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요약

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

초록

이펙터 기능을 수행하는 CD4 T 세포의 능력은 같은 아직 정의되지 않은 메카니즘을 통해 염증 말초 조직에서 이들 세포를 신속하고 효율적인 이동에 의존한다. 면역계 연구에 다 광자 현미경의 적용은 그대로 조직 내 면역 반응의 동역학을 측정하는 도구를 제공한다. 여기에서 우리는 염증 마우스 귀 진피에 CD4 T 세포의 비 침습적 생체 내에 광자 이미징을위한 프로토콜을 제시한다. 맞춤 이미징 플랫폼을 이용하여 정맥 카테터 운동성에 관여하는 중요한 분자 성분에 대한 항체를 차단의 추가를 통해 실시간으로 이러한 세포를 심문하는 기능, 진피 간질에서 CD4 T 세포 역학 시각화 가능하다. 이 시스템은 체외 모델과 외과 적 침습 이미징 절차 둘다 장점을 제공한다. 운동에 대한 CD4 T 세포에 의해 사용되는 경로를 이해하는 것은 궁극적으로 BASI에 대한 통찰력을 제공 할 수있다C의 CD4 T 세포의 기능뿐만 아니라 만성 감염에서 양자 면역 질환의 발병 기전 및 병리.

서문

The effector function of CD4 T cells is critically dependent on their ability to rapidly enter and traverse a wide variety of peripheral tissues to survey for damage, locate foci of infection, or cause pathology from chronic infection or autoimmunity. While the processes of homing to inflamed sites1-4 and extravasation5-7 from the vasculature into tissues have been well-characterized, the factors that drive and regulate the interstitial motility of T cells remain undefined. The migration of T cells in complex 3D environments has been studied in vitro through the use of artificial matrices8-10 or microfluidic devices11,12, but these fail to recapitulate the complex and dynamic environment of an in vivo system. It is only recently, with the advent of high-resolution multi-color intravital imaging that it has become possible to study the dynamic behavior of immune cells in situ, allowing for a better understanding of intact immune responses.

Over a decade ago, several influential studies were published that first utilized multiphoton microscopy to address immunological questions. Early studies focused on the behavior of immune cells within explanted lymphoid organs13-16, which were soon followed by techniques to image exposed lymph nodes in anesthetized mice17. Imaging allowed for new fundamental observations about the stages of lymph node priming of T cells18, the mechanisms by which T cells migrate in secondary lymphoid organs19, T cell interactions with other immune cells20,21, and dynamic T cell positioning within the lymph node22. Although many early studies focused on lymph node dynamics, intravital imaging has been since been utilized to image the immune response in many peripheral tissues, including the brain23-25, liver26, lung27, and skin28-30.

The mouse ear dermis is particularly well poised for imaging, due to the thinness of ear skin, a relative lack of hair, and the ease with which it can be isolated from respiratory movements31. Indeed, the ear dermis has been used to image the interstitial behavior of dendritic cells32,33, T cells28,29,34,35, and neutrophils36,37, and is a well-established site for studying dermal inflammation. Increasingly, non-invasive procedures have been replacing surgical preparations of the skin, including split dermis38,39, flank39,40, or dorsal skin flap window39,41 models, that can induce changes to the local inflammatory milieu. The use of transferred, in vitro-primed, antigen-specific CD4 effector T cells allows for the study of a homogenous population of cells in the context of a dermal inflammatory response30. Here we describe a non-invasive imaging procedure that allows for the visualization of antigen-specific effector CD4 T cells in the dermal interstitium of the inflamed mouse ear, and the ability to manipulate these cells in real-time by introducing blocking antibodies through a venous catheter. We show that this model is effective for tracking the movement of CD4 T cells in the dermis and for querying the mechanisms that govern this motility.

프로토콜

마우스와 관련된 모든 절차는 로체스터 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을, 그리고 국립 연구소에 의해 관리되는 동물 복지법과 동물 애호 관리 및 실험 동물의 사용에 대한 공공 보건 서비스 정책을 엄격히 준수하여 수행 하였다 건강, 실험 동물 복지 사무소.

이펙터 CD4 T 세포의 제조 (1)

참고 : 특히 닭 계란의 난백 알부민에서 펩티드 (: ISQAVHAAHAEINEAGR의 pOVA)를 인식 BALB / C의 TCR 유전자 변형 DO11.10 마우스. 다른 TCR 형질 전환 시스템을 나타내는 곳의 pOVA 대신 적절한 동족 펩티드를 이용하여 치환 될 수있다.

