Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

Özet

enflamasyon bölgelerinde CD4 efektör T hücrelerinin geçiş motilite yöneten mekanizma nispeten bilinmemektedir. Biz görselleştirmek ve yerinde bu hücrelerin dinamik davranışının çalışması için izin iltihaplı kulak dermiş in vitro -astarlı CD4 T hücrelerinde işlemek için non-invaziv bir yaklaşım sunuyoruz.

Özet

Efektör işlevleri gerçekleştirmek için, CD4 T hücrelerinin yeteneği bir olarak henüz tanımlanmamış bir mekanizma yoluyla iltihaplı çevresel dokularda bu hücrelerin hızlı ve etkili bir geçiş bağlıdır. Bağışıklık sisteminin çalışmaya multiphoton mikroskopunun uygulama dokulara olan bağışıklık tepkilerinin dinamiklerini ölçmek için bir araç sağlar. Burada iltihaplı fare kulak dermis CD4 T hücrelerinin non-invaziv intravital multiphoton görüntüleme için bir protokol mevcut. Özel bir görüntüleme platformu kullanmak ve bir kateter hareketliliği kilit rol oynayan moleküler bileşenlerine bloke edici antikorların eklenmesi yoluyla gerçek zamanlı olarak bu hücreleri sorgulamak için yeteneği ile, dermal interstisyumda CD4 T hücre dinamikleri görselleştirme sağlar. Bu sistem, in vitro modelleri ve cerrahi invaziv görüntüleme yöntemleri hem üzerinde avantajlar sağlamaktadır. motilite için CD4 T hücreleri tarafından kullanılan yollar anlamak sonuçta basi içgörü sağlayabilirc CD4 T hücrelerinin işlevi yanı sıra kronik enfeksiyonlar hem otoimmün hastalıkların patogenezi ve patolojisi.

Giriş

The effector function of CD4 T cells is critically dependent on their ability to rapidly enter and traverse a wide variety of peripheral tissues to survey for damage, locate foci of infection, or cause pathology from chronic infection or autoimmunity. While the processes of homing to inflamed sites^1-4 and extravasation^5-7 from the vasculature into tissues have been well-characterized, the factors that drive and regulate the interstitial motility of T cells remain undefined. The migration of T cells in complex 3D environments has been studied in vitro through the use of artificial matrices^8-10 or microfluidic devices^11,12, but these fail to recapitulate the complex and dynamic environment of an in vivo system. It is only recently, with the advent of high-resolution multi-color intravital imaging that it has become possible to study the dynamic behavior of immune cells in situ, allowing for a better understanding of intact immune responses.

Over a decade ago, several influential studies were published that first utilized multiphoton microscopy to address immunological questions. Early studies focused on the behavior of immune cells within explanted lymphoid organs^13-16, which were soon followed by techniques to image exposed lymph nodes in anesthetized mice¹⁷. Imaging allowed for new fundamental observations about the stages of lymph node priming of T cells¹⁸, the mechanisms by which T cells migrate in secondary lymphoid organs¹⁹, T cell interactions with other immune cells^20,21, and dynamic T cell positioning within the lymph node²². Although many early studies focused on lymph node dynamics, intravital imaging has been since been utilized to image the immune response in many peripheral tissues, including the brain^23-25, liver²⁶, lung²⁷, and skin^28-30.

The mouse ear dermis is particularly well poised for imaging, due to the thinness of ear skin, a relative lack of hair, and the ease with which it can be isolated from respiratory movements³¹. Indeed, the ear dermis has been used to image the interstitial behavior of dendritic cells^32,33, T cells^28,29,34,35, and neutrophils^36,37, and is a well-established site for studying dermal inflammation. Increasingly, non-invasive procedures have been replacing surgical preparations of the skin, including split dermis^38,39, flank^39,40, or dorsal skin flap window^39,41 models, that can induce changes to the local inflammatory milieu. The use of transferred, in vitro-primed, antigen-specific CD4 effector T cells allows for the study of a homogenous population of cells in the context of a dermal inflammatory response³⁰. Here we describe a non-invasive imaging procedure that allows for the visualization of antigen-specific effector CD4 T cells in the dermal interstitium of the inflamed mouse ear, and the ability to manipulate these cells in real-time by introducing blocking antibodies through a venous catheter. We show that this model is effective for tracking the movement of CD4 T cells in the dermis and for querying the mechanisms that govern this motility.

Protokol

fareler içeren tüm işlemler Rochester Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yönetilen Hayvan Refahı Yasası ve İnsani Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Servisi Politikası ile tam uyum içinde yürütülmüştür Sağlık, Laboratuar Hayvan Refahı Ofisi.

Efektör CD4 T hücrelerinin hazırlanması 1.

Not: özel olarak, tavuk yumurta beyazı bir peptit (: ISQAVHAAHAEINEAGR pova) tanıyan BALB / c TCR-transgenik DO11.10 fareler. Diğer TCR-transgenik sistem belirtilmediği pova yerine uygun ortak kökenli peptidi kullanılarak, ikame edilmiş olabilir.

