Precauções de segurança e Procedimentos Operacionais em um (A) de laboratório BSL-4: 2. Práticas Gerais

Resumo

Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.

Resumo

Trabalho em um laboratório de contenção biossegurança nível 4 (BSL-4) requer tempo e uma grande atenção aos detalhes. O mesmo trabalho que é feito em um laboratório BSL-2 com patógenos sem alto consequência vai demorar muito mais em um ambiente BSL-4. Este aumento da exigência de tempo é devido a uma multiplicidade de factores que visam proteger o pesquisador da infecções adquiridas em laboratório, o ambiente de trabalho de contaminação potencial e da comunidade local da possível libertação de patógenos de alta-consequência. Dentro do laboratório, o movimento é restrito devido a mangueiras de ar ligados aos ternos de segurança de corpo inteiro obrigatórios. Além disso, a desinfecção de cada artigo que é removido armários de segurança biológica de Classe II (BSC) é necessária. especialistas de laboratório deve ser treinado nas práticas de laboratório BSL-4 e deve mostrar alta proficiência nas habilidades que eles estão realizando. O foco deste artigo é descrever procedimentos e técnicas para garantir laboratório b adequadasiosafety e precisão experimental utilizando um ensaio de placa viral padrão como um procedimento de exemplo. Em particular, as técnicas adequadas para trabalhar com segurança em um ambiente de BSL-4 ao realizar um experimento será visualmente enfatizado. Estas técnicas incluem: a criação de um BSC Classe II em experiências, limpeza adequada do BSC Classe II, quando terminar o trabalho, gestão de resíduos e eliminação segura dos resíduos gerados dentro de um laboratório BSL-4, ea remoção de amostras inativadas de dentro de um BSL- 4 laboratório para laboratório BSL-2.

Introdução

Como a segurança do pessoal de laboratório de manipulação patógenos de alta-consequência (sem profilaxia de infecção nem opções de tratamento existe) é primordial, o Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos estabeleceu diretrizes para construção de instalações e melhores práticas para a condução segura do trabalho com patógenos em biomédica e laboratórios de análises clínicas, numa perspectiva de biossegurança ^1. Através de legislação e regulamentação, muitas das práticas e procedimentos tornaram-se requisitos obrigatórios que devem ser seguidas para o trabalho com esses patógenos. Em os EUA, patógenos que são facilmente transmitidos de pessoa para pessoa, resultam em altas taxas de letalidade, e / ou têm o potencial de grande impacto na saúde pública e bioterrorismo, são categorizados como Instituto Nacional de Saúde / Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas doença (NIH / NIAID) a prioridade de um Pathogens e ou Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Bioterrorism da categoria A Agentes ^2. Além disso, hpatógenos igh-conseqüência são classificados como nível 1 selecionar agentes se estes patógenos são agentes de bioterrorismo potenciais, têm potencial de mortes em massa ou efeitos devastadores para a economia, infra-estrutura crítica, ou a confiança pública ^3.

BSL-4 operações, incluindo o acesso aos institutos com BSL-4 laboratórios, são mais altamente controlada do que BSL-2/3 operações. Por exemplo, é substancialmente mais difícil obter acesso a um laboratório BSL-4 em comparação com um laboratório BSL-2 ou BSL-3 devido a requisitos substanciais de formação terno, extensos requisitos de orientação e pré-requisitos de biossegurança médicos adicionais. Além disso, há normalmente barreiras de segurança mais físicas em uma facilidade BSL-4 versus uma BSL-2 ou NBS-3 facilidade ^4-6. Conforme descrito no nosso primeiro artigo sobre procedimentos BSL-4 entrada e saída, pessoal de laboratório submetidos a treinamento e exames psicológicos para se qualificar para a entrada no laboratório BSL-4 ^7. Within laboratório BSL-4, risco de infecção e os erros são evitados ou reduzidos, seguindo os procedimentos estabelecidos. A pesquisa deve proceder com cuidado e deliberadamente, com multitarefa mínimo ou distrações. Curvando-se em ternos de pressão positiva é difícil, e o protetor facial pode restringir procedimentos como a microscopia. luvas de volumosas impedem o desempenho de tarefas motoras finas, como a manipulação de pequenos itens ou rotulagem tubos. Para minimizar o tempo gasto em BSL-4 laboratórios, especialistas de laboratório deve rever os procedimentos de trabalho para identificar as etapas que podem ser feitas com antecedência em um laboratório BSL-2 e, em seguida, transportar esses materiais para o laboratório BSL-4 para a conclusão da tarefa (s). Quando a remoção de materiais para posterior processamento em laboratório NB-2, os materiais são fixas e removidas do laboratório BSL-4 num contentor selado secundário. Exemplos de amostras que podem ter de ser removidos incluem: placas fixas ou tubos de material infectado que serão analisados ​​por immunosorbe ligado a enzimaNT ensaio (ELISA), ensaio de imunofluorescência (IFA), ou reacção em cadeia da polimerase (PCR).

