Меры предосторожности и эксплуатационные процедуры в (A) BSL-4 лаборатории: 2. Общие правила

Резюме

Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.

Аннотация

Работа в лаборатории сдерживания уровня биологической безопасности 4 (BSL-4) требует времени и большого внимания к деталям. Та же работа, которая проводится в лаборатории BSL-2 с не высоким следствие патогенов будет занять значительно больше времени в условиях BSL-4. Это увеличило потребность во времени из-за множества факторов, которые направлены на защиту исследователя от лабораторных инфекций, рабочей среды от возможного загрязнения и местного сообщества от возможного выброса высокого следствие патогенов. Внутри лаборатории, движение ограничено из-за воздушных шлангов, прикрепленных к обязательным костюмы безопасности всего тела. Кроме того, дезинфекция каждого элемента, который удаляется из шкафов класса II биобезопасности (БББ) требуется. Специалисты лаборатории должны быть обучены в практике лаборатории BSL-4 и должны показать высокий профессионализм в навыки, которые они выполняют. В центре внимания этой статьи состоит в том, чтобы наметить надлежащие процедуры и методы для обеспечения лабораторной бiosafety и точность эксперимента с использованием стандартного вирусного анализа бляшек в качестве примера процедуры. В частности, собственные методы для безопасной работы в среде BSL-4 при проведении эксперимента будет визуально подчеркнуты. Эти методы включают в себя: создание BSC класса II для проведения экспериментов, надлежащая очистка BSC класса II, когда закончили работу, по обращению с отходами и безопасной утилизации отходов, образующихся внутри BSL-4 лаборатории, а также удаление инактивированных образцов изнутри BSL- 4 лаборатории в лабораторию BSL-2.

Введение

Как безопасность персонала лаборатории обработки высокого следственные патогенных микроорганизмов (нет инфекции профилактика, ни варианты лечения не существует) имеет первостепенное значение, У. С. Департамент здравоохранения и социальных служб США установило руководящие принципы для строительства объекта и передовых методов для безопасного проведения работы с патогенными микроорганизмами в биомедицинской и клинические лаборатории с точки зрения биологической безопасности ^1. Посредством законодательства и регулирования, многие из практики и процедур стали обязательные требования, которые должны соблюдаться при работе с этими возбудителями. В США, патогенные микроорганизмы, которые легко передаются от человека к человеку, привести к высокому уровню летальности, и / или потенциально способных оказать значительное воздействие общественного здравоохранения и биотерроризма, классифицируются как Национальный институт здравоохранения / Национального института аллергии и инфекционных Болезнь (NIH / NIAID) Приоритет патогены и или центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) Bioterrorism категории а Агенты ^2. Кроме того, чIGH-следствие патогенных микроорганизмов классифицируются как Tier 1 Выберите агентов , если эти патогены являются потенциальными агентами биотерроризма, имеют потенциал для массовых потерь или разрушительных последствий для экономики, жизненно важной инфраструктуры, или общественного доверия ^3.