1. naif CD4 + T hücrelerinin saflaştırılması
   1. 2 L maruz ile 6-8 haftalık dişi DO11.10 BALB / C fare öldürülür / dakika _CO2 fare hareketi ya da 1 dk solunum belirtisi, sonra servikal dislokasyon yapılmıştır ya da uygun gösterene kadarYerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım komitesinin kurallar. % 70 etanol çözeltisi ile fare Sprey ve karın yol aşağı 2/3 fare çeneden deride yaklaşık 7 cm kesi yapmak. arka ayakları doğru karın kesi sonundan itibaren 2-3 cm'lik cilt kesiler olun. periton içine kesmek için dikkatli olun.
   2. Dikkatlice forseps ile yavaşça çekerek periton cilt ayırmak. kasık lenf düğümleri gövde ile arka ayakları birleşiminde deri üzerinde yer almaktadır. kavrama ve% 2 yeni doğmuş buzağı serumu (NCS) ile desteklenmiş HBSS 8 ml Forseps ve yer ile çekerek çıkarın.
   3. kavrayarak ve forseps ile hafifçe çekerek fare aksiller ve brakiyal lenf düğümleri hasat. kasık lenf düğümleri ile HBSS +% 2 NCS yerleştirin.
   4. ot ile HBSS +% 2 NCS forseps ve yer ile fare boyunda bulunan derin ve yüzeyel servikal lenf düğümleri HasatOnun lenf nodları.
   5. Yavaşça bağırsak içine kesmek için özen, periton içine kesti. forseps ile çekum ve kolon kavrayın ve sadece kolon boyunca yer almaktadır mezenterik lenf düğümleri maruz kalmaktadır. Dikkatle forseps ile mezenterik lenf düğümleri kaldırmak ve diğer lenf nodları ile yerleştirin.
   6. periton boşluğuna dalak bulun ve dikkatle forseps ile tutarak ve cerrahi bir makasla ortadan bağ dokusu kesme çıkarın. lenf düğümleri ile dalak yerleştirin.
   7. 60 x 15 mm kültür çanağı içine yerleştirilmiş bir metal süzgeç içine dalak ve lenf düğümleri içeren HBSS +% 2 NCS dökülerek tek bir hücre süspansiyonu hazırlanır. Yavaşça HBSS +% 2 NCS içine 10 ml şırınga pistonu metal süzgecinden dalak ve lenf düğümleri ezin.
   8. Bir pipet kullanarak, temiz bir 50 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu hareket ettirin. , HBSS +% 2 NCS ek 10 ml u metal süzgeç ve Kültür çanak yıkayınbir pipet şarkı ve hücre süspansiyonu ile aynı bir 50 ml santrifüj tüpü içinde bu çözüm yerleştirin.
   9. 5 dk hafifçe pipetleme 10 ml HBSS +% 2 NCS hücreleri ve tekrar süspansiyon pelet için 600 xg'de hücreleri dönerler. Aksi belirtilmediği sürece, tüm santrifüj 5 dakika boyunca 600 x g'de yapılmalıdır.
   10. 1:10 seyreltme için PBS içinde% 0.1 tripan mavisi 90 ul hücre süspansiyonu, 10 ul seyreltilir. hemasitometre kenarında oluğa çözüm pipetleme hemasitometre üzerine tripan mavi hücrelerin 10 ul yerleştirin. olarak biraz daha küçük görünür eritrosit, yuvarlak, kırmızı-renkli hücreleri ve mavi ölü / ölüyor hücreleri yok sayarak, hemasitometre merkezi ızgara beyaz kan hücreleri saymak. Seyreltme faktörü (10) ile, 10, ⁴ ile sayılan hücreler sayısını çarpın ve hücreler (10 mi) hacimce 50 ml santrifüj tüpü içinde toplanmıştır hücrelerin toplam sayısını belirler.
   11. CD4 + T hücreleri için zenginleştirmek için, santrifüjHücreler pelet ve yaklaşık 1 ug / ml anti-CD8 (klon 3,155), 1 ug / ml anti-MHC Sınıf II (klon M5 / 114) ve 1 ug ihtiva eden bir çözelti içinde 2x10 ⁷ hücre / ml'de tekrar süspansiyon hücreleri / hafifçe pipetleme HBSS +% 2 NCS ml anti-CD24 (klon J11d) antikorları.
       NOT: Bu aşamada kullanılan antikorlar, hibridoma hücre hatları içi elde edilir ve konsantrasyon yaklaştırılır. Kompleman lizis için ideal olan bu antikorların konsantrasyonu ve hacim ampirik olarak tespit edilmiş ve laboratuarlar arasında değişecektir. Seçenek olarak ise, bir çok piyasada mevcut kitleri saf CD4 + T hücrelerinin saflaştırılması için kullanılabilir ve burada temsil edilen tamamlayıcı lisisinin ve CD62L + saflaştırma işlemi için ikame edilebilir. naif CD4 + T hücrelerinin saflaştırılması için bir yöntem kullanılarak, bu protokolün adım 1.2 arasında devam edilebilir.
   12. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bu kuluçkalamanın sonunda, hızlı bir şekilde, bir 37 ° C su b yerleştirerek guinea domuz tamamlayıcısı çözülmeyaklaşık 2 dakika boyunca ATH. Hücre süspansiyonu doğrudan tamamlayıcı pipetleme antikor çözeltisi içinde hücrelerin her 1 ml tamamlayıcı 100 ul ekle. 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde hücreleri inkübe edin.
   13. santrifüj tüpüne, 20 ml toplam hacim hücreleri getirmek için HBSS +% 2 NCS ekleyin. hücreler altında RT yoğunluk santrifüj ortam 8 ml (yoğunluk 1.086 g / ml) içinde tabaka. Hemen santrifüj Fren kapalı olarak 15 dakika süre ile, oda sıcaklığında 1400 x g'de hücreleri santrifüj.
   14. Yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne serolojik bir pipet ve transfer hücreleri kullanılarak Ara yüzeydeki hücreleri toplamak. HBSS +% 2 NCS ve santrifüjleme ile 50 ml santrifüj tüpü içinde hacim getirerek hücreleri yıkayın.
   15. MACS tamponu hücrelerin tekrar yavaşça pipetleme ve aşama 1.1.10 olarak, daha önce sayı ile (PBS,% 2, NCS ve 2 mM EDTA ile takviye edilmiş).