Além de maiores limitações físicas impostas pelo equipamento de protecção individual exigido na BSL-4 laboratórios, em comparação com aqueles em BSL-2 laboratórios, os procedimentos de inativação de patógenos de alta-consequência em placas de cultura de células e eliminação de resíduos são mais rigorosas do que as necessárias para vírus menos patogénicos estudado num laboratório de NBS-2. No mínimo, estes métodos devem cumprir o requisito CDC. Por exemplo, as placas de cultura de células contaminadas e outros materiais podem ser inactivados com reagentes químicos, tais como formalina neutra tamponada. placas ou tubos de cultura de células tratadas são para ser colocados em bolsas de vedação de calor contendo formalina e removido do laboratório através de um tanque de imersão cheia com um líquido desinfectante. As caçambas para resíduos preenchido com soluções desinfectantes e pulverizar desinfectantes são utilizados para receber temporariamente resíduos gerados durante o experimento e para DISInfecting luvas, limpeza de superfícies e instrumentos de cabine de segurança biológica, respectivamente. solução desinfetante de amônio quaternário, na concentração referida é considerada o padrão ouro para todos os US BSL-4 laboratórios (Barr J, comunicação pessoal, 2015). resíduos sólidos de um balde resíduos são autoclavados para eliminar potencial de contaminação.

Num esforço para demonstrar visualmente o fluxo de trabalho e as limitações gerais de procedimentos BSL-4, foi utilizado um ensaio de placas virais padrão como um exemplo de um procedimento virai utilizada. Enquanto o procedimento de ensaio viral é descrito em geral, destacamos os procedimentos de biossegurança utilizados para garantir a segurança do pessoal de laboratório neste protocolo. Por favor, consulte as visualizações ensaio de placa clássicos anteriores para o fundo adicional sobre a técnica ^8,9 ensaio de placa.

Os procedimentos aqui apresentados seguem as especificações BMBL delineados pela CDC ^1. No entanto, os protocolos são apresentadosespecífica para o IRF-Frederick. Cada instalação BSL-4 tem diferentes procedimentos operacionais padronizados (POPs) e métodos de operação que afetam a execução de experimentos em laboratório BSL-4. procedimentos alternativos para a gestão de fluxos de resíduos e execução de ensaios de placa pode variar de acordo com a gestão e operação desses laboratórios. No entanto, uma compreensão geral da instalação de um laboratório e procedimentos para a realização de trabalhos com a classe armários II dentro do ambiente BSL-4 terno BSL-4 vai ajudar os cientistas a entender as limitações e as implicações de segurança ao contemplar estudos de patógenos de alto risco. O aumento da conscientização de colaboradores exteriores das dificuldades que cercam o trabalho em um laboratório BSL-4 pode levar a expectativas ajustadas e maior facilidade no desenvolvimento de contramedidas médicas na comunidade de pesquisa.

Protocolo

1. Laboratório Entry

1. Reúna todos os fornecimentos de um laboratório BSL-2 para o experimento (por exemplo, células, mídia e consumíveis) antes da entrada para o laboratório BSL-4.
2. Conclua o procedimento de entrada BSL-4 (descrito em detalhe na referência ^7).