BSL-4 операции, в том числе доступ к институтам с BSL-4 лаборатории, более высоко, чем контролируется BSL-2/3 операций. Например, он значительно сложнее получить доступ к лаборатории BSL-4 по сравнению с лабораторией BSL-2 или BSL-3 из-за существенных требований костюма подготовки, обширные требования наставничества, а также дополнительные предпосылки медицинской биобезопасности. Кроме того, существуют , как правило , чем больше физических барьеров безопасности в BSL-4 в сравнении с объекта BSL-2 или BSL-3 объекта ^4-6. Как указано в нашей первой статье о процедурах BSL-4 входа и выхода, сотрудники лаборатории проходят интенсивную подготовку и психологическое обследование , чтобы претендовать на вход в BSL-4 лаборатории ^7. Within лаборатории BSL-4, риск инфекции и ошибок можно избежать или смягчить соответствии с установленными процедурами. Исследования должны действовать осторожно и сознательно, с минимальным многозадачности или отвлечений. Наклонившись в положительных скафандры трудно, и лицевые щитки могут ограничивать такие процедуры, как микроскопии. Громоздкие перчатки препятствовать выполнению тонких моторных задач, таких как обработка мелких предметов или маркировки труб. Чтобы свести к минимуму время, проведенное в BSL-4 лаборатории, специалисты лаборатории должны пересмотреть процедуры работы с целью определения шагов, которые могут быть сделаны заранее в лаборатории BSL-2, а затем транспортировать эти материалы в лаборатории BSL-4 для завершения задачи (ов). При удалении материалов для дальнейшей обработки в BSL-2 лаборатории, материалы фиксируются и удаляются из лаборатории BSL-4 в герметичном контейнере вторичного. Примеры образцов, которые, возможно, должны быть удалены, включают: фиксированные пластины или трубки зараженного материала, который будет проанализирован связанный с ферментом immunosorbeнт анализа (ИФА), иммунофлюоресценции (РИФ), или полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В дополнение к большим физическим ограничениям, налагаемым средств индивидуальной защиты, требуемой в BSL-4 лаборатории сравнению с теми в BSL-2 лаборатории, процедуры инактивации высокого следствие патогенов в клеточной культуре пластин и утилизации отходов являются более жесткими, чем те, которые необходимы для менее патогенных вирусов учился в лаборатории BSL-2. Как минимум, эти методы должны соответствовать CDC требованию. Например, загрязненными клеток культуральные планшеты и другие материалы могут быть инактивированы с химическими реагентами, такими как нейтральные-буферном растворе формалина. Обработанные клеточных культур пластин или труб должны быть помещены в мешочки уплотнения тепла, содержащие формалин и удалены из лаборатории через замочить бак, заполненный жидким дезинфицирующим средством. ведра мусора заполнены дезинфицирующими растворами и распылить дезинфицирующие средства используются для временного приема отходов, образующихся во время эксперимента и для DISInfecting перчатки, чистка кабинета биологической безопасности поверхностей и инструментов, соответственно. Четвертичные дезинфицирующий раствор аммония в концентрации перечисленных считается золотым стандартом для всех США BSL-4 лаборатории (Barr J, личное сообщение, 2015). Твердые отходы из ведра отходов автоклавируют, чтобы устранить возможность загрязнения.

В попытке наглядно продемонстрировать рабочий процесс и ограничения общих процедур BSL-4, мы использовали стандартный вирусный анализ зубного налета в качестве примера обычно используемой вирусной процедуры. В то время как вирусная процедура анализа описана в общем, мы подчеркиваем процедуры по биологической безопасности, используемые для обеспечения безопасности персонала лаборатории в данном протоколе. Пожалуйста , обратитесь к предыдущим классическим визуализаций анализа бляшек для дополнительного фона на бляшка анализа техники ^8,9.

Процедуры , представленные здесь следовать спецификации BMBL намеченные CDC ^1. Тем не менее, представленные протоколыспецифичные для IRF-Фредерик. Каждый BSL-4 объекта имеет различные стандартные операционные процедуры (СОП) и методы работы, которые влияют на выполнение экспериментов в лаборатории BSL-4. Альтернативные процедуры управления потоком отходов и выполнения анализов бляшки могут отличаться в зависимости от управления и функционирования этих лабораторий. Тем не менее, общее понимание установки костюма лаборатории и процедуры для выполнения работы с классом II шкафов внутри среды BSL-4 BSL-4 поможет ученым понять ограничения и последствия для безопасности при рассмотрении исследования высокого риска патогенов. Повышение информированности внешних сотрудников за трудностей, окружающих работу в лаборатории BSL-4 может привести к скорректированным ожиданий и большей легкостью в разработке медицинских контрмер против в научном сообществе.