   16. Bir çözelti içinde 2x10 ⁷ hücre / ml'de tekrar süspansiyon hücreleri, saf CD4 + T hücreleri için zenginleştirilmesiAşama 1.1.16 sayılmıştır sayısına göre, MACS tamponunda 2.5 | ig / ml biyotin-konjuge edilmiş anti-CD62L antikoru, bir. Buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin.
   17. Daha sonra hücreler, 10 ml MACS tamponu eklenerek santrifüj hücreleri yıkanır. MACS tamponu 10 ⁷ hücre / 100 ul hücreleri yeniden süspanse edin ve hücreleri, doğrudan 1:10 seyreltide streptavidin-konjuge manyetik ayırma boncuklar ekleyin. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   18. 500 ul bir minimum hacimde aşama 1.1.17 olarak, daha önce olduğu gibi hücreler yıkanır ve MACS tamponunda 2x10 ⁸ hücre / ml'de tekrar süspansiyon hücreleri.
   19. mıknatıs tutucu bir manyetik ayırma sütunu yerleştirin ve 3 ml MACS tamponunda akışı sağlayarak sütun yıkayın. bir pipet ile kolona hücreler uygulanır.
   20. 3 ml MACS kolona tamponu pipetle ve MACS tamponu dolaşmasını ve 3 kez tekrarlayın izin vererek manyetik sütuna bağlı değildir hücreleri çıkarmak için sütun yıkayın. kesir akışını atın.
   21. remove manyetik stand sütun ve yeni bir 50 ml santrifüj tüpü üzerinde tutun. Pipet 5 sütun üzerine MACS tamponu ml ve MACS sütun bağlı hücreleri serbest ve zenginleştirilmiş naif CD4 T hücreleri içeren akışı toplamak için kolon boyunca tampon itmek için kolon ile kapalı piston kullanın.
   22. Santrifüj 10 mi RPMI hücreleri ve tekrar süspansiyon% 10 fetal buzağı serumu (FCS), 100 lU / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş ve 50 uM 2-merkaptoetanol (RPMI-10). Adım 1.1.10 yılında, daha önce olduğu gibi hücreleri saymak.
   23. RPMI-10 içinde 6x10 ⁵ / ml saf CD4 + T hücrelerinin nihai konsantrasyonu ayarlayın.
2. T hücre-tükenmiş dalak APC arındırmak
   1. Aşama 1.1.1 gibi bir 6-8 haftalık dişi vahşi tip BALB / C fare öldürülür.
   2. % 70 etanol çözeltisi ile fare Sprey ve farenin abdome sol tarafında yaklaşık 3 cm'lik bir kesi yaparak dalak maruzn. periton katman açılır kesin ve forseps ile yavaşça tutup bir cerrahi makas ile yatan bağlantı dokudan uzak keserek dalak çıkarın.
   3. HBSS +% 2 NCS 8 ml dalak yerleştirin.
   4. adımda, daha önce olduğu gibi, dalak ezme ile tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak yıkama ve hücre sayımı 1.1.7-1.1.10
   5. Pelet 5 dakika boyunca 600 x g'de hücreleri eğirme T hücrelerinin tüketilmesi, yavaşça pipetleme / ml anti-Thy1.2 antikoru (J1J klonu), yaklaşık 1 ug çözeltisi içinde 2x10 ⁷ hücreleri yeniden süspanse edin. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe hücreleri.
      NOT: Bu antikor, bir hibridom hücre çizgisinden içi elde edildi ve concentraton yaklaşılır. Kompleman parçalanması bu antikor ideal konsantrasyonu ve hacim ampirik olarak tespit edilmiş ve laboratuarlar arasında değişecektir. İstenirse dalak saflaştırmak APC 'için diğer yöntemler ikame edilebilir. Naiv T hücreleri ve APC 'ler kült hazırlanmalıdırAdım 1.3 ure.
   6. , Kobay tamamlayıcı ekle inkübe ve adımları 1.1.13-1.1.14 yılında, daha önce olduğu gibi bir yoğunluk santrifüj medya degrade hücreleri ayırın.
   7. RPMI-10 10 ml hücrelerin tekrar 25 Gy hücreleri radyasyona maruz olacak bir zaman süresi için bir gama ışınlayıcılar bir 50 ml santrifüj tüpüne hücreleri yerleştirerek APC'ler ışın tedavisi. Bu sürenin uzunluğu irradiator göre değişir ve hücreler ışınlanmış her zaman hesaplanacak gerekecektir.
   8. Aşama 1.1.10 olarak, daha önce olduğu gibi, bir hemasitometre hücre sayımı ve RPMI-10 2.4x10 ⁶ hücre / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar APC hücrelerinin ayarlayın.
3. hücreleri uyarmak ve 5-günlük kültür Th1 fenotipine CD4 T hücreleri ayırt.
   Not: Burada saf CD4 + T hücrelerinin elde Th1 efektörleri hazırlanması ve görüntüleme için bir protokol mevcut olsa da, bu protokol, farklı bir fenotipe naif hücreleri ayırt etmek için ayarlanabilir veya tO CD8 T hücreleri gibi diğer hücre tipleri, kullanın. Astarlama ve farklılaşması için koşullar ampirik olarak tespit edilmesi gerekir.
   1. 24 oyuklu kültür çanağı her bir gözündeki bir 3x10 ⁵ T hücrelerinin toplamı 1.2x10 oyuk başına ⁶ APCler için, saf CD4 + T hücrelerinin 500 ul her bir göze ışınlanmış APC '500 ul birleştirir.
   2. 2 uM aynı kökenli OVA peptidi, 20 U / mL rekombinant IL-2, 80 ug / ml anti-IL-4 (klon 11B11) ve 40 ng / ml yeniden birleştirici IL-12 ve filtre kullanılarak 0.2 içeren RPMI-10 içinde çözelti hazırlayın mikron şırınga filtresi. her bir 2 ml'lik toplam hacmi için, hücreler, her sıra için, bu çözeltinin 1 ml ekleyin.
   3. 3 gün boyunca% 5 _CO2 seviyesinde 37 ° C inkübatör hücreleri inkübe edin.
   4. 3 gün, yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri için pipetle ve iyi bir yeni kültürün içine her kuyudan 1 ml hareket ettirerek kültürleri ayrıldı. 1 ml / eklemeler de bir RPMI-10 2 ml'lik bir nihai hacme kadar her bir getirmek +, 20 U / ml rekombinant IL-2.
   5. inkübatör plakaları dönün ve hücreler 5. gün kadar genişletilmesine izin verir.

