El seguimiento de las células en el pez cebra transgénico GFP-Uso del sistema de fotoconvertible PSmOrange

Resumen

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Resumen

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state¹ and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish^2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

Introducción

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days³. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.

Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede⁴, KiGR⁵, mEos2⁶, PS-CFP2 or Dendra2⁷ and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry⁸, PAGFP⁹ or PATagRFP¹⁰). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice².

To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

Protocolo

1. H2B-PSmOrange mRNA Transcripción in vitro y de purificación de ARNm

1. Linealizar el H2B-PSmOrange contiene pCS2 + plásmido usando la enzima de restricción NotI de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   Nota: Realice los siguientes pasos utilizando protecciones apropiadas, tales como guantes y bata de laboratorio para evitar la contaminación y la degradación del ARNm.
2. Se purifica el ADN linealizado utilizando un kit de purificación de los métodos basados ​​en fenol-cloroformo o PCR de acuerdo con protocolos de los fabricantes.
3. Usar 1 mg de ADN plantilla linealizado para Sp6-mRNA transcripción de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Eliminar el ADN mediante la adición de 1,0 U de RNasa libre de DNasa I durante 10-20 min a 37 ° C.
5. Limpiar el ARNm utilizando una ARN kit de limpieza de acuerdo con el protocolo del fabricante.
6. Para aumentar la pureza y la concentración de ARNm, precipitar el ARNm mediante la adición de acetato de 6 l de sodio (3,0 M, pH 5,2) y 150 l 96% de etanol. Incubar la msolución ixed a -20 ° C durante al menos 30 min y hasta 24 hr.
7. Recoger el mRNA haciendo girar la solución a 18.407 xg durante 45 min a 4 ° C. Desechar el líquido y resuspender el ARNm en 150 l de 70% de etanol. Mezclar y centrifugar la solución para un 15 minutos adicionales a 4 ° C. Desechar el líquido, secar el sedimento durante 5 minutos en hielo y volver a suspender el ARNm en 20 ultrapura l RNasa libre de agua.
8. Evaluar la concentración y la pureza del mRNA por medición fotométrica de una dilución 1: 100 de ARNm (ARNm 1 l en 99 l ultrapura RNasa libre de agua).
9. Para el almacenamiento a corto plazo, mantener la solución de ARNm a -20 ° C. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener el ARNm a -80 ° C.

2.-H2B PSmOrange ARNm microinyección en embriones de pez cebra

1. Configurar el apareamiento pares de la noche antes de la inyección utilizando tg (Foxd3: GFP); tg (FLH: GFP) de pescado transgénico doble (o cualquier otro pez transgénico GFP). Deja a los peces separados por colocar un espaciadorentre ellos para controlar el tiempo de apareamiento.
2. Retire el separador de la mañana de la inyección y dejar que el compañero de pescado durante 20 minutos.
3. Durante el tiempo de apareamiento, diluir el ARNm H2B-PSmOrange a la concentración final de 130 pg / nl (en RNasa libre de agua) y la transferencia de 6 l de solución inyectable en un capilar de microinyección con una punta de microloader. Compruebe el volumen de inyección con un portaobjetos de vidrio calibrado. Ajustar la presión de inyección para inyectar solución 2 mRNA nl (260 pg).
4. Recoger los huevos en una placa de Petri de plástico esterilizada que contiene embriones 1x (E3) medio.
5. Transferir 20 a 30 embriones a un plato de inyección usando una pipeta de plástico pasteur.
6. Inyectar 2 mRNA nl solución en la célula o justo por debajo de la celda que contiene en la yema en el estadio de una célula ^11.
7. Transferencia de embriones inyectados en una placa de Petri que contiene medio 1x E3, eliminan embriones fertilizados se desarrollan con normalidad o no crecen y ellos a 28 ° C.
   Nota: Protección contra la luz of los embriones no se requiere durante todo el experimento.
8. Elevar embriones de pez cebra en medio 1x E3 y añadir PTU 0,2 mM (1-fenil-2 tiourea) después de la gastrulación para inhibir la pigmentación. Cambiar el medio dos veces por día para reducir al mínimo el peligro de contaminaciones bacterianas.