протокол

1. Лаборатория Вход

1. Соберите все поставки из лаборатории BSL-2 для эксперимента (например, клетки, средств массовой информации, а также расходные материалы ) до вступления в лаборатории BSL-4.
2. Завершите процедуру входа в BSL-4 (подробно описан в работе ^7).

2. Подготовка кабинета биологической безопасности II класса в лаборатории BSL-4

1. Оказавшись внутри лаборатории BSL-4, обеспечить ежедневный внутренний контрольный список (рис 1) была завершена. Заполните контрольный список, если контрольный список не был предварительно заполнена и указать, какие будут использоваться вирусы. Если контрольный перечень уже завершено, добавьте его имя и какой вирус будет использоваться в списке.
2. Почистите BSC класса II путем распыления вниз всю внутреннюю часть BSC (включая створке) с 5% -ным раствором двойной четвертичной дезинфицирующим аммония (например, н-алкил диметил бензил хлорида аммония, н-алкил диметил этил бензил аммонийхлоридом или другим дезинфицирующим подходящим для агента используется) и вытирают бумажным полотенцем ^10,11. Спрей 70% раствор этанола внутри шкафа и створкой, чтобы удалить липкий дезинфицирующий раствор.
3. Если сидеть, установите кресло перед BSC класса II на удобной высоте , чтобы гарантировать , что задняя часть корпуса может быть достигнуто и что лицо лабораторного специалиста расположено выше переднего отверстия (рисунок 2) ^11.
4. Подготовьте контейнер для отходов для кабинета биологической безопасности. Убедитесь, что конечная концентрация двойного четвертичного аммония дезинфицирующего раствора в контейнер для отходов не менее чем на 5%. План и сделать так, 10% -ный раствор, к которому отходы будут добавлены, что будет разбавлять дезинфицирующее средство. Кроме того, поместите пульверизатор с 5% двойным четвертичного дезинфицирующим раствором аммония внутри класса II BSC для распыления все детали перед удалением и руки в перчатках во время и после завершения анализа.
5. Поместите соответствующие материалы , необходимые для всего эксперимента в BSC класса II еще в шкафу , как это возможно , чтобы избежать повторных введений материала в BSC класса II и нарушению воздушного потока ^11.