2. Hücre Transferi ve Enflamasyon indüksiyonu

Not: görüntüleme için optimum hücre numaraları için, 5x10 ⁶ floresan etiketli Th1 hücreleri, 200 ul PBS bir toplam hacimde her bir fare transfer edilmelidir. diğer hücre izleyici boyalar kullanılabilir olmasına rağmen, hücreler, burada yeşil boya CFSE veya yakın kırmızı boya CMTMR ile etiketlenir. CFSE, ve CMTMR-etiketli hücreler iki farklı efektör CD4 popülasyonlarının takip sağlamak için birlikte aktarılabilir.

1. CFSE ile etiket efektör T hücreleri
   1. kuvvetle Her bir gözdeki hücrelerin pipetle bir pipet steril bir 50 ml santrifüj tüpüne aktarılarak kültür kaplarından hücreler hasat edilir. Aşama 1.1.10, o zaman santrifüj gibi hücre sayımı ve PBS +% 5 NCS 10 ⁷ hücre / ml'de tekrar süspansiyon hücreleri.
   2. 5 mM stok KAKE çözümü 1 seyreltin: 100 yılındaPBS ile yıkandı. tüp tarafında CFSE solüsyondan bir damla yerleştirilmesi ve daha sonra hızlı bir şekilde iyice karıştırın ileri ve geri tüp sallanmasıyla hücrelerin her biri 1 ml 110 ul CFSE solüsyonu ekleyin.
   3. hücrelerin borunun doğrudan fetal dana serumu (FCS), 5 ml ekleyerek CFSE söndürme, daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe hücreleri. PBS +% 5 NCS 50 ml hacim getirin.
   4. hücreleri Santrifüj ve 20 ml PBS +% 5 NCS içinde pelletini. 3 kez toplam hücreleri yıkamak için bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Aşama 1.1.10 olarak, daha önce olduğu gibi, bir hemasitometre hücre sayımı ve farelere transferi için 2.5 x 10 ⁷ hücre / ml olacak şekilde steril PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
2. CMTMR etiket efektör T hücreleri
   1. Adım 2.1.1 yukarıdaki gibi hücreler hasat, daha sonra saymak, santrifüj ve RPMI-10 10 ⁷ hücre / ml hücreleri tekrar süspansiyon.
   2. 10 uM'lik bir son konsantrasyon için hücrelere doğrudan 10 mM CMTMR stok solüsyonu ekleyin. Hızla pipet inciE hücreleri iyice CMTMR karıştırın ve boya çökelmesini önlemek için.
   3. 37 ° C su banyosu içinde 30 dakika inkübe edin. Yıkama hücreleri adım 2.1.3-2.1.4 yılında, daha önce olduğu gibi PBS +% 5 NCS 3x. Sayın ve farelere transferi için 2.5x10 steril PBS ⁷ hücre / ml hücre yeniden süspanse edin.
3. Aktarım efektör T hücreleri, 6-8 haftalık dişi BALB / c fareleri naiv.
   1. Gerekirse, hafifçe şırınganın tarafını Flicking, şırınga iğnesi yan-up tutarak yukarı ve aşağı pistonu hareket ettirerek tüm kabarcıklarını çıkarmak için özen, bir şırınga içine hücre süspansiyonu (adım 2.1.4 veya 2.2.3) çizmek .
   2. Kuyruk veni vasodilated görünene kadar yavaşça bir ısı lambası altında temiz bir kafes içinde fare ve ısı yerleştirin. frenleyici bir cihaz fare yerleştirin ve alkollü bir bezle kuyruk silin. Yavaş yavaş yan kuyruk damar içine hücre süspansiyonu 200 ul enjekte edilir. deri altına enjeksiyon veya görünür köpüren hiçbir direnç olmamalıdır.
4. Tam Freund katkı maddesi ile immünizasyon dermal enflamasyonu (CFA)
   Not: CFA ortak kökenli olan veya olmayan aynı kökenli ya da antijen ile emülsiyon haline getirilmiş, bu protokolde, inflamasyon intradermal enjeksiyon yolu ile indüklenir. aktarım ve görüntüleme zamanı için gerekli olan hücre sayısı deneysel olarak ayarlanması gerekir ancak diğer iltihabik modellerde, ikame edilmiş olabilir.
   1. mikrosantrifüj tüpü içinde, steril PBS içinde OVA peptidinin 200 uM çözeltisi hazırlayın. Pipet peptid çözeltisinin üzerine CFA eşdeğer hacim.
   2. Daha sonra yaklaşık 20 kez bu eylemi tekrarlayarak, 28 G1 / 2 insülin şırınga içine çekme ve sonra tekrar mikrosantrifüj tüpe çözüm daldırarak çözüm emülsifiye. Tamamen emülsifiye zaman CFA ve peptid çözüm kalın ve opak karışım oluşturacak.
      NOT: emülsiyon sabit olmayan needl ölü alan kaybolacak şekilde, emülsiyonun oluşturulması için bir sabit iğne insülin şırınga kullanmak esastıre şırınga.
   3. bir petri kabına yerleştirilir su üzerine az miktarda bırakarak emülsiyon edin. Emülsiyon bozulmadan kalır ve su içine dağıtmak gerekir.
   4. 300 ul 28 G1 / 2 insülin şırınga içine emülsiyonu çizin ve büyük hava kabarcıklarını çıkarmak için pistonu keskin bastırın.
   5. Hemen floresan efektör T hücreleri etiketli Aktarma işleminden sonra, 240 mg / kg 2,2,2-tribromoetanol IP enjeksiyonu ile fareler anestezi. Gerekirse, 1 mg artışlarla daha 2,2,2-tribromoethanol uygulanmasını, hafif bir ayak tutam tarafından anestezi değerlendirin.
      NOT: Diğer onaylı anestezikler 2,2,2-tribromoethanol için ikame edilebilir.
   6. sol işaret parmağında bir yüksük yerleştirin ve dikkatli ventral kulak yukarı bakacak şekilde sol başparmak ve işaret parmağı arasında farenin kulak kavramak. cilde mekanik hasara neden olabilir kulak üzerinde aşırı baskı uygulamak için değil emin olun.
   7. CFA e içeren iğne kaydırındermise emülsiyon, konik tarafı yukarı bakacak ve yavaş yavaş kulak içine emülsiyon 10 ul enjekte edilir. Enjeksiyon yerleştirilmesi uygun görüntüleme sağlamak için merkezden biraz kaçık olan, kulak kepçesi dış 1/3 olmalıdır.
   8. Anestezi kapalı yıpranmış ve fareler kendilerini düzeltmek mümkün ve ayaktan kadar fareler izleyin. Görüntü fareler kulak dermis trafik transfer T hücrelerini geliştirmek için iltihap için zaman sağlamak ve aşılamanın ardından 3 gün.
      NOT: anestezi altında iken Fareler her zaman sahipsiz bırakılamaz.