3. Incorporación de embriones

1. Seleccione la GFP (verde) y PSmOrange co-expresión de los embriones (naranja / rojo) usando un microscopio binocular equipado con una lámpara de fluorescencia y filtros de emisión adecuadas. La transferencia de los embriones positivos en una placa de Petri estéril que contiene el medio 1x E3.
2. Embriones Dechorionate bajo un microscopio estereoscópico con fórceps ^12.
3. Transferencia de un embrión en un tubo de 1,5 ml que contiene 1,0 ml de pre-calentado 1,0% de agarosa de bajo punto de fusión (LMA) preparada en agua ultrapura mediante el uso de una pipeta de punta de corte (P200). Nota: Se calienta la LMA a 80 ° C y enfriar durante 3-5 minutos a temperatura ambiente antes de clavarse el embrión.
4. Transferir el embrión en 150 l MLA en unacámaras cubreobjetos y ajustar la orientación del embrión, por ejemplo, el lado dorsal hacia abajo en el experimento descrito para la invertida láser confocal de barrido microscopio A1R + (o cualquier otro microscopio adecuado), usando una punta de plástico fino. Cuando la MLA se polimeriza, llenar la cámara con agua que contiene el pescado PTU 0,2 mM y 0,02% de acetato de 3-aminobenzoato metanosulfonato (Tricaína) para la anestesia.
5. Antes de obtener imágenes de la muestra, esperar 15 minutos para determinar el efecto de Tricaína. La anestesia evita los movimientos de embriones, que pueden ser monitorizados mediante un microscopio estereoscópico equipado con iluminación de campo claro.
   Nota: Las cámaras se pueden reutilizar dos veces.

4. PSmOrange Fotoconversión

1. Colocar la muestra bajo el microscopio confocal y escanear la muestra para identificar el área a photoconvert usando 488 nm y 561 nm láser para la formación de imágenes GFP y PSmOrange respectivamente.
   Nota: Utilice la invertida microscopio confocal de barrido láser A1R + de la sta invertidage TiEcontrolled por el software de imágenes de microscopio y equipada con 488 nm, 561 nm y 640 nm para los láseres de fotoconversión y de imagen. Sin embargo, la aplicación es, sin duda no se limita a este microscopio siempre que las líneas de láser para la conversión y de formación de imágenes están disponibles.
   1. Ponga el objetivo 20X de aire en su lugar (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
   2. Utilice los siguientes ajustes del microscopio para detectar la proteína PSmOrange antes de fotoconversión: 561 nm láser, 0,74 mW medida en el plano de enfoque por encima del objetivo.
      Nota: Esto corresponde a 40% en este sistema (medición en el plano de enfoque es la única manera de determinar la potencia efectiva). Ajustar la potencia del láser de acuerdo con las necesidades experimentales como la eficacia de las inyecciones de H2B-PSmOrange puede variar.
   3. Añadir un factor de zoom para resaltar el área de interés. ampliaciones más altas reducen el tiempo de adquisición de imágenes y, por tanto, la fototoxicidad.
2. Adquirir un z-pila que cubre la estructuras de interés utilizando 488 nm y 561 nm láseres en modo secuencial (modo de línea 1-> 4). Z fijar el paso entre 1,0 y 2,0 micras. promedio de la línea y la frecuencia de exploración se pueden utilizar para optimizar la calidad de la imagen.
3. Analiza la muestra y seleccionar la región de la herramienta de interés (ROI) para resaltar el área de photoconvert. Fijar el retorno de la inversión como zona de estimulación. Seleccione el módulo de fotos de activación / Blanqueamiento, activar el láser de 488 nm marcando la casilla respectiva y ajustar el láser de 488 nm a 80% (potencia del láser 1 mW medida en el objetivo). Ajuste la velocidad de barrido a 0,5 seg / marco.
4. Abra la utilidad de fotoconversión (ND estimulación) y especificar la configuración de fotoconversión.
   1. Haga clic en el comando "Añadir" para especificar el protocolo de fotoconversión.
   2. Set "Fase" 1 en el menú "Adquisición / Estimulación" a la "adquisición" e indicar el número de imágenes que se adquirió antes de fotoconversión en el menú de "bucles".
   3. Ajuste "Fase" 2 a "St.imulation "e introduzca el número de eventos de estimulación a realizar.
   4. Ajuste "Fase" 3 como se describe para la "Fase" 1. Si lo desea, introduzca una espera "Fase" después de "Fase" 2 se introduce el tiempo de espera antes de la última ronda de adquisición de imágenes.
   5. Una vez establecidos todos los parámetros, aplicar el ajuste de la estimulación y ejecutar la fotoconversión.
      Nota: la potencia del láser, la frecuencia de exploración y el número de iteraciones para cada ronda de fotoconversión puede variar y diferir de embrión a embrión. Un entorno para empezar se muestra en la Tabla 1.
5. Adquirir una pila Z final utilizando 488 nm, 561 nm y 640 nm láseres que aplican los ajustes que el anterior. Ajuste el láser de 640 nm para la visualización del PSmOrange convertido mediante láser de potencia alta (hasta 4,5 mW).

