Medidas de seguridad y procedimientos de operación en una (A) de laboratorio BSL-4: 2. Prácticas generales

Resumen

Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.

Resumen

El trabajo en un laboratorio de contención de bioseguridad de nivel 4 (BSL-4) requiere tiempo y una gran atención al detalle. El mismo trabajo que se realiza en un laboratorio BSL-2 con patógenos no de graves consecuencias tardará mucho más en un entorno BSL-4. Este aumento de las necesidades de tiempo se debe a una multitud de factores que tienen por objeto proteger el investigador de las infecciones adquiridas en el laboratorio, el ambiente de trabajo de la contaminación potencial y la comunidad local de la posible liberación de los agentes patógenos de graves consecuencias. En el interior del laboratorio, el movimiento está restringido debido a las mangueras de aire conectados a los trajes de seguridad obligatorias para todo el cuerpo. Además, se requiere la desinfección de todos los elementos que se retira de los gabinetes de bioseguridad de clase II (BSC). especialistas de laboratorio deben ser entrenados en las prácticas de laboratorio BSL-4 y deben demostrar alto dominio de las habilidades que están realizando. El objetivo de este artículo es describir los procedimientos y las técnicas de laboratorio para asegurar b adecuadasiosafety y la precisión experimental usando un ensayo de placa viral estándar como un procedimiento de ejemplo. En particular, las técnicas adecuadas para trabajar con seguridad en un entorno de BSL-4 cuando se hará hincapié visualmente la realización de un experimento. Estas técnicas incluyen: la creación de un BSC de clase II para los experimentos, limpieza adecuada del BSC Clase II cuando terminó de trabajo, gestión de residuos y eliminación segura de los residuos generados en un laboratorio BSL-4, y la eliminación de las muestras inactivadas por dentro de un BSL- 4 de laboratorio para el laboratorio BSL-2.

Introducción

Dado que la seguridad del personal de laboratorio que manipulan agentes patógenos de alto riesgo (no existen profilaxis de infección ni las opciones de tratamiento) es de suma importancia, el Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos ha establecido directrices para la construcción de instalaciones y las mejores prácticas para la conducción segura de trabajo con agentes patógenos en biomédica y laboratorios clínicos desde una perspectiva de seguridad de la biotecnología ^1. A través de la legislación y la regulación, muchas de las prácticas y procedimientos se han convertido en requisitos obligatorios que deben seguirse para el trabajo con estos patógenos. En los EE.UU., los patógenos que se transmiten fácilmente de persona a persona, como resultado altas tasas de letalidad, y / o tienen el potencial de gran impacto en la salud pública y el bioterrorismo, se clasifican como Instituto Nacional de / Instituto Nacional de Alergias y Infecciosas Salud enfermedad (NIH / NIAID) de prioridad a y patógenos o Centros para el control y Prevención de Enfermedades (CDC) bioterrorismo Agentes de la categoría a ^2. Además, hpatógenos IGH-consecuencia se clasifican como de nivel 1 Seleccione Agentes si estos patógenos son posibles agentes de bioterrorismo, tienen potencial para víctimas en masa o efectos devastadores para la economía, la infraestructura crítica, o la confianza del público ^3.