2. Preparação de uma Classe II Biossegurança Gabinete na BSL-4 Laboratory

1. Uma vez que no interior do laboratório BSL-4, assegurar a lista de verificação interna diariamente (Figura 1) tiver sido completada. Complete a lista de verificação se a lista de verificação não tenha sido previamente preenchida e indicar quais vírus serão usados. Se a lista de verificação já foi concluído, adicione o nome e qual o vírus será usado para a lista.
2. Limpar o BSC Classe II por pulverização para baixo todo o interior do BSC (incluindo o caixilho) com uma solução desinfectante quaternário de amónio dupla 5% (por exemplo, n-alquil dimetil benzil cloreto de amónio, n-alquil dimetil benzil amónio acetatocloreto ou outro desinfetante apropriada para o agente a ser utilizado) e limpe com toalhas de papel ^10,11. Spray de solução de etanol a 70% dentro do armário ea faixa para remover a solução desinfectante brega.
3. Se assentado, definir a cadeira na frente do BSC Classe II a uma altura confortável para assegurar que a parte de trás do armário pode ser atingido e que a face do especialista laboratório está situado acima da abertura frontal (Figura 2) ^11.
4. Prepare um recipiente de resíduos para a cabine de segurança biológica. Certifique-se de que a concentração final da solução desinfectante de amónio quaternário dupla no recipiente de resíduos não é menos do que 5%. Planejar adequadamente e fazer uma solução a 10% ao qual serão adicionados resíduos que irá diluir o desinfectante. Além disso, colocar uma garrafa de pulverização com uma solução desinfectante de amónio quaternário 5% dupla dentro da classe II BSC para pulverizar quaisquer itens antes da remoção e luvas durante e após a conclusão do ensaio.
5. Coloque os materiais apropriados necessários para todo o experimento na classe II BSC, tanto para trás no gabinete possível para evitar introduções material repetido para o BSC Classe II e interrupção do fluxo de ar ^11.

3. Exemplo: Placa de Ensaio

1. Recuperar amostras que contêm vírus e de controlo do vírus a partir do local de armazenamento à mão e descongelar materiais numa incubadora a 37 ° C.
2. Rotular os poços das placas de 6 poços a serem usados ​​de acordo com as diluições do virus planeadas. Marcar as tampas e corpos de as placas para assegurar a correspondência bem sucedida se as tampas e corpo são separados.
3. Traga materiais de passos 3,1-3,2 para o BSC Classe II. Coloque todos os itens que não têm ou não entram em contato com o vírus em um lado ( "lado limpo") e resíduos do outro lado ( "lado sujo"). Se possível, mantenha "itens limpos" pelo menos 30 cm de distância de "itens sujos" durante as atividades de aerossol de geração de ¹1.
4. Trabalhar o mais próximo possível do centro interior do BSC Classe II quanto possível, como o centro interior é projetado para ser a posição mais eficaz para proteger a si mesmo ^11.
5. Retirar 50 ul de amostra e de controlo de vírus de vírus e colocar em 450 uL de meio de Eagle modificado por Dulbecco com soro bovino fetal a 2%. Proceda com fazer diluições em série, tanto fora como necessário (Figura 3A).
6. Durante as diluições, misturar as amostras de vírus, pelo menos, 5 vezes com uma ponta de pipeta lentamente e com cuidado durante a tentativa de minimizar a geração de bolhas de ar nas amostras. Mudar as pontas de pipeta depois de cada adição para a próxima diluição bem.
7. Na última diluição, depois de misturar a amostra 5 vezes, descartar 50 ul de amostra de vírus no contentor de resíduos para assegurar volumes iguais de diluições.
8. Ao descartar dicas, lavar cada ponta com uma solução desinfectante do balde resíduos para descontaminar o interior eo exterior da ponta antes de expeliring ponta no balde de resíduos.
9. Uma vez que as diluições são feitas, definir as cavidades de diluição de lado e começar a aspiração meios dos poços de placas de cultura celular, deixando 500 ul de meio, em cada poço de uma placa de 6 poços.
10. Quando terminou com a ponta da pipeta, aspirado solução desinfectante a partir do balde de lixo para o topo da pipeta usando um manual, de volume ajustável, de botão pipetador, para assegurar uma descontaminação adequada do interior da pipeta. Deixar a ponta para dentro do balde de resíduos até ao final da experiência.
11. Uma vez que os meios foram removidos a partir das placas, adicionar 100 ul de amostra correcto para o poço apropriado nas placas pré-rotulados em duplicado, cada mudança de pontas para cada amostra.
12. Após a conclusão das inoculações ensaio de placa, spray off mãos enluvadas com a solução desinfetante e usar uma toalha de papel embebido com solução desinfetante para limpar o exterior de todas as placas antes de colocar as placas de volta para a incubadora com a mão. Réturfa este processo até que todas as placas estão de volta para a incubadora.
13. Rocha se as placas num movimento Figura-8 para assegurar a dispersão adequada da amostra sobre as células a cada 15 min durante 1 hora.
14. Após a conclusão das placas de balanço, de regresso placas para a BSC de classe II juntamente com uma mistura de meio essencial mínimo de 2x Eagle e 1,6% de tragacanto, uma sobreposição semi-sólida que é mais fácil de manipular do que de agarose, utilizado para a sobreposição do ensaio de placa.
15. Adicionar 2 ml da mistura de sobreposição para cada poço de uma placa de 6 poços e rocha, mais uma vez em uma forma de 8 de movimento para uma distribuição uniforme do revestimento em toda a superfície do poço. Repita este processo até que cada bem utilizado é revestida com a mistura de sobreposição.
16. Certifique-se de que a ponta da pipeta sorológica não toque qualquer líquido nos poços para evitar a contaminação cruzada durante a execução do procedimento de sobreposição.