  1. 순진한 CD4 T 세포를 정화
    1. 2 L에 노출시켜 6 ~ 8 주 된 여성 DO11.10 BALB / C 마우스를 안락사 / 분 CO 2는 마우스 이동이나 1 분 동안 호흡의 징후, 자궁 경부 전위 다음에, 또는에 따라 표시하지 않을 때까지지역 기관 동물 케어 및 사용위원회의 가이드 라인. 70 % 에탄올 용액으로 스프레이 마우스 복부 끝까지 2/3 마우스의 턱의 피부에서 약 7cm 절개를 만든다. 뒷다리 다리를 향해 복부 절개의 끝에서 2-3cm의 피부 절개를합니다. 복막으로 절단하지 않도록주의하십시오.
    2. 조심스럽게 부드럽게 집게로 잡아 당겨 복막에서 피부를 분리합니다. 사타구니 림프절은 몸 뒷다리의 교차점 근처의 피부에 있습니다. 잡고 2 % 신생아 혈청 (NCS)이 보충 된 HBSS 8 ㎖에 집게와 장소 당겨 제거합니다.
    3. 잡고 집게로 부드럽게 잡아 당겨 마우스에서 겨드랑이와 상완 림프절을 수확. 사타구니 림프절로 HBSS + 2 % NCS에 놓습니다.
    4. 구약과 HBSS + 2 % NCS에 집게와 장소 마우스의 목에있는 깊이와 표면 경부 림프절을 수확그녀의 림프절.
    5. 조심스럽게 창자로 절단 않도록주의하면서, 복막으로 잘라. 집게와 맹장과 결장을 잡고 그냥 콜론을 따라 위치한 장간막 림프절을 노출. 조심 포셉 장간막 림프절을 제거하고 다른 림프절로 놓는다.
    6. 복강에 비장을 찾아 조심스럽게 집게로 잡고 수술 가위로 멀리 결합 조직을 절단, 제거합니다. 림프절과 비장을 놓습니다.
    7. 60 X 15mm 배양 접시에 배치 된 금속 체에 비장 및 림프절을 함유하는 HBSS + 2 % NCS를 주입하여 단일 세포 현탁액을 준비한다. 조심스럽게 HBSS + 2 % NCS에 10 ML의 주사기에서 플런저와 금속 여과기를 통해 비장과 림프절을 매쉬.
    8. 피펫을 사용하여 깨끗한 50 ML의 원심 분리기 튜브에 세포 현탁액을 이동합니다. , HBSS + 2 % NCS의 추가로 10 ml의 U를 금속 여과기 및 배양 접시를 씻어피펫을 노래하고, 세포 현탁액과 같은 50 ㎖ 원심 분리 튜브에이 솔루션을 배치합니다.
    9. 5 분간 부드럽게 피펫 팅하여 10 ㎖의 HBSS + 2 % NCS에 재현 탁하고 세포 펠렛 600 XG에 세포를 스핀. 달리 명시되지 않는 한, 모든 원심 분리는 5 분 동안 600 × g으로 수행되어야한다.
    10. 1:10 희석 PBS 중 0.1 % 트리 판 블루 90 ㎕를 상기 세포 현탁액 10 μL 희석. 혈구의 가장자리의 홈에 상기 용액을 피펫 팅하여 혈구에 트리 판 블루 세포의 10 μl를 놓는다. 같은 약간 작은 표시 적혈구, 라운드, 빨강 색조 세포와 푸른 죽은 / 죽어가는 세포를 무시하고 혈구의 중심 그리드에서 백혈구를 계산합니다. 희석 인자 (10)에 의해, 10 (4)에 의해 카운트 된 세포의 수를 곱하고 셀 (10 ㎖)의 부피가 50 mL의 원심 분리 튜브에 수집 된 세포의 총 수를 결정한다.
    11. CD4 T 세포에 대한 풍부하게하기 위해 원심 분리기세포 펠렛은 약 1 μg의 / ㎖ 안티 CD8 (클론 3.155), 1 μg의 / ㎖ 안티 MHC 클래스 II (클론 M5 / 114), 및 1 μg의 함유 용액에 2 × 107 세포 / ㎖의 세포를 재현 탁하는 / 부드럽게 피펫으로 HBSS + 2 % NCS에서 ml의 항 CD24 (클론 J11d) 항체.
      주 :이 단계에서 사용되는 항체는 하이 브리 도마 세포주로부터 사내 유도되고 농도 근사화된다. 보수 용해에 적합 이러한 항체의 농도와 부피는 경험적으로 결정하고, 실험실 사이에 다릅니다. 대안 적으로, 여러 시판 키트 나이브 CD4 T 세포를 정제하여 사용할 수 있으며 여기에 표시되는 보체 용해 및 CD62L + 정제 공정을 대체 할 수있다. 나이브 CD4 T 세포를 정제하는 다른 방법을 사용한다면,이 프로토콜은 단계 120에서 계속 될 수있다.
    12. 30 분 동안 빙상에서 인큐베이션. 배양이 끝나면 신속하게 37 ° C의 물을 (B)에 배치하여 기니아 피그 보체를 해동약 2 분 동안 ATH. 세포 현탁액에 직접 보수 피펫 팅하여 항체 용액의 셀마다 1ml를위한 보체 100 ㎕를 추가한다. 30 분 동안 37 ° C의 수조에서 세포를 부화.
    13. 원심 분리기 튜브에서 20 ㎖ 총 부피로 세포를 가지고 HBSS + 2 % NCS를 추가한다. 셀 아래 RT 밀도 원심 분리 배지 8 ㎖ (밀도 1.086 g / ㎖)의 층을 포함한다. 즉시 원심 브레이크 오프로 15 분 동안 실온에서 1400 XG에 세포를 원심 분리기.
    14. 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 피펫 혈청 및 전송 세포를 사용하여 인터페이스에서 세포를 수집한다. HBSS + 2 % NCS 및 원심 분리와 50ml로 원심 분리 관에 볼륨을 가져와 세포를 씻으십시오.
    15. MACS 완충액에 세포를 재현 탁 부드럽게 피펫 팅 단계 1.1.10에 앞서 계산하여 (PBS 2 % NCS와 2 mM의 EDTA로 보충).
    16. 용액에 2 × 107 세포 / ㎖의 세포를 재현 탁, 나이브 CD4 T 세포를위한 농축1.1.16 단계에서 카운트 된 횟수에 기초하여 MACS 완충액 2.5 μg의 / ㎖의 비오틴 - 접합 된 항 CD62L 항체의. 얼음에 30 분 동안 품어.