BSL-4 operaciones, incluido el acceso a los institutos con BSL-4 laboratorios, están mucho más controlados que BSL-2/3 operaciones. Por ejemplo, es mucho más difícil de obtener acceso a un laboratorio BSL-4 en comparación con un laboratorio BSL-2 o BSL-3 debido a los requisitos sustanciales de formación traje, extensos requisitos de orientación, y los requisitos previos adicionales de bioseguridad médica. Además, normalmente hay barreras de seguridad más físicos en una instalación BSL-4 en comparación con una instalación BSL-2 o BSL-3 ^4-6. Como se indica en nuestro primer artículo sobre los procedimientos BSL-4 de entrada y salida, el personal de laboratorio se someten a una amplia formación y evaluación psicológica para calificar para el ingreso en el laboratorio BSL-4 ^7. Wentro del laboratorio BSL-4, riesgo de infección y se cometen errores evitarse o mitigarse siguiendo los procedimientos establecidos. La investigación debe proceder con cuidado y deliberadamente, con la multitarea o distracciones mínimas. Inclinado sobre con trajes de presión positiva es difícil, y el protector de la cara puede restringir procedimientos tales como la microscopía. guantes voluminosos impiden la realización de tareas motoras finas, tales como el manejo de objetos pequeños o etiquetar tubos. Para minimizar el tiempo de permanencia en BSL-4 laboratorios, especialistas de laboratorio deben revisar los procedimientos de trabajo para identificar los pasos que se pueden hacer por delante en un laboratorio BSL-2 y luego el transporte de estos materiales en el laboratorio BSL-4 para la realización de la tarea (s). Cuando la eliminación de los materiales para su posterior procesamiento en BSL-2 laboratorio, los materiales son fijos y retirados de la laboratorio BSL-4 en un recipiente secundario cerrado herméticamente. Los ejemplos de muestras que pueden necesitar ser eliminado incluyen: placas o tubos de material infectado fijos que serán analizadas por immunosorbe ligado a enzimasnt ensayo (ELISA), ensayo de inmunofluorescencia (IFA) o reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Además de mayores limitaciones físicas impuestas por el equipo de protección personal que se requiere en BSL-4 laboratorios en comparación con los de BSL-2 laboratorios, procedimientos para la inactivación de patógenos de graves consecuencias en placas de cultivo celular y la eliminación de residuos son más estrictas que las que se necesitan para los virus menos patógenos estudiado en un laboratorio BSL-2. Como mínimo, estos métodos deben cumplir con el requisito de los CDC. Por ejemplo, placas de cultivo celular y otros materiales contaminados se pueden inactivar con reactivos químicos, tales como formalina tamponada neutral. placas o tubos de cultivo de células tratadas se van a colocar en bolsas de sellado térmico que contienen formalina y se retira del laboratorio a través de un tanque de agua lleno de un líquido desinfectante. Los cucharones para basura llenas de soluciones desinfectantes y pulverizar desinfectantes se utilizan para recibir temporalmente los residuos generados durante el experimento y para DISInfecting guantes, limpieza de superficies e instrumentos de cabina de bioseguridad, respectivamente. solución desinfectante de amonio cuaternario en la concentración de la lista se considera el estándar de oro para todos los Estados Unidos BSL-4 laboratorios Barr (J, comunicación personal, 2015). Los residuos sólidos de un cubo de residuos se trata en autoclave para eliminar la posibilidad de contaminación.

En un esfuerzo para demostrar visualmente el flujo de trabajo y limitaciones de generales BSL-4 procedimientos, se utilizó un ensayo estándar de placa viral como un ejemplo de un procedimiento viral comúnmente usado. Si bien el procedimiento de ensayo viral se describe, en general, hacemos hincapié en los procedimientos de bioseguridad utilizados para garantizar la seguridad del personal de laboratorio en este protocolo. Por favor refiérase a las visualizaciones anteriores ensayo de placas clásicas de antecedentes adicionales sobre la técnica de la placa de ensayo ^8,9.

Los procedimientos presentados aquí siguen las especificaciones señaladas por los CDC BMBL ^1. Sin embargo, los protocolos presentados estánespecífico para el IRF-Frederick. Cada instalación BSL-4 tiene diferentes procedimientos operativos estándar (SOP) y métodos de operación que afectan a la ejecución de experimentos en el laboratorio BSL-4. Los procedimientos alternativos para la gestión del flujo de residuos y ejecución de ensayos de placa pueden diferir en función de la gestión y funcionamiento de estos laboratorios. Sin embargo, una comprensión general de la configuración de un laboratorio y procedimientos para realizar el trabajo con cabinas Clase II dentro del entorno de BSL-4 traje de BSL-4 ayudará a los científicos a entender las limitaciones y las implicaciones de seguridad cuando se contempla estudios de patógenos de alto riesgo. El aumento de la concienciación de los colaboradores externos de las dificultades que rodean el trabajo en un laboratorio BSL-4 puede conducir a expectativas ajustadas y una mayor facilidad en el desarrollo de contramedidas médicas en la comunidad de investigación.

Protocolo

1. Entrada de laboratorio

1. Reunir todos los materiales de construcción de un laboratorio BSL-2 para el experimento (por ejemplo, células, los medios y los consumibles) antes de entrar en el laboratorio BSL-4.
2. Completar el procedimiento de entrada BSL-4 (descrito en detalle en ^la referencia ^7).