4. Eliminação de Resíduos e Limpeza dos instrumentos e Biossegurança Gabinete

1. Completamente submergir todo o material de resíduos na solução desinfetante 5% no balde resíduos para um tempo de contacto de pelo menos 10 min. Desinfectar pontas de pipeta, pipetas serológicos e outros resíduos como descrito acima. Além disso, pulverizar o balde de resíduos (dentro e fora) com solução desinfetante 5% deixar a solução permanecer em contato com o balde de resíduos para um tempo de contacto de 10 min.
2. Enquanto espera para o tempo de contato a decorrer para os resíduos, molhe uma toalha de papel com uma solução desinfectante 5%, limpe instrumentos como micropipetas e removê-los do BSC. Pulverizar as mãos enluvadas com solução desinfetante 5% antes de trazer as mãos enluvadas para fora do BSC Classe II.
   1. Depois de retirar as micropipetas do BSC, limpe-os com uma toalha de papel separado com solução de etanol a 70% para evitar o acúmulo pegajoso nos instrumentos. Spray de quaisquer instrumentos que não podem ser eficazmente eliminados para baixo com 5% desinfectante e deixar em contacto com a solução no BSC durante 10 min.
3. Depois de um tempo de contacto suficiente, remova todos os itens da BSC. Tome itens, incluindo balde de resíduos que contenham resíduos, para a pia. Lavar os itens que podem ser reutilizados para remover resíduos de desinfectante. Retornar todos os itens para os seus locais de armazenamento.
4. Limpe a superfície de trabalho do BSC Classe II, os lados do armário e volta, interior de vidro, ea faixa ¹ com solução desinfetante 5%, seguido de solução de etanol a 70%.
5. Retire e escorra as pipetas serológicos do balde de descarga e colocar pipetas serológicos desinfectados de superfície em bandejas de pipeta separadas por autoclavagem (pipetas serológicos podem apresentar um risco de farelos e pode rasgar o saco de lixo. Coloque estas pipetas em um recipiente difícil face antes autoclavagem).
6. Verter o conteúdo do recipiente de resíduos em uma peneira colocado na parte inferior da pia.
7. Traga um recipiente de resíduos de risco biológico que é forrado com um saco de risco biológico vermelho para a pia e despejar o conteúdo do strainer dentro do saco vermelho do biohazard. Não toque dentro do filtro para remover dicas micropipeta que podem furar o interior do filtro. Bata o filtro ao longo do interior do recipiente de resíduos até que todas as dicas são removidos, ou usar um par de pinças para remover dicas do filtro.
8. Enxaguar o balde e colocar os resíduos para secar na prateleira ao lado da pia.