3. Görüntüleme için Fare Hazırlama

1. bir kateter hazırlayın
   1. Dikkatle pense ile 30 G1 / 2 Tüberkülin (TB) şırınga iğnesi metal iğne kaldırmak ve tutkal tamamen kaldırıldığını görselleştirmek için bir diseksiyon kapsamı kullanarak, herhangi bir aşırı tutkal temizleyin.
   2. Kalan iğne hala p sağlamak, başka bir 30 G1 / 2 TB şırınga iğnesi kapalı ucu kesilmişgörsel inceleme ile atent. kesilmiş iğne üzerine PE-10 tıbbi borunun bir 18 cm parça kayma ve dikkatle kateter yaratarak, hortumun diğer ucunu çıplak metal iğne, yaklaşık 5 mm yerleştirin.
2. , Steril PBS ile 1 ml TB şırınga dolum hava kabarcıklarını kaldırarak kateteri yıkayın. Yavaşça şırınganın ucunda kateter yerleştirin ve kateter tüp herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için olsa nazikçe PBS itin.
   Not: kateterden sıvı iterek, bunun şırınga dışı kateter iterek sıvı basıncı önlemek için şırınga kateteri tutmak için gereklidir.
3. Kuyruk veni vasodilated görünene kadar yavaşça bir ısı lambası altında temiz bir kafes içinde fare ve ısı yerleştirin. izofluran buharlaştırıcı bağlı olmuştur roket ucu konisi montaj yoluyla teslim (2 L / dk akış hızı,% 5 indüksiyon,% 1-2 bakım) oda havası ve izofluran karışımı ile fare anestezisi. Fare wi anestezi olduğundan emin olunnazik bir ayak tutam th. hareket gözlenmesi halinde aşamalı olarak% 0,1 izofluran akış oranını artırmak. Fare anestezi sırasında kurumasını ve yaralanmayı önlemek için oftalmik merhem gözleri örtün.
   NOT: Bu fareler anestezi sırasında gözetimsiz bırakılmamalıdır asla esastır. Fareler sık ​​sık yumuşak ayak tutam tarafından yeterli anestezi açısından takip edilmelidir.
4. forseps bir çift ile üssünde kuyruk hareketsiz ve daha sonra alkollü bir bezle kuyruk silin. Dikkatle lateral kuyruk damar içine kateter kaydırın ve yavaşça şırınga pistonu iterek açıklığını kontrol edin. o uygun şekilde yerleştirilmiş ise hareket ve deri altında PBS hiçbir görünür köpüren hiçbir direnç olmamalıdır. enjeksiyon yerinde siyanoakrilat doku yapıştırıcısı 1-2 damla uygulayarak kuyruk kateter Yapıştırmayın ve yaklaşık 30 sn kurumasını bekleyin.
5. Dikkatle sk zarar vermemeye dikkat ederek, bir makas ile kulak arkasında ve yanlarında gelen saç kesmeiçinde. de bıyıkları kesin. bir pamuklu çubuk kullanarak, PBS ile kulağın iç yüzeyini nemlendirmek.
6. 24 x 50 mm No. 1.5 cam kapak slip üzerine fare ve kulak döndürün. Forseps kullanarak, hafifçe kulak cam ile aynı hizada olduğundan emin olmak için gerekirse fareyi hareket ettirerek, kapak kayma üzerine kulak dümdüz. bir doku silin hafifçe blot kulağa aşırı PBS kaldırmak.
   NOT: ince deri kolayca aşırı basınç zarar gibi, kulağa çok sıkı bir şekilde basmamaya dikkat edin.
7. kavisli bir forseps iki çift kullanarak, uzunlamasına üst köşelerinde kumaş bant yaklaşık 20 mm uzunluğunda bir parça kavramak. Farenin kulak üstündeki lamel üzerine bant alt kısmına yerleştirin ve lamel kulak tutturmak için gerekirse forseps ile yolumdan aşırı saç iterek, kulak geri kalanı üzerinde bant rulo. Yavaşça kulağa kendisi basmamaya özen sıkı bir mühür sağlamak için kuru bir pamuklu çubukla kulak çevresinde kasete basın.
8. Yapışkan bant ile 37 ° C bir ısıtma bloğu Görüntüleme platformu takın. görüntüleme platformu kulak alanının her iki tarafında vakum gres sürün. keçe merkezinde kulak hizalamak için özen görüntüleme platformu üzerine lamel yerleştirmek için fareyi döndürün.
   NOT: Bu cam kapak kayma ayrılmış gelmek için neden olacağından, kasete vakum gres kaçının.
9. roket ucu konisi güvenli olmasını sağlamak ve tamamen farenin burnunu kapsayan görüntüleme platformu üzerinde tutucu içine izofluran Roket ucu konisi oturtun. sıkıca ama dikkatli bir şekilde temiz, kuru bir pamuklu çubukla görüntüleme platformu üzerine lamel basarak lamel altında vakum gres sürün.
10. bant iki adet 20 mm parçalar ve platformun üst bölümü sarılı bant iki uzun parça ile platforma lamel yapıştırın. hava kabarcıklarının kulak ve kapak arasında mevcut ise, yavaşça wi aşağıdaki kulak basılarak çıkarılabilirkatlanmış bir kağıt parçası inci.
    NOT: çok kalın ya da sıkıca basın kağıt kullanmak değil esastır, bu doku sonuçlarını komplike, haşlama ve zarar görebilir olarak.
11. Mikroskop sahneye için fareyi hareket ettirin ve yapışkan bantla platformu sabitleyin. kulak çevresinde lamel üzerine boru vakum gres bir çift katmanlı suya daldırma hedefi için bir rezervuar olarak hizmet vermektedir.
12. görüntüleme platformu aracılığıyla fare etrafında bir su dolu ısıtma battaniye sarın. 37 ° C damıtık su ile doldurun. Her şey yapışkan bant ile sahneye ve kateter şırınga kolayca erişilebilir olduğu sabitlendiğinden emin olun.