2. Preparación de una Clase II Gabinete de Bioseguridad en el Laboratorio BSL-4

1. Una vez dentro del laboratorio BSL-4, garantizar la lista de control interno diario (Figura 1) se ha completado. Completar la lista de comprobación si la lista no ha sido previamente rellenado e indicar cuales serán utilizados virus. Si la lista de comprobación ya se ha completado, añada el nombre y qué virus se utilizarán para la lista.
2. Limpiar el BSC de clase II mediante pulverización por todo el interior de la BSC (incluyendo la hoja) con la solución desinfectante de amonio cuaternario dual 5% (por ejemplo, n-alquilo cloruro de dimetil bencil amonio, n alquil-dimetil bencil amonio acetato decloruro u otro desinfectante adecuado para el agente que se utilizan) y limpiar con toallas de papel ^10,11. Rocíe la solución de etanol al 70% dentro de la cabina y la faja para eliminar la solución desinfectante de mal gusto.
3. Si está sentado, establezca la silla delante del BSC Clase II a una altura cómoda para asegurarse de que la parte posterior del gabinete puede ser alcanzado y que la cara de la especialista del laboratorio está situado por encima de la abertura frontal (figura 2) ^11.
4. Preparar un recipiente de residuos para la cabina de bioseguridad. Asegúrese de que la concentración final de la solución desinfectante de amonio cuaternario dual en el contenedor de residuos no es menor que 5%. Planificar en consecuencia y crea una solución al 10% a la que se añadirá residuos que va a diluir el desinfectante. Además, colocar una botella de spray con una solución cuaternario dual 5% desinfectante de amonio dentro de la clase II BSC para rociar ningún artículo antes de la extracción y las manos enguantadas durante y después de la finalización del ensayo.
5. Coloque los materiales adecuados necesarios para todo el experimento en la Clase II BSC tan atrás en el gabinete como sea posible para evitar la introducción de materiales repetidos en el BSC de clase II y la interrupción del flujo ^de aire ^11.

3. Ejemplo: Placa de ensayo

1. Recuperar muestras que contienen virus y control de virus de la ubicación de almacenamiento a mano y descongelar materiales en una incubadora a 37 ° C.
2. Etiquetar los pocillos de las placas de 6 pocillos para ser usadas de acuerdo con las diluciones de virus planificadas. Marcar las tapas y el cuerpo de las placas para asegurar a juego con éxito si se separan las tapas y el cuerpo.
3. Traer los materiales de los pasos 3.1-3.2 en el BSC Clase II. Coloque todos los elementos que no tienen o no quieren entrar en contacto con el virus en un lado ( "lado limpio") y los residuos en el otro lado ( "lado sucio"). Si es posible, mantenga "artículos limpios" por lo menos 30 cm de distancia de "artículos sucios" durante las actividades que generan aerosoles ¹1.
4. Trabajar lo más cerca posible del centro de la parte interior del BSC de clase II como sea posible, ya que el centro de interior está diseñado para ser la posición más efectiva para protegerse ^11.
5. Retire 50 l de muestra y de control del virus virus y colocar en 450 l de medio de Eagle modificado por Dulbecco con suero bovino fetal al 2%. Proceder con la fabricación de diluciones seriadas tan lejos como sea necesario (Figura 3A).
6. Durante las diluciones, mezclar las muestras de virus al menos 5 veces con una punta de pipeta lentamente y con cuidado y tratar de minimizar la generación de burbujas de aire en las muestras. Cambiar las puntas de pipeta después de cada adición a la siguiente dilución así.
7. En la última dilución, después de mezclar la muestra 5 veces, desechar 50 l de muestra de virus en un contenedor de residuos para garantizar volúmenes iguales de diluciones.
8. Al desechar las puntas, aclarar cada punta con una solución desinfectante de la cubeta de residuos para descontaminar el interior y el exterior de la punta antes de expulsaring punta en el cubo de residuos.
9. Una vez que se hacen las diluciones, establecer los pocillos de dilución a un lado y empezar de aspiración medios de los pocillos de placas de cultivo de células, dejando 500 l de medios de comunicación en cada pocillo de una placa de 6 pocillos.
10. Cuando haya terminado con la punta de pipeta, solución aspirado de desinfectante de la cubeta de residuos a la parte superior de la pipeta usando un manual, volumen ajustable, pulsador pipeta, para asegurar la descontaminación adecuada de la parte interior de la pipeta. Deja la punta en el cubo de desecho hasta el final del experimento.
11. Una vez que los medios de comunicación han sido retirados de las placas, añadir 100 l de la muestra correcta en el pozo adecuado en las placas pre-etiquetados por duplicado, cambiar las boquillas de cada uno para cada muestra.
12. Al término de las inoculaciones ensayo de placas, rocíe las manos enguantadas con la solución desinfectante y use una toalla de papel empapada con una solución desinfectante para limpiar el exterior de todas las placas antes de colocar las placas de nuevo en la incubadora con la mano. Returba este proceso hasta que todas las placas son de nuevo en la incubadora.
13. Roca las placas en un movimiento en forma de 8 para asegurar la dispersión adecuada de la muestra sobre las células cada 15 min durante 1 hora.
14. Al término de placas oscilantes, las placas de regreso en el BSC de clase II junto con una mezcla de medio esencial mínimo de 2x de Eagle y 1,6% de tragacanto, una capa semi-sólido que es más fácil de manipular que los de agarosa, que se utiliza para la superposición de la placa de ensayo.
15. Añadir 2 ml de la mezcla de recubrimiento a cada pocillo en una placa de 6 pocillos y roca una vez más en un movimiento en forma de 8 para la igualdad de la distribución de la superposición a lo largo de la superficie del pozo. Repita este proceso hasta que cada utiliza bien se superpone con la mezcla de superposición.
16. Asegúrese de que la punta de la pipeta serológica no toque ningún líquido en los pozos para evitar la contaminación cruzada cuando se realiza el procedimiento de recubrimiento.