    17. 세포를 한 후, 10 ML의 MACS 버퍼를 추가 원심 분리하여 세포를 씻으십시오. MACS 완충액 107 세포 / 100 ㎕의 세포로 재현 탁하고, 세포를 직접 1:10 희석액에서 스트렙 타비 딘 - 접합 된 자기 비드 분리를 추가한다. 얼음에서 20 분 동안 인큐베이션.
    18. 500 μL의 최소 부피 단계 1.1.17에서 이전 셀 씻기 MACS 완충액 2 × 8 세포 / ml의 세포를 재현 탁.
    19. 자석 홀더 자기 분리 컬럼을 놓고 3 ㎖의 MACS 버퍼를 통해 흐를 수 있도록함으로써 열을 씻는다. 피펫으로 열을 셀을 적용합니다.
    20. 3 ㎖의 MACS 컬럼에 버퍼 피펫 팅과 MACS 버퍼를 통해 흐름, 3 번 반복 할 수 있도록하여 자기 열을 준수하지 세포를 제거하기 위해 열을 씻으십시오. 분수를 통해 흐름을 폐기하십시오.
    21. Remov전자하여 자기 스탠드에서 열 및 새로운 50 ML의 원심 분리기 튜브를 통해 보유. 피펫은 5 컬럼 상 MACS 완충액 용액 및 MACS 컬럼 바인딩 된 세포를 분리하고이 농축 나이브 CD4 T 세포를 포함 통해 유동을 수집 할 수있는 칼럼을 통해 완충액 밀어 열로 둘러싸인 플런저를 사용한다.
    22. 원심 분리기 10 ㎖ RPMI에서 세포와 재현 탁을 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 100 IU / ml의 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 2 mM L- 글루타민이 보충 된, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올 (RPMI-10). 단계 1.1.10에서 이전 셀 카운트.
    23. RPMI-10 6X10 5 / ㎖로 나이브 CD4 T 세포의 최종 농도를 조정한다.
  2. T 세포 고갈 비장 장갑차를 정화
    1. 단계 1.1.1에서와 같이 6 ~ 8 주 된 여성 야생 형 BALB / C 마우스를 안락사.
    2. 70 % 에탄올 용액으로 마우스 스프레이 마우스의 abdome의 좌측에 대략 3cm 절개하여 비장을 노출엔. 복막 층을 열고 잘라 부드럽게 집게로 파악하고 수술 가위로 기본 연결 조직으로부터 멀리 절단하여 비장을 제거합니다.
    3. HBSS + 2 % NCS 8 ml의에 비장를 놓습니다.
    4. 단계에서는 이전, 비장 당화하여 단일 세포 현탁액을 제조 세척하고, 세포를 계수 1.1.7-1.1.10
    5. 펠렛을 5 분 동안 600 XG에 셀을 회전시켜 T 세포를 고갈 부드럽게 피펫 팅하여 / ㎖ 안티 Thy1.2 항체 (J1J 클론) 약 1 μg의 용액에 2 × 7에서 세포를 재현 탁. 30 분 동안 얼음에 세포를 품어.
      참고 :이 항체는 하이 브리 도마 세포주에서 사내 유도하고 concentraton이 근사된다. 보수 용해이 항체 최적의 농도와 부피는 경험적으로 결정하고, 실험실 사이에 다릅니다. 원한다면 비장 세포로부터 정제 APC를위한 다른 방법들이 대체 될 수있다. 나이브 T 세포와 장갑차​​는 숭배에 준비되어야한다단계 1.3에서 URE.
    6. , 기니 돼지의 보완을 추가 배양 및 단계 1.1.13-1.1.14에서, 이전 밀도 원심 분리 미디어 그라데이션의 세포를 분리합니다.
    7. RPMI-10의​​ 10 ㎖에 재현 탁하고 세포를 25 Gy의 방사선에 세포를 노출하는 시​​간의 길이에 대한 감마 조사 장치에 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 세포를 배치하여 장갑차를 조사한다. 시간이 길이는 조사부에 따라 달라집니다 셀이 조사 때마다 계산해야합니다.
    8. 1.1.10 단계에서 이전의 혈구 세포 수 및 RPMI-10 2.4x10 6 세포 / ml의 최종 농도로 APC 세포를 조절한다.
  3. 세포를 자극하여 5 일간 배양 한 한 Th1 표현형 CD4 T 세포를 분화.
    참고 : 여기서 나이브 CD4 T 세포로부터 발생하는 Th1 이펙터 제조 및 이미징을위한 프로토콜을 제공하지만,이 프로토콜은 상이한 표현형에 나이브 세포 분화하도록 조절 될 수 있거나, tO 등 CD8 T 세포와 같은 다른 세포 유형을 사용한다. 프라이밍 및 분화 조건은 경험적으로 결정되어야 할 것이다.
    1. 24 웰 배양 접시에 각 웰에서, 3 × 5 T 세포의 총과 1.2 × 웰당 6 장갑차 들어, 나이브 CD4 T 세포를 500 ㎕를 각 웰에 조사 장갑차 500 μl를 결합한다.
    2. 2 μM 동족 OVA 펩티드, 20 U / ㎖의 재조합 IL-2, 80 μg의 / ㎖의 항 IL-4 (클론 11B11) 40 NG / ㎖의 재조합 IL-12 필터를 사용하여 0.2을 함유하는 RPMI-10 용액을 제조 μm의 주사기 필터. 각 웰에 2 ml의 총 부피에 대한 세포의 각 웰에이 용액 1ml를 추가.
    3. 3 일간 5 % CO 2에서 37 ° C를 인큐베이터에있는 세포를 품어.
    4. 3 일에 조심스럽게 세포를 재현 탁하는 피펫 팅 잘 새로운 문화로 각 웰에 1 mL로 이동하여 문화를 분할합니다. 1ml를 추가 / 웰의 RPMI-10 2 ml의 최종 부피로 각 웰을 가져 + 20 U / ㎖의 재조합 IL-2.
    5. 인큐베이터에 번호판을 반환하고, 세포가 5 일까지 확장 할 수 있습니다.