3. Пример: Налет Анализ

1. Получить вируссодержащих образцы и контролировать вирус из места хранения вручную и оттаивать материалов в термостате при 37 ° С.
2. Добавьте лунки 6-луночные планшеты, которые будут использоваться в соответствии с разведениями вируса запланированным. Отметьте крышки и тело пластин для обеспечения успешного согласования, если крышки и тело разделены.
3. Принесите материалы из шагов 3,1-3,2 в II BSC класса. Поместите все элементы, которые имеют или не будет вступать в контакт с вирусом на одной стороне ( «чистую сторону») и отходов на другой стороне ( "грязная сторона"). Если это возможно, сохранить "чистые предметы" по крайней мере 30 см друг от друга от "грязных предметов" во время аэрозольного видов деятельности ¹1.
4. Работать как можно ближе к внутреннему центру класса II BSC , как это возможно, так как внутри центр предназначен для наиболее эффективного положения , чтобы защитить себя ^11.
5. Удалить 50 мкл образца вируса и управления вируса и помещают в 450 мкл модифицированной среды Игла Дульбекко с 2% фетальной бычьей сыворотки. Продолжайте делать серийные разведения , как далеко по мере необходимости (рис 3А).
6. В разведениях, смешать образцов вирусов по крайней мере 5 раз с наконечником пипетки медленно и осторожно, пытаясь свести к минимуму образование пузырьков воздуха в образцах. Изменение пипеток после каждого добавления к следующему разбавлении скважины.
7. В последнем разведении, после смешивания образца 5 раз, отказаться от 50 мкл образца вируса в контейнер для отходов, чтобы обеспечить равные объемы разведений.
8. При утилизации наконечников, промойте каждый наконечник с дезинфицирующим раствором из ведра отходов обеззараживать внутри и снаружи наконечника перед тем expellING наконечник в ведро для отходов.
9. После того, как разведений сделаны, установить Разрежающий скважины в сторону и начать отсасывание носитель из лунки для культивирования клеток пластин, в результате чего 500 мкл среды в каждую лунку 6-луночного планшета.
10. Закончив с наконечником пипетки, аспирация дезинфицирующий раствор из ведра отходов в верхнюю часть пипетки с помощью ручного, регулируемой громкостью, кнопочный дозаторов, чтобы обеспечить надлежащее обеззараживание внутри пипетки. Оставьте кончик в ведро с отходами до конца эксперимента.
11. После того, как средства массовой информации были удалены из пластин, добавьте 100 мкл правильного образца в соответствующую лунку в предварительно меченных пластин в двух экземплярах, каждый изменяя советы для каждого образца.
12. После завершения анализа бляшек прививках, спрей от руки в перчатках с дезинфицирующим раствором и использовать бумажное полотенце, смоченное дезинфицирующим раствором, чтобы вытереть наружную поверхность всех пластин перед установкой пластины обратно в инкубатор вручную. реторфа этот процесс, пока все пластины не возвращаются в инкубатор.
13. Раскачивать пластины в движение по фигуре 8, чтобы обеспечить надлежащее рассеивание образца над клетками каждые 15 мин в течение 1 часа.
14. После завершения качалки пластин, возвращают листы в BSC класса II вместе со смесью минимальной необходимой среды 2x Игла и 1,6% трагакант, полутвердого накладкой, что легче манипулировать, чем агароза, используемый для наложения тесту с посевом.
15. Добавляют 2 мл накладываемого смеси в каждую лунку в 6-луночного планшета и рок еще раз в движении по фигуре 8 для равномерного распределения наложения по всей поверхности скважины. Повторите этот процесс, пока все хорошо используется не перекрывается с наложенной смеси.
16. Убедитесь в том, что кончик серологической пипетки не касается какой-либо жидкости в скважинах, чтобы избежать перекрестного загрязнения при выполнении процедуры наложения.

4. Удаление отходов и очистки приборов и биологической безопасности кабинета

<ол>

Полностью погрузить в воду все отходы в 5% растворе дезинфицирующего средства в ведро с отходами в течение времени контакта не менее 10 мин. Дезинфекцию пипеток, серологических пипеток и других отходов, как это описано выше. Кроме того, брызги ведро отходов (внутри и снаружи) с 5% -ным раствором дезинфицирующего пусть решение оставаться в контакте с ковшом отходов в течение времени контакта 10 мин.

В ожидании времени контакта, чтобы истечь для отходов, смочите бумажное полотенце с 5% -ным раствором дезинфицирующего средства, вытирать инструменты, такие как микропипетками, и удалить их из BSC. Спрей руки в перчатках с 5% -ным раствором дезинфицирующего перед приведением руки в перчатках из II BSC класса.

1. После удаления микропипетки из BSC, протрите их отдельной бумажным полотенцем с 70% -ным раствором этанола, чтобы избежать липкого осадка продукта на инструментах. Спрей любые инструменты, которые не могут быть эффективно протирать 5% дезинфицирующего и оставить в контакте с раствором в КБС в течение 10 мин.

После достаточного времени контакта, удалить все элементы из BSC. Возьмите предметы, в том числе отходов ведро отходов, содержащих материалы, к стоку. Полоскание предметы, которые могут быть использованы повторно, чтобы удалить дезинфицирующий остаток. Верните все элементы в их местах хранения.

Очистите рабочую поверхность КБС в класс II, кабинет стороны и назад, интерьер из стекла и створки ¹ с 5% -ным раствором дезинфицирующего средства с последующим 70% -ным раствором этанола.

Вытащить и слейте серологических пипеток из ведра отходов и место поверхность-дезинфицировать серологических пипеток в отдельные лотки пипетки для автоклавирования (серологические пипетки может представлять опасность высевки и может порваться через мешок для мусора. Поместите эти пипетки в жесткий односторонний контейнер перед автоклавирование).