Vivo Time-lapse Görüntüleme ve İntravenöz Antikor İdaresi 4.

NOT: Sa lazer sistemi: Bu protokol, Ti ile donatılmış bir multiphoton mikroskop kullanılmasını gerektirir. kullanılan objektif bir nesne ile yapıştırılmış 1.05 NA ile 25x büyütme objektif olduğunuive ısıtıcısı 40 ° C'ye ayarlayın. Bu ısıtıcı için optimum sıcaklık, 37 ° C 'de, kulak dermiş korumak için uygun sıcaklık için ampirik bir şekilde tespit edilmiş ve diğer görüntüleme sistemlerinde kullanım için ayarlanması gerekebilir. protokole araçlar ve ayarlamalar arasında değişebilir kullanılan kazanım yazılım farklı yapılandırılmış sistemleri üzerinde çalışmak için yapılması gerekebilir. çizimin istenilen analiz yazılımı ile uyumlu bir biçimde kaydedilebilir emin olun.

1. kulağın merkezi üzerinde hedefi konumlandırma ve rezervuar içinde kişileri sadece kadar su yüzeyine hedefini düşürerek göz mercekleri ile dermis bulun. Harici ışık kaynağı kullanarak, göz mercekleri ile bakmak ve kulak yüzey odak noktası haline gelene kadar yavaş yavaş hedefe düşürmek için devam ediyor. mikroskop sahne etrafında iç ve dış perdeleri indirin.
2. mikroskop ayarlarını belirlemek ve görüntüleme için bir alan bulmak
   1. IMAGin önceg, 900 MP Lazer Kontrol penceresinde nm, Toplama ortamda lazer gücü lazer dalga boyu ayarlayarak istenilen fluorophores maksimal uyarma ve algılama için lazer yapılandırın: Lazer penceresinde, ve Image Acquisition Kontrol penceresinde PMT gerilimleri .
      Not: Bu işlem, ikinci harmonik üretiminin (420-460 nm), CFSE (495-540 nm) ve CMTMR (575-630 nm) tespit etmek için filtreler ile 900 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu kullanılır. Diğer düzenlemeler, istenen farklı florofor tespit etmek için kullanılabilir.
   2. Toplama ortamda 2 mikro-sn / piksel bekleme süresi ile, 512 x 512 piksel çözünürlükte mikroskop ayarlayın: Boyut ve Mod pencereler. "XY tekrarını" tıklayarak görüntüye bir alan için doku yoluyla taramaya izin vermek için canlı bir görüntüleme modunu etkinleştirin. İdeal olarak, bölge hava kabarcığı olmadan, nispeten homojen olmalı ve yoğun saç köklerinin alanları kaçınarak olmalıdır.
      NOT: CFA emülsiyonu yeşil ve Brugge yakınındaki parlak autofluorescent olduğunuKanal ar-kırmızı ve kaçınılmalıdır. Optimal bir alan genellikle emülsiyon kenarından yaklaşık 3 mm bulunabilir. Yaklaşık 10-100 hücreleri tek bir görüntü izlenebilir. Çok sayıda hücre varsa, izleme yazılımları kısaltılmış ve / veya hatalı hücre parçaları lider, yakından bulunduğu hücreleri ayırmak için çalışırken hatalarla genellikle olacaktır.
   3. Uygun bir görüntüleme alanı bulunan edildikten sonra, "Set 0" butonuna tıklayarak 0 Z-pozisyon ayarı ve Z aşağı kaydırma, dermis hücreyi "en yüksek" bularak yansıması olacaktır Z bölgesini belirlemek yön hücre derinliği derecesini ölçmek için. 35-75 um bir görüntüleme derinliği tipiktir. Mikroskop penceresinde: Toplama Ayarı başlangıç ​​ve bitiş pozisyonları ayarlayın. görüntüleme alan derinliği boyunca hücrelerin görselleştirme optimize etmek için "parlak Z" penceresinde enstrüman PMT gerilim ve lazer gücünü ayarlayın.
      NOT: las kaldırmaktan kaçınınnumunenin 25 mW üzerinde er gücü, yüksek güç seviyesi dermis ısı hasarı ve steril yaralanmalara neden olabilir. Her mikroskop için uygun maksimum güç seviyesi değişir ve ölçülen gerekecektir. Doku derinliği ile lazer güç veya PMT gerilimler artan alım sonrası analizinde farklı derinliklerde görüntü parlaklığı nicel karşılaştırma için izin vermez dikkat edilmelidir.
   4. Görüntü Alma Denetimi penceresindeki "Scan" butonuna altındaki "Derinlik" ve "Zaman" düğmeleri kontrol edin. Filtre Mod penceresi ve Image Acquisition Z-dilim derinliğini ayarlamak: Görüntü Alma Kontrol Görüntüyü her satırda 3 kez taramak için bir Kalman filtresi ayarlayın tam bir yığın yakalamak için yaklaşık 1 dakika sürer ve böylece belirtildiği gibi, Mikroskop pencere TimeView penceresinde.
      NOT: uzun aralıklarla hızla göç hücrelerin izlemeyi önlemek olarak yığınlar arasındaki aralık, yaklaşık 1 dakika daha uzun sürmez. th bağlıHücrelerin e tipi görüntülü, bu aralık analiz yazılımı tarafından uygun hücre izleme için izin vermek için ayarlanması gerekebilir. Z dilimleri fazla 5 um olmalıdır. Genel olarak, kalın 2-5 um arasında 15-18 Z dilimler 1 dakika görüntüleme aralığı için uygundur.
3. Önceden antikor zaman atlamalı görüntü yakalamak
   1. Toplama ortamda "5" ile tekrar sayısını belirleyerek doku istikrarı değerlendirmek için alanın 5 dk time-lapse görüntü yakalamak: TimeScan pencere ve "Scan" butonuna tıklayarak.
      NOT: Doku "sürüklenme" kulak termal dengeye, yoksul kulak hazırlık ulaşmak için, ya da kulağın bir bölgede yerel sürüklenme nedeniyle olabilir için yeterli zaman izin vermiyor neden olabilir. 5 dk görüntü kararlı, görüntü dermiste yeni bölge değilse. Yeni bir bölgede ikinci bir görüntü kararsız kalırsa, dikkatli bir taze cov ile adım 3,6 kulak hazırlık ve görüntüleme tekrarlamak için en iyisierslip.