2. 세포의 이전 및 염증의 유도

주 : 촬상 최적 셀 번호는 5 × 6 형광 표지 된 Th1 세포를 200 μl의 PBS 총 부피 각각의 마우스에 전달되어야한다. 다른 셀 추적 염료를 사용할 수 있지만 세포 여기서, 녹색 염료 CFSE 또는 가까운 적색 염료 CMTMR으로 표시된다. CFSE 및 CMTMR 표지 세포는 두 가지 이펙터 CD4 인구의 추적을 허용하는 공동 전송할 수 있습니다.

  1. CFSE와 라벨 이펙터 T 세포
    1. 격렬 각 웰에 세포를 피펫 및 피펫으로 멸균을 50㎖ 원심 관에 전사하여 배양 접시에서 세포를 수확. 단계 1.1.10 후 원심 분리와 같이 세포를 카운트하고 PBS + 5 % NCS 10 7 세포 / ㎖의 세포를 재현 탁.
    2. 5 mM의 주식 CFSE 솔루션 1을 희석 : (100)에서PBS. 튜브의 측면에 CFSE 용액 한 방울을 배치 한 후 신속하게 잘 혼합 앞뒤로 튜브를 흔들어 셀들 각각 1ml를 110 μL의 CFSE 용액을 추가한다.
    3. 세포의 튜브를 직접 소 태아 혈청 (FCS) 5 mL를 추가하여 CFSE을 종결 한 다음, RT에서 5 분 동안 세포를 인큐베이션. PBS + 5 % NCS와 50ml로 볼륨을 가져와.
    4. 세포를 원심 분리하고 20 ml의 PBS + 5 % NCS에 펠렛을 재현 탁. 3 회 총 세포를 씻어이 과정을 두 번 더 반복합니다. 단계 1.1.10에서, 앞에서와 혈구 세포의 수 및 마우스에 전달 2.5 × 10 7 세포 / mL의 멸균 PBS에 세포를 재현 탁.
  2. CMTMR 레이블 이펙터 T 세포
    1. 단계 2.1.1에서 상기와 세포를 수확 한 다음 카운트, 원심 분리기 및 RPMI-10 107 세포 / ml의 세포를 재현 탁.
    2. 10 μM의 최종 농도의 세포에 직접 10 mM의 CMTMR 주식 솔루션을 추가합니다. 신속하게 피펫 일즉 세포는 완전히 CMTMR에 혼합 색소의 침전을 방지한다.
    3. 37 ° C의 물을 욕조에 30 분을 품어. 세척 세포 단계 2.1.3-2.1.4에서, 이전과 PBS + 5 % NCS에 배. 개수와 마우스로 전송 웰당 2.5 멸균 PBS에서 107 세포 / ㎖를 세포를 재현 탁.
  3. 전송 이펙터 T 세포 6-8 주 이전 여성 BALB / c 마우스를 순진합니다.
    1. 필요한 경우 부드럽게 주사기의 측면을 튕기는 주사기 바늘 측해서 잡고 상하로 플런저를 이동시킴으로써 모든 기포를 제거하기 위해주의하면서 주사기에 세포 현탁액 (단계 2.1.4 또는 2.2.3)을 그려 .
    2. 꼬리 정맥이 vasodilated 나타날 때까지 부드럽게 가열 램프 아래에 깨끗한 케이지에 마우스와 열을 놓습니다. 금지 장치에 마우스를 놓고 알코올 면봉으로 꼬리를 닦아냅니다. 천천히 측면 꼬리 정맥에 세포 현탁액 200 μl를 주입. 피부 아래에 주사 또는 눈에 보이는 기포에 아무 저항이 없어야합니다.
  4. 프로 인트 완전 면역 보강제에 의해 피부 염증을 유발 (CFA)
    참고 : CFA는 동족 또는 비 동족 중 항원과 유화의이 프로토콜에 염증이 피내 주사에 의해 유도된다. 전송 및 촬상 타이밍에 필요한 세포의 수는 경험적으로 조절 될 필요가 있지만, 염증 모델은 치환 될 수있다.
    1. 미세 원심 관에 멸균 PBS에서 OVA 펩타이드의 200 μm의 솔루션을 준비합니다. 피펫 펩타이드 솔루션의 상단에 CFA의 동등한 볼륨.
    2. 후 약 20 시간이 작업을 반복, 28 G1 / 2 인슐린 주사기로 드로잉 한 후 다시 microcentrifuge 관에 솔루션을 폭락하여 솔루션을 유화. 완전히 유화 때, CFA 펩티드 용액 두꺼운 불투명 혼합물을 형성한다.
      주 : 에멀젼은 비 고정 needl에 데드 스페이스에서 손실되는 바와 같이, 에멀젼을 형성 고정 바늘 인슐린 주사기를 사용하는 것이 필수적이다전자 주사기.
    3. 페트리 접시에 넣고, 물에 소량을 삭제하여 에멀젼을 테스트합니다. 에멀젼은 그대로 유지하고, 물에 분산해서는 안된다.
    4. 300 ㎕의 28 G1 / 2 인슐린 주사기에 유화를 그리고 큰 공기 방울을 제거하기 위해 플런저에 크게 누르십시오.
    5. 즉시의 형광 이펙터 T 세포를 표지 전송 한 후, 240 ㎎ / ㎏에서 2,2,2- tribromoethanol의 IP를 주입하여 쥐를 마취. 필요한 경우, 1 mg의 단위로 더 2,2,2- tribromoethanol 관리, 부드러운 발가락 핀치에 의해 마취을 평가합니다.
      주 : 승인 된 마취제는 2,2,2- tribromoethanol 치환 될 수있다.
    6. 왼쪽 검지 손가락에 골무를 놓고 조심스럽게 복부 귀 위로 향하게하여 왼쪽 엄지 손가락과 검지 손가락 사이에 마우스의 귀를 잡고. 피부에 기계적 손상을 일으킬 수있는 귀,에 과도한 힘을 발휘하지 있는지 확인합니다.
    7. CFA 전자를 포함하는 바늘을 밀어진피에 mulsion는, 베벨면이 위로 향하게 천천히 귀에 에멀젼의 10 μl를 주입. 주입의 위치는 최적의 이미징을 허용하도록 약간 오프 - 센터, 귓바퀴의 외부 1/3이어야한다.
    8. 마취가 떨어져 착용하고 쥐가 스스로를 잘 할 수 및 외래 때까지 마우스를 모니터링합니다. 이미지 마우스 귀 진피로 트래픽을 전송 T 세포를 개발하기 위해 염증을위한 시간을 제공하고, 면역화 다음 삼일.
      참고 : 마취 상태에서 마우스 언제든지 방치 할 수 없습니다.