4. Eliminación de Residuos y Limpieza de los instrumentos y Bioseguridad gabinete

1. Sumergir por completo todo el material residual en una solución desinfectante de 5% en el cubo de residuos para un tiempo de contacto de al menos 10 min. Desinfectar las puntas de pipeta, pipetas serológicas, y otros residuos como se ha descrito anteriormente. Además, rociar el cubo de residuos (dentro y por fuera) con la solución desinfectante 5% dejó que la solución permanezca en contacto con el cubo de residuos para un tiempo de contacto de 10 min.
2. Mientras se espera el tiempo de contacto que debe transcurrir para los residuos, empapar una toalla de papel con una solución desinfectante 5%, limpie los instrumentos, como las micropipetas, y eliminarlos de la BSC. Pulverizar las manos enguantadas con solución desinfectante 5% antes de llevar a cabo las manos enguantadas del BSC Clase II.
   1. Después de la eliminación de las micropipetas desde el BSC, secarlos con una toalla de papel por separado con una solución de etanol al 70% para evitar la acumulación pegajosa en los instrumentos. Rocíe ningún instrumentos que no se pueden limpiar de manera efectiva hacia abajo con 5% desinfectante y dejar en contacto con la solución en el BSC para 10 min.
3. Después de un tiempo de contacto suficiente, eliminar todos los elementos de la BSC. Tomar artículos, incluyendo un cubo de desecho que contiene materiales de desecho, al fregadero. Enjuague artículos que pueden ser reutilizados para eliminar los restos de desinfectante. Devolver todos los artículos a sus lugares de almacenamiento.
4. Limpiar la superficie de trabajo de la clase II del BSC, los laterales del armario y la parte posterior, interior del vidrio, y la banda ¹ con solución desinfectante 5% seguido de una solución de etanol al 70%.
5. Sacar y escurrir las pipetas serológicas de la cubeta de residuos y lugar pipetas serológicas desinfectados superficialmente en las bandejas de pipeta distintas para el tratamiento en autoclave (pipetas serológicas pueden presentar un peligro de objetos afilados y pueden arrancar a través de la bolsa de basura. Colocar estas pipetas en un contenedor rígido antes tratamiento en autoclave).
6. Verter el contenido de la cubeta de residuos en un colador colocado en la parte inferior del disipador.
7. Trae un envase para peligros biológicos que está recubierto con un bolso rojo de riesgo biológico al fregadero y volcar el contenido de la Strainer en la bolsa de riesgo biológico rojo. No meta la mano en el colador para eliminar puntas de micropipeta que pueden adherirse al interior del filtro. Hit el filtro a lo largo del interior del contenedor de residuos hasta que todos los consejos se eliminan, o utilice un par de pinzas para quitar las puntas de la coladera.
8. Enjuague el cubo de residuos y lugar para secar en el estante al lado del lavabo.