   2. Doku 5 dk görüntüde stabil ise, Toplama Setting 30 ila 45 tekrar sayısını belirleyerek bir 30-45 dk time-lapse görüntü toplamak: TimeScan pencere, görüntü olarak herhangi bir küçük doku sürüklenme için izleme toplanmış. kullanılacak analiz yazılımı ile uyumlu bir biçimde dosyayı kaydedin.
      NOT: - 4.3.2 aynı kulakta görüntü birden fazla yere tekrar edilebilir protokolde Bu noktada, 4.2.2 yineleyin. Ölüm oluşma olasılığı daha yüksektir olduğu gibi tek bir fare, daha uzun 4 saat anestezi tutulur edilmemelidir.
4. engelleme antikorlar enjekte edilir ve bir post-antikor görüntüyü yakalamak.
   1. 1 ml TB şırınganın içine antikor karışımı çizin ve tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için emin olun, iğneyi çıkar. pistonu basın, böylece antikor çözeltisi şırınga sonunda "damlacık" oluşturur.
   2. sahne etrafında perdeleri kaldırın ve kateter bulun. Orijinal PBS-conta Kaldırkateterden adencilik şırınga. aşağı kateter koymadan, dikkatle antikorları içeren yeni şırınga takın. şırınga üzerine kateterin ucunu tutun ve yavaşça kateter içine antikor karışımı enjekte edilir. Enjeksiyon için hiçbir direnç olmadığından emin olun.
   3. aşağı kateter ayarlayın ve mikroskop sahne çevreleyen perdeleri indirin. enjeksiyon zaman unutmayın ve hemen öncesi antikor görüntü olarak aynı cihaz ayarları kullanarak aynı konumda yeni bir 20-40 dk görüntüleme sırasını toplamaya başlar. analiz yazılımı kullanılabilmesi için uygun bir formatta dosyayı kaydedin.
      NOT: Time-lapse görüntüleri arasında yeterli anestezi ve solunum için fare gözlemlemek. antikorun klirens değişken oranları olabilir gibi, antikorların uygulanmasını izleyen birden fazla alan görüntüye tavsiye edilmez.
5. , Kan damarları bulmak kateter açıklığını değerlendirmek, ve b ölçmek için floresan etiketli dekstran enjekteLood damar geçirgenliği
   1. 100 ul floresan konjuge dekstran (70,000 MW), steril PBS, 2 mg / ml solüsyon hazırlamak ve hava kabarcıklarını kaldırma bir şırınga içine çeker.
   2. Aşama 4.4.1-4.4.2 aynı teknik kullanılarak, kateter üzerine şırınga, intravenöz dekstran solüsyonu enjekte edilir.
   3. Time-lapse görüntüler için aynı PMT ve lazer ayarları ile, Mod penceresinde: Toplama Ayarı çözünürlüğü değiştirerek 1024 x 1024 piksel çözünürlükte bir tek yığını yakalayın. görüntü toplamak için, "Tarama" butonuna altındaki "Zaman" düğmesini kaldırın ve ardından "Scan" butonuna tıklayarak. Bu 3D görüntü damarsal bulunan dışlama T hücreleri için izin ve kateter patent ve doğru şekilde takıldığından gösterecektir. damarlarının ışıklı dekstran yayılması, aynı zamanda, yerel damar geçirgenliğini değerlendirmek için de kullanılabilir.
      Not: Bu yüksek çözünürlüklü (1024 x 1024) statik görüntü pr için kullanılıresentation amaçları ve buna ek olarak zaman atlamalı görüntüler olarak aynı bölgede doku yapısının analizi için kullanılabilir edilebilir. Alternatif olarak, bir 512 x 512 görüntü görüntü analiz yazılımı kullanılarak time-lapse görüntüleri ile birleştirilebilir, hangi alınabilir. dekstran yönetiminin Zaman atlamalı görüntüleme bireysel laboratuarları araştırma ihtiyaçlarına bağlı olarak, arzu edilebilir. Bu durumda, görüntü adımlarda 4.2.3-4.3.2 gibi kurulmalıdır.
6. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, dikkatlice hedefi altında fare kaldırmak ve su battaniye kakışıyor. bant kesme ve yavaşça ayrılana kadar cam kaldırarak görüntüleme platformu lamel çıkarın. fare hala anestezi edilirken, lamel kulak ayırın. Bu bir terminal prosedür olarak ise, servikal dislokasyon ile fare euthanize. Tekrarlanan görüntüleme için bu fare tasarrufu, diğer farelerin ayrı ve gözlemlemek temiz bir kafes geri verirse fare kendini sağa ve bir kadarayaktan. anestezi kurtarıldı sonra, fare, diğer hayvan bir kafes iade edilebilir.
7. bir görüntü analizi programına görüntüleme dosyalarını ve arzu edilen herhangi bir düzeltmeleri yapmak. Lineer olmayan geliştirmeleri ve otomatik düzeltme veya gürültü azaltma programları ve algoritmalar kaçınma önerilir. Tipik olarak, görüntüler elle analizden önce görüntünün siyah puan artarak sadece küçük bir arka plan düzeltme gerekir. Overstreet, Gaylo ve arkadaşları ³⁰ olarak, elle düzeltilmesi ile otomatik bir hücre izleme programı kullanılarak görüntüleme verileri analiz edin.
   NOT: Bu protokol türetilen multiphoton görüntüleri hücre dinamikleri ölçmek için kullanılabilir hem özel ve açık kaynak mevcut birçok görüntü analiz suit, vardır. Görüntü analiz kesin yöntem ve optimal yazılım paketleri tek tek laboratuvarların araştırma ihtiyaçlarına bağlı olacaktır kullanılacak.