3. 이미징을위한 마우스 준비

  1. 카테터를 준비합니다
    1. 신중 치와 30 G1 / 2 결핵 (TB) 주사기 바늘로부터 금속 바늘을 제거하고 접착제가 완전하게 제거되었는지 가시화 할 해부 영역을 이용하여, 초과 접착제를 닦아.
    2. 나머지 바늘은 여전히​​ 페이지입니다 보장, 또 다른 30 ​​G1 / 2 TB 주사기 바늘 오프 팁을 잘라육안 검사로 atent. 트리밍 된 바늘에 PE-10 의료 튜브의 18cm 조각을 슬립 조심스럽게 카테터를 생성, 튜브의 다른 쪽 끝으로 베어 메탈 바늘을 약 5mm 놓습니다.
  2. 멸균 PBS로 1 ㎖의 TB의 주사기 충전 공기 방울을 제거하여 카테터를 세척. 조심스럽게 주사기의 끝 부분에 카테터를 배치하고 카테터 튜브의 모든 거품을 제거 할 수 있지만 부드럽게 PBS를 밀어 넣습니다.
    주 : 도관을 통해 유체를 추진하면, 주사기 오프 카테터 가압 유체의 압력을 방지하기 위해 주사기에 카테터를 유지하는 것이 필수적이다.
  3. 꼬리 정맥이 vasodilated 나타날 때까지 부드럽게 가열 램프 아래에 깨끗한 케이지에 마우스와 열을 놓습니다. 이소 플루 란 기화기에 부착 된 노즈콘을 통해 전달 조립체 (2 L / min의 유속으로 5 % 유도 1-2 %의 보수), 실내 공기 이소 플루 란과의 혼합물로 마우스를 마취. 마우스가 위스콘신 마취되어 있는지 확인부드러운 발가락 핀치를 토륨. 이동이 관찰되는 경우에 증분 0.1 % 이소 플루 란으로 유속을 증가시킨다. 마우스를 마취하는 동안 건조와 손상을 방지하기 위해 안과 연고와 눈을 커버.
    참고 : 마우스는 마취 동안 방치되지 않을 것이 필수적이다. 마우스는 자주 부드러운 발가락 핀치에 의해 충분한 마취를 모니터링해야한다.
  4. 포셉 한 쌍 바닥에 꼬리를 고정하고 알코올 면봉으로 꼬리를 닦아냅니다. 조심스럽게 측면 꼬리 정맥에 카테터를 밀어 조심스럽게 주사기의 플런저를 밀어 개통을 확인합니다. 이 적절하게 배치되어있는 경우 운동과 피부 아래 PBS의 눈에 보이는 버블 링에는 저항이 없어야합니다. 주사 부위를 조직 시아 노 아크릴 레이트 접착제 1-2 방울을 적용하여 꼬리 카테터를 부착하고, 약 30 초간 건조시킨.
  5. 조심스럽게 SK 손상되지 않도록주의하면서 가위로 귀 뒤쪽과 측면에서 머리를 손질에.뿐만 아니라 수염을 낸다. 면봉을 사용하여 PBS로 귀 내면을 적신.
  6. 24 X 50mm 번호 1.5 유리 커버 슬립에 마우스와 귀를 돌립니다. 집게를 사용하여 부드럽게 이어 유리와 같은 높이가되도록 할 필요가있는 경우, 마우스 이동, 커버 슬립 상에 귀를 평평. 조직 닦아에게 부드럽게 블로 팅에 의해 귀에서 초과 PBS를 제거합니다.
    참고 : 얇은 피부가 쉽게 과도한 압력으로 손상 될 수 있으므로, 귀 너무 단단히 누르지 않도록해야합니다.
  7. 곡선 포셉 두 쌍을 사용하여, 길이 방향의 상단 모서리에 천 테이프의 약 20 mm 길이 부분을 파악. 마우스 귀 상단의 커버 슬립 상에 테이프의 바닥에 놓고, 커버 슬립의 귀에 부착하는 데 필요한 경우 포셉 비켜 과량 머리 밀어 귀의 나머지 위에 테이프를 롤. 부드럽게 귀 자체에 눌러 않도록주의하면서 꽉 밀봉을 보장하기 위해 마른 면봉으로 귀 주위 테이프에 키를 누릅니다.
  8. 접착 테이프와 37 ° C 가열 블록에 영상 플랫폼을 연결합니다. 이미징 플랫폼의 귀 영역의 양쪽에 진공 그리스를 적용합니다. 펠트의 중심에 귀를 정렬 돌보는, 이미징 플랫폼에 커버 슬립을 배치 마우스를 회전합니다.
    참고 :이 그것이 유리 커버 슬립에서 분리 오는 원인이됩니다, 테이프에 진공 그리스를 받고 마십시오.
  9. 원추형 두부가 안전 보장과 완전히 마우스의 코를 덮고, 이미징 플랫폼 홀더에 이소 플루 란 원추형 두부를 스냅. 단단히 조심스럽게 세척 건조 면봉으로 이미징 플랫폼에 커버 슬립을 눌러 커버 슬립 하의 진공 그리스를 확산.
  10. 테이프의 두 개의 20mm 조각 플랫폼의 상부를 감싸 테이프의 두 개의 긴 조각으로 플랫폼에 coverslip에 부착합니다. 기포 귀 및 커버 슬립 사이에 존재하는 경우, 부드럽게 WI 아래 귀에 가압에 의해 제거 될 수있다접힌 종이를 토륨.
    참고 : 그것은 너무 두껍거나 단단히 눌러 종이를 사용하지 않는 것이 중요합니다,이 조직이 결과를 복잡하게 창백 손상의 원인이 될 수 있습니다.
  11. 현미경 단계로 마우스를 이동하고 접착 테이프로 플랫폼을 고정합니다. 귀 주변의 커버 슬립 위에 파이프 진공 그리스의 이중 층이 침수 목적을위한 저수지 역할을합니다.
  12. 이미징 플랫폼을 통해 마우스 주위에 물이 채워진 가열 담요를 감싸. 37 ° C 증류수로 탱크를 채우십시오. 모든 것이 접착 테이프로 무대와 카테터의 주사기가 쉽게 접근 할 수 있다는 고정되어 있는지 확인합니다.