Resíduos 5. autoclavagem

1. Retire o saco de risco biológico do recipiente de resíduos de risco biológico e coloque em uma bandeja de autoclave em um carrinho.
2. Deixar sacos de risco biológico aberta e colocar um pedaço de fita de autoclave sobre a parte externa do saco, que liga os lados do tabuleiro da autoclave para manter o saco fixado na bandeja.
3. Coloque dois pedaços de fita crepe na bandeja ponteira do sorológica e rotulá-la com os próprios iniciais e a data. Coloque a bandeja da pipeta sorológica no carro com a bandeja de autoclave.
4. Abrir a autoclave. Ligue o autoclave de carga / descarga ca fornecidart para a autoclave e trazer para fora a plataforma autoclave retrátil para descansar no carrinho.
5. Retirar a vareta de metal a partir do autoclave e abrir a parte superior. Coloque um frasco indicador biológico contendo esporos de Geobacillus stearothermophilus na haste de metal para verificar se o ciclo de esterilização autoclave foi concluída com êxito.
6. Coloque a haste de metal para o centro do saco de resíduos na bandeja da autoclave mas garantir que a barra de metal é ainda facilmente acessíveis.
7. Coloque a bandeja autoclave cheia com resíduos e bandeja pipeta sorológica para a plataforma autoclave retrátil e empurrá-lo de volta para a autoclave.
8. Retire a autoclave carrinho de carga / descarga da autoclave e fechar a porta da autoclave.
9. Comece a autoclave.
10. Não deixe a autoclave até que o ciclo foi iniciado. A tela de operação da autoclave indicará o tempo restante para esse prazo.
11. Depois de o autoclave de execução é concluída, remova o ind biológicaicator e avaliar para o crescimento por meio de aquecimento num incubador especificado. Se o crescimento for detectado no indicador biológico, re-executar o lixo na autoclave, e avaliar de novo indicador. Se nenhum crescimento é detectado, remova o lixo a partir da instalação.

6. Exemplo: fixação e coloração da placa Ensaios

1. Após o número apropriado de dia (que é dependente do vírus utilizado) tenha passado, o retorno de volta para o laboratório e executar passos de secções 1 e 2, mais uma vez.
2. Remova cuidadosamente placas de ensaio de placa da incubadora completou na etapa 3.1.2, e coloque no BSC Classe II com a mão.
3. Pipeta off toda a mídia e sobreposição de materiais e dispensam em desinfectante recipiente de solução e substituir com uma mistura de 10% de formalina tamponada neutra e 0,8% de violeta cristal ^12,13. Deixe a mistura permanecer nas placas, durante 30 min para inactivar o vírus nas placas.
4. Após inactivação, remova cuidadosamente o neutrotamponada mistura violeta formalina / cristal e coloque em um recipiente de resíduos separado para ser neutralizados antes da disposição.
5. Pulverizar as mãos enluvadas com desinfectante e limpe o exterior das placas antes de passá-los para fora do BSC Classe II como descrito acima.
6. Prossiga até a pia, lavar as placas para remover o excesso mancha, e em seguida, coloque as placas em um carrinho para secar.
7. Uma vez que as placas estão completamente secos, use uma caixa de luz para contar as placas. Grave todas as contagens e calcular os títulos de vírus a partir da equação padrão (Figura 3B).