5. El tratamiento en autoclave de residuos

1. Retire la bolsa de riesgo biológico del envase para peligros biológicos y colocar en una bandeja de autoclave en un carrito.
2. Deja bolsas de bioseguridad abierta y colocar un trozo de cinta de autoclave sobre el exterior de la bolsa, la conexión de los lados de la bandeja de autoclave para mantener la bolsa asegurada en la bandeja.
3. Coloque dos trozos de cinta de autoclave en la bandeja de puntas de pipeta serológica y la etiqueta con las iniciales de uno y la fecha. Coloque la bandeja de pipeta serológica en el carro con la bandeja de autoclave.
4. Abrir el autoclave. Conectar el autoclave provisto de carga / descarga de cart al autoclave y llevar a cabo la plataforma retráctil autoclave para descansar en el carro.
5. Retire la barra de metal de la autoclave y abrir la parte superior. Colocar un vial indicador biológico que contiene esporas de Bacillus stearothermophilus en la barra de metal para comprobar que el ciclo de esterilización en autoclave se completó con éxito.
6. Colocar la varilla de metal en el centro de la bolsa de residuos en la bandeja del autoclave pero asegúrese de que la barra de metal es todavía fácilmente accesible.
7. Coloque la bandeja de autoclave llena de la basura y la bandeja de pipeta serológica a la plataforma retráctil autoclave y empujarlo hacia atrás en el autoclave.
8. Separar el autoclave carro de carga / descarga del autoclave y cerrar la puerta del autoclave.
9. Iniciar el autoclave.
10. No deje el autoclave hasta que se ha iniciado el ciclo. La pantalla de funcionamiento del autoclave indicará el tiempo restante para esa ejecución.
11. Una vez finalizada la carrera autoclave, retire la ind biológicaindicador de alimentación y evaluar para el crecimiento por calentamiento en una incubadora especificado. Si se detecta un crecimiento en el indicador biológico, vuelva a ejecutar la basura en el autoclave, y evaluar de nuevo indicador. Si no se detecta crecimiento, quitar la basura de la instalación.

6. Ejemplo: Fijación y tinción de placa Ensayos

1. Después de que el número apropiado de días (que depende del virus utilizado) ha pasado, volver de nuevo en el laboratorio y realizar los pasos de las secciones 1 y 2 una vez más.
2. Retirar con cuidado las placas de ensayo de placa de la incubadora completado en el paso 3.1.2, y el lugar en el BSC Clase II con la mano.
3. Pipeta de todo el material de medios de comunicación y de superposición y dispensar en el recipiente de solución desinfectante y reemplazar con una mezcla de 10% de formalina tamponada neutra y 0,8% de cristal violeta ^12,13. Deje que la mezcla permanezca en las placas durante 30 min para inactivar el virus en las placas.
4. Después de la inactivación, retirar con cuidado el neutrotamponada de formalina mezcla de violeta / cristal y colocar en un contenedor de residuos por separado para ser neutralizados antes de su eliminación.
5. Pulverizar las manos enguantadas con desinfectante y limpie la parte exterior de las placas antes de pasarlos fuera del BSC Clase II como se ha descrito anteriormente.
6. Proceder a la pileta, se lavan las placas para eliminar el exceso de colorante y, a continuación, colocar las placas en un carro que se seque.
7. Una vez que las placas estén completamente secas, utilice una caja de luz para contar las placas. Registrar todos los recuentos y calcular los títulos de virus a partir de la ecuación estándar (Figura 3B).