생체 시간 경과 이미징 및 정맥 항체 관리 4.

주 : 사행 레이저 시스템이 프로토콜에 Ti를 구비 한 다 광자 현미경의 사용을 필요로한다. 사용 목적은 물체에 부착 1.05 NA와 25X 배율 렌즈이며필자 히터는 40 ° C로 설정합니다. 이 히터의 최적 온도는 37 ° C에 이어 진피를 유지하기 위해 적절한 온도로 실험적으로 결정하고, 다른 이미징 시스템에서 사용을 위해 조절 될 필요가있다. 프로토콜에 악기와 조정에 따라 다를 수 있습니다 사용되는 수집 소프트웨어는 다르게 구성된 시스템에서 작동하도록 만들 수 할 수 있습니다. 이미지가 원하는 분석 소프트웨어와 호환되는 형식으로 저장 될 수 있음을 확인합니다.

  1. 귀 센터를 통해 목적을 위치와 저장에 연락처를 그냥 때까지 물 표면에 목적을 낮춤으로써 접안 렌즈를 통해 진피를 찾습니다. 외부 광원을 사용하여 접안 렌즈를 통하여보고 귀의 표면에 초점이 될 때까지 천천히 목적을 낮추는 것을 계속한다. 현미경 스테이지 주위의 내부 및 외부 커튼을 낮 춥니 다.
  2. 현미경 설정을 확인하고 이미징을위한 영역을 찾습니다
    1. imagin 전g는 900 MP 레이저 컨트롤러 창 nm의 취득 분위기에서, 레이저 파워의 레이저 파장에 조정함으로써, 원하는 형광 물질의 최대 여기 및 검출 용 레이저를 구성 레이저 윈도우, 이미지 수집 제어 창에서 PMT 전압 .
      참고 :이 절차는 두 번째 고조파 세대 (420-460 nm의), CFSE (495-540 nm의), 및 CMTMR (575-630 nm의) 검출 필터를 900 나노 미터의 여기 파장을 사용합니다. 다른 구성은 필요에 따라 서로 다른 형광 물질을 검출 할 수있다.
    2. 획득 설정에서 2 마이크로 초 / 픽셀 드웰 시간, 512 X 512 픽셀 해상도로 현미경을 설정 크기와 모드 창을. "XY 반복"을 클릭하여 이미지에 지역 조직을 통해 검색 할 수 있도록 라이브 영상 모드를 활성화합니다. 이상적으로는, 영역 기포없이 비교적 균일하고 치밀한 모낭 영역을 회피한다.
      참고 : CFA 에멀젼은 녹색과 북동에서 밝은 autofluorescent입니다채널 AR-빨간색과 피해야한다. 최적의 필드는 보통 에멀젼의 가장자리로부터 대략 3mm를 찾을 수있다. 약 10-100 세포는 하나의 이미지에서 추적 할 수 있습니다. 너무 많은 셀들이 존재하는 경우, 추적 소프트웨어 단축 및 / 또는 부정확 한 셀 트랙 선도 근접 위치한 세포를 분리하는 시도에서 오류가 발생 일반적 것이다.
    3. 적절한 이미징 필드가 위치되면, "로 설정 0"버튼을 클릭하여 0으로 Z 위치를 설정하고, Z로 스크롤 다운, 진피 세포를 "높은"위치에 의해 촬영되는 Z 영역을 결정 방향은 셀 깊이의 정도를 측정한다. 35 ~ 75 μm 인 촬상 깊이가 일반적이다. 현미경 창을 획득 설정의 시작과 끝 위치를 설정합니다. 촬상 영역의 깊이에 걸쳐 세포의 가시화를 최적화하기 위해 "밝은 Z"윈도우 기기 PMT 전압과 레이저 출력을 조정한다.
      참고 : 라스를 제기하지 마십시오샘플 25 mW의 상기 ER 전력은, 높은 전력 레벨은 진피에 열 손상 멸균 부상을 초래할 수있다. 각 현미경에 적절한 최대 전력 레벨은 다를 측정 할 수있을 것이다. 조직 깊이와 레이저 파워 나 PMT 전압을 증가 시키면 취득 이후 분석의 깊이가 다른 이미지 밝기의 양적 비교를 허용하지 않는다는 것을 주목해야한다.
    4. 이미지 수집 제어 창에서 "검색"버튼 아래에있는 "깊이"와 "시간"버튼을 선택합니다. 필터 모드 창을 이미지 획득에 Z 슬라이스 깊이 조정 : 이미지 수집 제어의 이미지를 한 줄에 3 번 스캔 칼만 필터를 설정는 전체 스택을 캡처하는 데 약 1 분 소요 있도록 한 바와 같이, 현미경 창을 TimeView에서 창이다.
      참고 : 이상 간격으로 빠르게 마이그레이션 세포의 추적을 방지하기로 스택 사이의 간격은 약 1 분보다 더 오래 걸리지 않을 겁니다. 일에 따라셀 E 타입이 묘화되고,이 간격은 분석 소프트웨어에 의한 적절한 셀의 추적을 허용하도록 조절 될 필요가있다. Z-조각 이하 5 μm의 수 있어야합니다. 일반적으로 두께 2 ~ 5 μm의 사이에 15 ~ 18 Z-조각은 1 분 영상 간격에 적합합니다.
  3. 미리 항체 시간 경과 이미지를 캡처
    1. 획득 환경에서 "5"로 반복 횟수를 설정함으로써, 조직의 안정성을 평가하기 위해 영역의 5 분 경과 이미지 캡쳐 : TimeScan 창 및 "검색"버튼을 클릭.
      참고 : 조직 "드리프트는"귀는 열 평형, 가난한 귀 준비에 도달하는, 또는 귀의 한 지역에 지역 편차에 기인 할 수있다 충분한 시간을 허용하지 않음으로써 발생할 수 있습니다. 5 분 화상을 안정적 이미지 진피의 새로운 영역이 아닌 경우. 새로운 지역에서 두 번째 이미지가 불안정 남아있는 경우, 신중 신선한 COV로 단계 3.6에서 귀 준비 및 이미지를 반복하는 것이 가장 좋습니다erslip.