7. remoção de amostras da BSL-4 Laboratory

1. Inactivar quaisquer amostras que serão manipulados sob BSL-2 condições de laboratório. Siga um dos dois métodos aprovados pelo gabinete de segurança biológica interna na IRF-Frederick, utilizando 10% de formalina neutra tamponada (NBF) ou Trizol LS (fenol, isotiocianato de guanidina, tiocianato de amónio, acetato de sódio, glicerol) ^1,14. transferência samples para um novo tubo limpo ou placa fora do BSC antes da embalagem para a remoção do laboratório BSL-4.
2. amostras inactivadas de selagem por calor em tubos ou placas em uma bolsa de selagem por calor suficiente desinfectante contendo 5% ou solução fixadora para desinfectar o interior do saco e no exterior dos tubos de amostra submetidos a transferência para fora do laboratório BSL-4. Coloque esta bolsa em outra bolsa seguinte mesmo procedimento.
3. Selar a segunda bolsa e colocar a bolsa selada a quente em um tanque de imersão que contém a solução desinfectante 5% durante pelo menos 10 min para desinfectar o exterior da bolsa selada pelo calor.
4. Preencher um diário de bordo tanque d'água dentro do laboratório por delinear o número e tamanho dos tubos, o volume em tubos, agente utilizado, o método de inactivação utilizados, e lugar para onde as amostras serão transferidos.
5. Coordenar com um colega na parte externa do laboratório BSL-4 para recuperar a bolsa a partir do tanque de imersão e retirar amostras para o laboratório de NBS-2.

Resultados

Seguindo os procedimentos adequados dentro do laboratório BSL-4 são críticas para assegurar a conclusão segura e eficaz de ensaios. Ao referir-se a lista de verificação interno diário concluída (Figura 1), o pessoal do laboratório garantir que o equipamento esteja totalmente operacional. Posicionamento apropriado do corpo no centro do BSC garante que a experiência é realizada em condições óptimas de fluxo de ar (Figura 2). A amostra de vír...

Discussão

Trabalho em um laboratório BSL-4 requer um tempo considerável e atenção adicional aos detalhes. Qualquer tipo de trabalho neste ambiente requer bem treinado, completa e indivíduos conscientes. O ensaio de placa viral norma fornece um modelo preciso de um procedimento comum para trabalhar com patógenos de alta-consequência no laboratório BSL-4, como o ensaio envolve vários conceitos importantes em que os trabalhadores de laboratório devem ser treinados.

A primeira grande conceito é...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Chem Plus	National Chemical Laboratories	255
Ethanol	Fisher	BP2818500
2-ml 96-Deep Well Plates	Fisher	278743
10-ml Serological Pipette	Fisher	13-678-11E
25-ml Serological Pipette	Fisher	13-678-11
6-well plates	Fisher	140675
Crystal Violet	Sigma	HT90132-1L
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	22-050-105
Tragacanth	Fisher	50-702-2000
20-μl Pipette Tips	Fisher	21-402-550
200-μl Pipette Tips	Fisher	21-402-561
1000-μl Pipette Tips	Fisher	21-402-581
DMEM	Lonza	12-604Q
FBS	Sigma	F2442-500mL
Penicillin/Streptomycin	Lonza	17-602E
2X EMEM	Quality Biological	115-073-101
Pipettor	Drummond	4-000-101
1000-μl Pipette	Rainin	L-1000XLS+
200-μl Pipette	Rainin	L-200XLS+
12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor	Rainin	L12-200XLS+
8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor	Rainin	LA8-1200XLS
Attest	Express Medical Supplies	MMM12192
Autoclave	Getinge	GEB 2404 AMB-2
Autoclave Bag	Fisher	01-828E
2000-ml Beaker	Fisher	02-591-10H
Autoclave Tray	Fisher	13-359-20B
Pipette Tray	Fisher	13-361-5
37°C Incubator	Fisher	WU-39321-00
Biohazard Can	Rubbermaid Commercial	FG614500 RED
Autoclave Tape	Fisher	15-903
Autoclave Rod	Made by IRF Facility	N/A
Light Box	Fisher	S11552
Heat Sealer	Fisher	NC9793612
Heat Seal Pouches	Fisher	01-812-25H
Biohazard Bag	Fisher	01-828E