7. Extracción de muestras del laboratorio BSL-4

1. Inactivar las muestras que serán manipulados bajo BSL-2 condiciones de laboratorio. Siga uno de los dos métodos aprobados por la oficina interna de bioseguridad en el IRF-Frederick utilizando 10% de formalina tamponada neutra (NBF) o Trizol LS (fenol, isotiocianato de guanidina, tiocianato de amonio, acetato de sodio, glicerol) ^1,14. transferencia samples a un nuevo tubo limpio o placa exterior del BSC antes del envasado para su retirada del laboratorio BSL-4.
2. muestras inactivadas sello térmico en tubos o placas en una bolsa de sellado por calor que contiene suficiente desinfectante 5% o solución de fijación para desinfectar el interior de la bolsa y el exterior de los tubos de muestra se someten a transferencia fuera del laboratorio BSL-4. Coloque esta bolsa en otra bolsa tras mismo procedimiento.
3. Sellar la segunda bolsa y colocar la bolsa sellada por calor en un tanque de agua que contiene la solución desinfectante 5% durante al menos 10 min para desinfectar el exterior de la bolsa sellada al calor.
4. Llenar un libro de registro tanque de agua en el interior del laboratorio delineando el número y tamaño de los tubos, el volumen en tubos, agente utilizado, el método de inactivación utilizado, y lugar para donde se transferirán muestras.
5. Coordinar con un colega en la parte exterior del laboratorio BSL-4 para recuperar la bolsa desde el tanque de agua y tomar muestras al laboratorio BSL-2.

Resultados

De los procedimientos apropiados dentro del laboratorio BSL-4 son fundamentales para asegurar la terminación segura y eficaz de los ensayos. Al referirse a la lista de control interno diario completado (Figura 1), el personal de laboratorio asegurar que el equipo está en pleno funcionamiento. El posicionamiento adecuado del cuerpo en el centro de la BSC se asegura de que el experimento se lleva a cabo bajo condiciones de flujo de aire óptima (Figura 2).

Discusión

Trabajo en un laboratorio BSL-4 requiere un tiempo considerable y mayor atención a los detalles. Cualquier tipo de trabajo en este entorno requiere bien entrenado, a fondo, y los individuos de conciencia. El ensayo estándar de placa viral proporciona un modelo preciso de un procedimiento común para trabajar con patógenos de graves consecuencias en el laboratorio BSL-4, ya que el ensayo implica varios conceptos principales en las que deben ser entrenados los trabajadores de laboratorio.

E...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Chem Plus	National Chemical Laboratories	255
Ethanol	Fisher	BP2818500
2 ml 96-Deep Well Plates	Fisher	278743
10 ml Serological Pipette	Fisher	13-678-11E
25 ml Serological Pipette	Fisher	13-678-11
6-well plates	Fisher	140675
Crystal Violet	Sigma	HT90132-1L
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	22-050-105
Tragacanth	Fisher	50-702-2000
20 μl Pipette Tips	Fisher	21-402-550
200 μl Pipette Tips	Fisher	21-402-561
1,000 μl Pipette Tips	Fisher	21-402-581
DMEM	Lonza	12-604Q
FBS	Sigma	F2442-500mL
Penicillin/Streptomycin	Lonza	17-602E
2x EMEM	Quality Biological	115-073-101
Pipettor	Drummond	4-000-101
1,000 μl Pipette	Rainin	L-1000XLS+
200 μl Pipette	Rainin	L-200XLS+
12-Well, Multichannel 200 μl Pipettor	Rainin	L12-200XLS+
8-Well, Multichannel 1,000 μl Pipettor	Rainin	LA8-1200XLS
Attest	Express Medical Supplies	MMM12192
Autoclave	Getinge	GEB 2404 AMB-2
Autoclave Bag	Fisher	01-828E
2,000 ml Beaker	Fisher	02-591-10H
Autoclave Tray	Fisher	13-359-20B
Pipette Tray	Fisher	13-361-5
37 °C Incubator	Fisher	WU-39321-00
Biohazard Can	Rubbermaid Commercial	FG614500 RED
Autoclave Tape	Fisher	15-903
Autoclave Rod	Made by IRF Facility	N/A
Light Box	Fisher	S11552
Heat Sealer	Fisher	NC9793612
Heat Seal Pouches	Fisher	01-812-25H
Biohazard Bag	Fisher	01-828E