gaylo et al ^30.
   NOTE: Il y a beaucoup de suites d'analyse d'images disponibles, à la fois propriétaires et open source, qui peuvent être utilisés pour quantifier la dynamique des cellules à partir des images multiphotonique dérivées de ce protocole. La méthode exacte de l'analyse d'image et les progiciels optimaux à utiliser dépendra des besoins de recherche des laboratoires individuels.

Résultats

La capacité à étudier les réponses immunes in situ , sans altérer l'environnement immunitaire est essentielle pour l' étude des interactions en temps réel des cellules T effectrices avec un tissu enflammé. Imagerie du derme de l' oreille intacts par ce protocole, présenté sur la figure 1A et B, permet la visualisation des cellules T effectrices marquées par fluorescence transférés dans l'interstitium cutanée. Cela p...

Discussion

Importance

Nous présentons ici un protocole complet pour la visualisation 4D transférés, effectrices spécifiques de l'antigène des cellules Th1 dans les intactes derme de l'oreille de la souris. Cette méthode offre des avantages sur des techniques d'imagerie actuelles pour plusieurs raisons. En imageant le derme de l'oreille ventrale, nous sommes en mesure de renoncer à l'épilation qui est nécessaire pour des protocoles d'imagerie impliquant d'au...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mice	Jackson Laboratories	000651	Mice used were bred in-house
DO11.10 mice	Jackson Laboratories	003303	Mice used were bred in-house
HBSS	Fisher	10-013-CV	Multiple Equivalent
Newborn Calf Serum (NCS)	Thermo/HyClone	SH30118.03	Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes
Guinea Pig Complement	Cedarlane	CL-5000
anti-CD8 antibody	ATCC	3.155 (ATCC TIB-211)	Antibodies derived from  this hybridoma
anti-MHC Class II antibody	ATCC	M5/114.15.2 (ATCC TIB-120)	Antibodies derived from  this hybridoma
anti-CD24 antibody	ATCC	J11d.2 (ATCC TIB-183)	Antibodies derived from  this hybridoma
anti-Thy1.2 antibody	ATCC	J1j.10 (ATCC TIB-184)	Antibodies derived from  this hybridoma
Ficoll (Fico/Lite-LM)	Atlanta Biologicals	I40650
PBS	Fisher	21-040-CV	Multiple Equivalent
EDTA	Fisher	15323591
biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14)	BD	553149
streptavidin magnetic separation beads	Miltenyi	130-048-101
MACS LS Separation Column	Miltenyi	130-042-401
recombinant human IL-2	Peprotech	200-02
recombinant mouse IL-4	Peprotech	214-14
recombinant mouse IL-12	Peprotech	210-12
anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2)	eBioscience	16-7311-85
anti-IL-4 antibody (clone 11b11)	eBioscience	16-7041-85
RPMI	VWR	45000-412
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15303641
L-glutamine	Fisher	15323671
2-mercaptoethanol	Bio-Rad	161-0710
ovalbumin peptide	Biopeptide		ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo/HyClone	SV30014.03	Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes
24-well culture plate	LPS	3526	Multiple Equivalent
CFSE	Life Technologies	C34554
CMTMR	Life Technologies	C2927
28 G1/2 insulin syringes, 1ml	BD	329420
28 G1/2 insulin syringes, 300μl	BD	309301
27 G1/2 TB syringes, 1ml	BD	309623
30 G1/2 needles	BD	305106
PE-10 medical tubing	BD	427400
cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
heating plate	WPI	61830
Heating plate controller	WPI	ATC-2000
Water blanket controller	Gaymar	TP500	No longer in production, newer equivalent available
water blanket	Kent Scientific	TP3E
Isoflurane vaporizer	LEI Medical	Isotec 4	No longer in production, newer equivalent available
isoflurane	Henry Schein		Ordered through Veterinary staff
microcentrifuge tubes	VWR	20170-038	Multiple Equivalent
medical tape	3M	1538-0
isoflurane nosecone			Built In-house, see Fig 2
imaging platform			Built In-house, see Fig 2
curved forceps	WPI	15915-G	Multiple Equivalent
scissors	Roboz	RS-6802	Multiple Equivalent
glass coverslips	VWR		Multiple Equivalent
high vacuum grease	Fisher	146355D
cotton swabs			Multiple Equivalent
delicate task wipes	Fisher	34155	Multiple Equivalent
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Olympus		call for quote
optical table with vibration control	Newport		call for quote
25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging	Olympus	XLPLN25XWMP2
objective heater	Bioptechs	PN 150815
Detection filter cube	Olympus	FV10-MRVGR/XR	Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics
anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1)	eBioscience	16-0291-85	Azide free, low endotoxin
anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3)	eBioscience	16-0611-82	Azide free, low endotoxin
Texas Red Dextran (70,000 MW)	Life Technologies	D-1830