    2. 조직을 5 분 화상 안정한 경우, 획득 환경에서 30 내지 45의 반복 횟수를 설정하여 30-45 분 경과 이미지를 수집 TimeScan 창 이미지가 임의의 작은 조직 드리프트 모니터링 모은. 사용되는 분석 소프트웨어와 호환되는 형식으로 파일을 저장한다.
      참고 : - 4.3.2 같은 귀에 이미지를 여러 위치에 반복 할 수있는 프로토콜이 시점에서, 4.2.2이 단계를 반복합니다. 죽음이 발생할 가능성이로 하나의 마우스, 이상 4 시간 동안 마취 상태로 유지 할 수 없습니다.
  4. 차단 항체를 주입 한 후 항체 이미지를 캡처합니다.
    1. 1 ML의 TB 주사기로 항체 혼합물을 그리고 모든 기포를 제거해야하고, 바늘을 제거합니다. 플런저 누르도록 항체 용액은 주사기의 끝에서 "액적"을 형성한다.
    2. 무대 주위에 커튼을 들어 올려 카테터를 찾습니다. 원래 PBS-접점을 제거카테터에서 ining 주사기입니다. 아래 카테터를 설정하지 않고, 조심스럽게 항체를 포함하는 새로운 주사기를 연결합니다. 주사기에 카테터의 끝을 잡고 천천히 카테터 내로 항체 혼합물을 주입. 주입에 아무 저항이 없음을 확인합니다.
    3. 아래 카테터를 설정하고 현미경 스테이지를 둘러싼 커튼을 낮 춥니 다. 분사 시간을 참고 바로 전 항체 이미지와 같은 장비 설정을 이용하여 동일한 위치에 새로운 20-40 분 촬상 시퀀스 수집을 시작. 분석 소프트웨어를 사용하기에 적절한 형식의 파일을 저장한다.
      참고 : 시간 ​​경과 이미지 사이에 충분한 마취 호흡을 위해 마우스를 관찰합니다. 항체의 간극의 변수 요금이있을 수있는 그것은, 항체의 투여 후 하나 이상의 필드 이미지에 권장되지 않습니다.
  5. 혈관을 찾아 카테터 개통을 평가, 및 b를 측정하는 형광 표지 된 덱스 트란을 주입들 (100d) 혈관 투과성
    1. 100 μL의 덱스 트란 형광 공액 (70,000 MW) 멸균 PBS에 2 ㎎ / ㎖ 용액을 조제하고 기포를 제거하는 주사기로 그린다.
    2. 4.4.1-4.4.2 단계에서와 동일한 기술을 사용하여, 카테터에 주사기를 놓고 정맥 덱스 트란 용액을 주입.
    3. 시간 경과 이미지와 같은 PMT 및 레이저 설정, 모드 창을 획득 설정에서 해상도를 변경하여 1,024 X 1,024 픽셀 해상도에서 단일 스택을 캡처합니다. 이미지를 수집하려면 "검색"버튼 아래에있는 "시간"버튼을 선택을 취소 한 다음 "검색"버튼을 클릭. 이 3D 이미지는 혈관에있는 배제 T 세포를 허용하고, 카테터 특허이었고, 제대로 삽입 것을 보여줍니다. 혈관 밖으로 형광 덱스 트란의 확산은 로컬 혈관 투과성을 평가하는데 사용될 수있다.
      참고 :이 고해상도 (X 1024 1024) 정적 이미지 홍보에 사용됩니다esentation의 목적과는 추가로 시간 경과 이미지로, 같은 지역에있는 조직 구조의 분석을 위해 사용될 수있다. 대안 적으로, (512) X (512) 이미지는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 시간 경과 이미지로 병합 될 수있는, 촬영 될 수있다. 덱스 트란 관리의 시간 경과 영상은 개별 연구소의 연구 필요에 따라 바람직 할 수있다. 이 경우, 이미지는 단계 4.2.3-4.3.2 같이 설정되어야한다.
  6. 촬상이 완료된 후, 조심스럽게 대물 아래에서 마우스를 제거하고 물 블랭킷을 푸는. 테이프를 절단하고 부드럽게가 분리 될 때까지 유리를 올려 이미징 플랫폼에서 커버 슬립을 제거합니다. 마우스가 여전히 마취 동안, 커버 슬립의 귀를 분리. 이 단말기 절차 될 경우, 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사. 반복되는 영상이 마우스를 절약, 다른 마우스에서 분리 관찰 깨끗한 케이지에 반환하는 경우 마우스 자체를 잘하고있다 할 수있을 때까지걸을 수 있는. 마취에서 회복되면, 마우스는 다른 동물과 케이지에 반환 할 수 있습니다.
  7. 이미지 분석 프로그램으로 이미지 파일을 가져 와서 원하는 수정을 수행합니다. 비 - 선형 개선 및 자동 스무딩이나 소음 감소 프로그램 및 알고리즘을 회피하는 것이 좋습니다. 통상적으로, 이미지는 수동 분석 전에 이미지의 검은 점을 증가시킴으로써 만 작은 배경 보정을 필요로한다. Overstreet, Gaylo 등 (30)로서, 수동으로 보정하는 자동 셀 추적 프로그램을 사용하여 촬상 데이터를 분석한다.
    참고 :이 프로토콜에서 파생 된 광자 이미지에서 세포 역학을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다 모두 독점 및 오픈 소스 사용할 수 많은 이미지 분석 스위트 룸이있다. 이미지 분석의 정확한 방법 및 최적의 소프트웨어 패키지는 개별 실험실 연구 요구에 따라 달라질 수있다.