Sonuçlar

Bağışıklık ortam değiştirmeden yerinde bağışıklık karşılıklarının çalışma yeteneği iltihaplı doku ile efektör T hücreleri gerçek zamanlı etkileşimlerin incelenmesinde gereklidir. Şekil 1A ve B belirtilen bu protokol ile sağlam kulak dermisin görüntüleme, dermal interstisyumda transfer floresan etiketli T efektör hücrelerin görselleştirme sağlar. Bu yüksek çözünürlüklü (Şekil 1C) ve ti...

Tartışmalar

önem

Burada olduğu gibi fare kulak dermis aktarıldı antijene özgü efektör Th1 hücrelerinin 4D görselleştirme için komple bir protokol mevcut. Bu yöntem, çeşitli nedenlerden dolayı bazı güncel görüntüleme yöntemleri üzerinde avantajlar sağlar. ventral kulak dermis görüntüleme, biz diğer cilt siteleri içeren görüntüleme protokolleri için gerekli olan epilasyon vazgeçmek mümkün. Depilatuvarlar genellikle hafif olsa da, bu, cilt bariyeri ⁴² ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mice	Jackson Laboratories	000651	Mice used were bred in-house
DO11.10 mice	Jackson Laboratories	003303	Mice used were bred in-house
HBSS	Fisher	10-013-CV	Multiple Equivalent
Newborn Calf Serum (NCS)	Thermo/HyClone	SH30118.03	Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes
Guinea Pig Complement	Cedarlane	CL-5000
anti-CD8 antibody	ATCC	3.155 (ATCC TIB-211)	Antibodies derived from  this hybridoma
anti-MHC Class II antibody	ATCC	M5/114.15.2 (ATCC TIB-120)	Antibodies derived from  this hybridoma
anti-CD24 antibody	ATCC	J11d.2 (ATCC TIB-183)	Antibodies derived from  this hybridoma
anti-Thy1.2 antibody	ATCC	J1j.10 (ATCC TIB-184)	Antibodies derived from  this hybridoma
Ficoll (Fico/Lite-LM)	Atlanta Biologicals	I40650
PBS	Fisher	21-040-CV	Multiple Equivalent
EDTA	Fisher	15323591
biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14)	BD	553149
streptavidin magnetic separation beads	Miltenyi	130-048-101
MACS LS Separation Column	Miltenyi	130-042-401
recombinant human IL-2	Peprotech	200-02
recombinant mouse IL-4	Peprotech	214-14
recombinant mouse IL-12	Peprotech	210-12
anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2)	eBioscience	16-7311-85
anti-IL-4 antibody (clone 11b11)	eBioscience	16-7041-85
RPMI	VWR	45000-412
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15303641
L-glutamine	Fisher	15323671
2-mercaptoethanol	Bio-Rad	161-0710
ovalbumin peptide	Biopeptide		ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo/HyClone	SV30014.03	Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes
24-well culture plate	LPS	3526	Multiple Equivalent
CFSE	Life Technologies	C34554
CMTMR	Life Technologies	C2927
28 G1/2 insulin syringes, 1ml	BD	329420
28 G1/2 insulin syringes, 300μl	BD	309301
27 G1/2 TB syringes, 1ml	BD	309623
30 G1/2 needles	BD	305106
PE-10 medical tubing	BD	427400
cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
heating plate	WPI	61830
Heating plate controller	WPI	ATC-2000
Water blanket controller	Gaymar	TP500	No longer in production, newer equivalent available
water blanket	Kent Scientific	TP3E
Isoflurane vaporizer	LEI Medical	Isotec 4	No longer in production, newer equivalent available
isoflurane	Henry Schein		Ordered through Veterinary staff
microcentrifuge tubes	VWR	20170-038	Multiple Equivalent
medical tape	3M	1538-0
isoflurane nosecone			Built In-house, see Fig 2
imaging platform			Built In-house, see Fig 2
curved forceps	WPI	15915-G	Multiple Equivalent
scissors	Roboz	RS-6802	Multiple Equivalent
glass coverslips	VWR		Multiple Equivalent
high vacuum grease	Fisher	146355D
cotton swabs			Multiple Equivalent
delicate task wipes	Fisher	34155	Multiple Equivalent
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Olympus		call for quote
optical table with vibration control	Newport		call for quote
25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging	Olympus	XLPLN25XWMP2
objective heater	Bioptechs	PN 150815
Detection filter cube	Olympus	FV10-MRVGR/XR	Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics
anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1)	eBioscience	16-0291-85	Azide free, low endotoxin
anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3)	eBioscience	16-0611-82	Azide free, low endotoxin
Texas Red Dextran (70,000 MW)	Life Technologies	D-1830