Залить содержимое ведра отходов в сетчатый фильтр, помещенной в нижней части раковины.

Доведите контейнер для биологически опасных отходов, который облицован с красным мешком биологической опасности раковине и сбросить содержимое straineг в красную сумку для биологически опасных отходов. Не суйте в сито, чтобы удалить микропипетка советы, которые могут приклеиться к внутренней поверхности фильтра. Хит сетчатый фильтр вдоль внутренней части контейнера для отходов, пока все советы не будут удалены, или использовать пару пинцета, чтобы удалить советы из сетчатого фильтра.

Промыть ведро отходов и место, чтобы высушить на стойке рядом с раковиной.

5. автоклавирование отходов

1. Удалите сумку биологической опасности из контейнера для биологически опасных отходов и поместить в автоклав лоток на тележке.
2. Оставьте биологически опасных открытыми мешки и поместить часть автоклава ленты на внешней стороне сумки, соединяя сторон лотка автоклавный, чтобы держать сумку, прикрепленную в лотке.
3. Поместите две части автоклава ленты на серологического лотке пипетку и пометьте его со своими инициалами и датой. Поместите серологические пипетки поднос на тележке с подносом в автоклаве.
4. Откройте автоклав. Подключите входящий в комплект автоклав погрузка / разгрузка окRT в автоклав и вывести складную автоклавного платформу для отдыха на тележке.
5. Извлеките металлический стержень из автоклава и открыть верхнюю часть. Поместите флакон биологический индикатор , содержащий споры Geobacillus stearothermophilus в металлический стержень , чтобы проверить , что цикл стерилизации в автоклаве был успешно завершен.
6. Установите металлический стержень в центре мешка отходов в лотке автоклава, но убедитесь, что металлический стержень по-прежнему легко доступны.
7. Поместите автоклавный поддон, заполненный отходами и серологических пипеток лоток на выдвигающейся автоклавного платформы и толкать его обратно в автоклав.
8. Отсоединение автоклав загрузки / разгрузки тележки из автоклава и закройте автоклавной дверцу.
9. Запустите автоклав.
10. Не оставляйте автоклав до начала цикла. Операционный экран автоклава будет показывать время, оставшееся для этого запуска.
11. После того, как автоклав запуска завершена, удалите биологическую INDicator и оценки для роста путем нагревания в указанном инкубаторе. Если рост обнаружен на биологический индикатор, повторно запустить мусор в автоклаве, а также оценить заново индикатор. Если никакого роста не обнаружено, удалить мусор с объекта.

6. Пример: Фиксация и Окрашивание зубной налет Assays

1. После того, как соответствующее количество дней (который зависит от вируса, используемого) прошло, возвращают обратно в лабораторию и выполнять действия из секций 1 и 2 еще раз.
2. Осторожно удалите анализа бляшек пластины из инкубатора завершено на шаге 3.1.2, и поместить в класс II BSC вручную.
3. Пипетировать от всех средств массовой информации и наложения материала и разлить в контейнер дезинфицирующим раствором и заменить смесью 10% нейтральном забуференном формалине и 0,8% кристаллическим фиолетовым ^12,13. Пусть смесь остается на пластинах в течение 30 минут для инактивации вируса на пластинах.
4. После инактивации, осторожно удалите нейтральныйбуферном растворе формалина / кристаллический фиолетовый смесь и поместить в отдельный контейнер для отходов должны быть нейтрализованы перед утилизацией.
5. Спрей руки в перчатках с дезинфицирующим средством и протрите внешнюю поверхность пластин перед передачей их из II BSC класса, как описано выше.
6. Перейдите к раковине, сполоснуть пластины, чтобы удалить избыток пятно, а затем поместить тарелки на тележке, чтобы высохнуть.
7. После того, как пластины полностью высохли, используйте светлую коробку для подсчета бляшек. Запишите все счетчики и вычислить титр вируса из стандартного уравнения (рис 3B).