결과

면역 환경 변화없이 제자리에서 면역 반응을 연구 할 수있는 능력은 염증 조직으로 T 이펙터 세포의 실시간 상호 작용을 연구하는데 필수적이다. 도 1A 및 B에 요약 된이 프로토콜에 의해 그대로 이어 진피 이미징, 진피 간질 양도 형광 표지 T 이펙터 세포의 시각화를 허용한다. 이것은 고해상도 (도 1C) 및 저속 (도 1D,

토론

의미

여기에서 우리는 그대로 마우스 귀 진피에 전달, 항원 특이 이펙터 Th1 세포의 4D 시각화를위한 완벽한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 여러 가지 이유로 몇몇 현재 영상 방식에 비해 많은 장점을 제공한다. 복부 귀 진피 촬상함으로써 다른 피부 부위를 포함하는 촬상 프로토콜이 필요 제모를 포기 할 수있다. 제모 일반적으로 온화하지만, 이들은 피부 장벽 (42...

공개

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 말

저자는 라이브 영상에 대한 도움말은 로체스터 다중 광자 현미경의 핵심 시설의 대학 감사합니다. DJF에 NIH AI072690 및 AI02851에서 지원; MGO에 AG 및 AI089079에 AI114036.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
BALB/c miceJackson Laboratories000651Mice used were bred in-house
DO11.10 miceJackson Laboratories003303Mice used were bred in-house
HBSSFisher10-013-CVMultiple Equivalent
Newborn Calf Serum (NCS)Thermo/HyCloneSH30118.03Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes
Guinea Pig ComplementCedarlaneCL-5000
anti-CD8 antibodyATCC3.155 (ATCC TIB-211)Antibodies derived from  this hybridoma
anti-MHC Class II antibodyATCCM5/114.15.2 (ATCC TIB-120)Antibodies derived from  this hybridoma
anti-CD24 antibodyATCCJ11d.2 (ATCC TIB-183)Antibodies derived from  this hybridoma
anti-Thy1.2 antibodyATCCJ1j.10 (ATCC TIB-184)Antibodies derived from  this hybridoma
Ficoll (Fico/Lite-LM)Atlanta BiologicalsI40650
PBSFisher21-040-CVMultiple Equivalent
EDTAFisher15323591
biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14)BD553149
streptavidin magnetic separation beadsMiltenyi130-048-101
MACS LS Separation ColumnMiltenyi130-042-401
recombinant human IL-2Peprotech200-02
recombinant mouse IL-4Peprotech214-14
recombinant mouse IL-12Peprotech210-12
anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2)eBioscience16-7311-85
anti-IL-4 antibody (clone 11b11)eBioscience16-7041-85
RPMIVWR45000-412
Penicillin/StreptomycinFisher15303641
L-glutamineFisher15323671
2-mercaptoethanolBio-Rad161-0710
ovalbumin peptideBiopeptideISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide
Fetal Calf Serum (FCS)Thermo/HyCloneSV30014.03Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes
24-well culture plateLPS3526Multiple Equivalent
CFSELife TechnologiesC34554
CMTMRLife TechnologiesC2927
28 G1/2 insulin syringes, 1mlBD329420
28 G1/2 insulin syringes, 300μlBD309301
27 G1/2 TB syringes, 1mlBD309623
30 G1/2 needlesBD305106
PE-10 medical tubingBD427400
cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond)3M1469SB
heating plateWPI61830
Heating plate controllerWPIATC-2000
Water blanket controllerGaymarTP500No longer in production, newer equivalent available
water blanketKent ScientificTP3E
Isoflurane vaporizerLEI MedicalIsotec 4No longer in production, newer equivalent available
isofluraneHenry ScheinOrdered through Veterinary staff
microcentrifuge tubesVWR20170-038Multiple Equivalent
medical tape3M1538-0
isoflurane noseconeBuilt In-house, see Fig 2
imaging platformBuilt In-house, see Fig 2
curved forcepsWPI15915-GMultiple Equivalent
scissorsRobozRS-6802Multiple Equivalent
glass coverslipsVWRMultiple Equivalent
high vacuum greaseFisher146355D
cotton swabsMultiple Equivalent
delicate task wipesFisher34155Multiple Equivalent
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laserOlympuscall for quote
optical table with vibration controlNewportcall for quote
25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imagingOlympusXLPLN25XWMP2
objective heaterBioptechsPN 150815
Detection filter cubeOlympusFV10-MRVGR/XRProprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics
anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1)eBioscience16-0291-85Azide free, low endotoxin
anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3)eBioscience16-0611-82Azide free, low endotoxin
Texas Red Dextran (70,000 MW)Life TechnologiesD-1830

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