7. Удаление образцов из лаборатории BSL-4

1. Инактивирует любые образцы, которые будут манипулируют под BSL-2 лабораторных условиях. Выполните один из двух методов , утвержденных внутренней офис по биологической безопасности в IRF-Фредерик , используя 10% нейтральный забуференный формалин (НСБ) или Trizol LS (фенол, гуанидинизотиоцианата, тиоцианат аммония, ацетат натрия, глицерин) ^1,14. Передача саmples в новую чистую пробирку или пластины за пределами BSC перед упаковкой для удаления из лаборатории BSL-4.
2. Термосвариваемого инактивированных образцов в трубах или пластин в термосвариваемого мешочек, содержащий достаточное количество 5% дезинфицирующий раствор или Фиксирующий раствор для дезинфекции внутри мешка и наружную поверхность образца труб, проходящих передачу из лаборатории BSL-4. Поместите этот мешок в другой сумке следуя той же процедуре.
3. Уплотнение второй мешочек и поместите термосвариваемый пакет в данк бак, содержащий 5% дезинфицирующий раствор в течение по крайней мере 10 минут для дезинфекции за пределами термосвариваемый пакет.
4. Заполните книгу журнала данк бак внутри лаборатории путем очерчивания количество и размер труб, объем в пробирках, агент, используемый метод инактивации используется, и комната, где образцы будут переданы.
5. Координата с коллегой по внешней стороне лаборатории BSL-4, чтобы получить мешочек из замочить резервуара и берут пробы в лабораторию BSL-2.

Результаты

После соответствующих процедур в лаборатории BSL-4 имеют решающее значение для обеспечения безопасного и эффективного завершения анализов. Ссылаясь на заполненного ежедневного внутреннего контрольного списка (рисунок 1), сотрудники лаборатории убедитесь , ч?...

Обсуждение

Работа в лаборатории BSL-4 требует значительного времени и дополнительного внимания к деталям. Любой тип работы в этой среде требует хорошо подготовленных, тщательное и добросовестные лиц. Стандартный вирусный анализ бляшек дает точную модель общей процедуры для работы с высоким следс?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Chem Plus	National Chemical Laboratories	255
Ethanol	Fisher	BP2818500
2-ml 96-Deep Well Plates	Fisher	278743
10-ml Serological Pipette	Fisher	13-678-11E
25-ml Serological Pipette	Fisher	13-678-11
6-well plates	Fisher	140675
Crystal Violet	Sigma	HT90132-1L
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	22-050-105
Tragacanth	Fisher	50-702-2000
20-μl Pipette Tips	Fisher	21-402-550
200-μl Pipette Tips	Fisher	21-402-561
1000-μl Pipette Tips	Fisher	21-402-581
DMEM	Lonza	12-604Q
FBS	Sigma	F2442-500mL
Penicillin/Streptomycin	Lonza	17-602E
2X EMEM	Quality Biological	115-073-101
Pipettor	Drummond	4-000-101
1000-μl Pipette	Rainin	L-1000XLS+
200-μl Pipette	Rainin	L-200XLS+
12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor	Rainin	L12-200XLS+
8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor	Rainin	LA8-1200XLS
Attest	Express Medical Supplies	MMM12192
Autoclave	Getinge	GEB 2404 AMB-2
Autoclave Bag	Fisher	01-828E
2000-ml Beaker	Fisher	02-591-10H
Autoclave Tray	Fisher	13-359-20B
Pipette Tray	Fisher	13-361-5
37°C Incubator	Fisher	WU-39321-00
Biohazard Can	Rubbermaid Commercial	FG614500 RED
Autoclave Tape	Fisher	15-903
Autoclave Rod	Made by IRF Facility	N/A
Light Box	Fisher	S11552
Heat Sealer	Fisher	NC9793612
Heat Seal Pouches	Fisher	01-812-25H
Biohazard Bag	Fisher	01-828E