5. Desmontar el embrión a partir de LMA

1. Extraer el embrión que contiene la cámara del microscopio. Retirar con cuidado el embrión de la U de agarosacantar fórceps.
2. Transferir el embrión en un nuevo plástico esterilizada placa de Petri o en una de 6 pocillos de la placa esterilizada que contiene 1x E3 y PTU 0,2 mM. Incubar el embrión a 28 ° C hasta la etapa de desarrollo deseado.

6. Analizar el destino de Photoconverted PSmOrange células que expresan la proteína

1. Vuelva a insertar el embrión como se describe en los puntos 3.3 y 3.4.
2. Colocar la muestra bajo el microscopio confocal y escanear la muestra para identificar células photoconverted (640 nm) en la estructura transgénico GFP de interés (488 nm).
3. Adquirir un z-pila que cubre las estructuras de interés usando 488 nm, 561 nm y 640 nm láseres en modo secuencial (modo de línea 1-> 4). Z fijar el paso entre 1,0 y 2,0 micras. promedio de la línea y la frecuencia de exploración se pueden utilizar para optimizar la calidad de la imagen.
4. Utilice uno de los siguientes métodos para identificar células que co-expresan GFP y la proteína photoconverted.
   1. automática por encargo Fiji ImagenJ ³ Macro
      1. Convolve la pila original usando el plugin "desenfoque gaussiano" (Proceso → → → Filtros desenfoque gaussiano) y restar las pilas lisas de la original utilizando el plug-in "Calculadora de imagen" (→ Proceso → Calculadora de imagen). Utilice este paso para visualizar las estructuras de interés y reducir el tiempo de cálculo para el análisis.
      2. Aplicar umbrales específicos a los canales verde y rojo lejano con el fin de resaltar las células photoconverted (→ Imagen → Ajustar → Umbral). Utilice la herramienta de "Analizar Partículas" para detectar las zonas de umbral con un ajuste adecuado (→ → Analizar Analizar Partículas).
      3. Abrir el plugin "Calculadora de imagen" y mostrar las regiones de interés se superponen en el canal verde y rojo lejano en (→ Proceso → Calculadora de imagen) de color amarillo.
   2. software de imágenes del microscopio para la evaluación de datos 3D
      1. Mostrar la pila de3D utilizando la opción de vista show de volumen (3D → Menú de visualización → Mostrar vista de volumen). Utilice la interfaz gráfica para seleccionar los canales verde, rojo y rojo lejano, ajustar el brillo y el contraste y recortar la pila 3D para resaltar el área photoconverted (Figura 1).
         Nota: métodos similares para analizar los datos están disponibles en la mayor parte del software común para el análisis de imágenes.

Resultados

La Figura 1 ilustra un ejemplo del sistema de PSmOrange fotoconversión. El complejo pineal es una estructura conservada en el diencéfalo dorsal de los vertebrados. Como en muchos otros vertebrados, este complejo formado por el órgano pineal en el centro del diencéfalo y las células parapineal del lado izquierdo. Elegantes, pero que consumen mucho tiempo uncaging experimentos mostraron que las células parapineal se originan en la parte anterior del órgano pineal

Discusión

embriones transgénicos portadores de reporteros fluorescentes han contribuido fundamentalmente para entender el desarrollo embrionario. Sin embargo, todavía existe la necesidad esencial de promotores para facilitar la visualización específica de estructuras particulares. En su ausencia, los investigadores se basan en técnicas tales como la fotoconversión de las proteínas fluorescentes para obtener información sobre el origen y desarrollo de su estructura de interés. Esto a su vez es un requisito previo fundamen...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR Purification Kit	Qiagen	28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	Ambion	AM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kit	Qiagen	74204
Plastic Pasteur	alpha laboratories	LW4000
Original H2B-PSmOrange Plasmid	Addgene	31920	The plasmid described in the paper is available in the Carl lab
FemtoJet Microinjector	Eppendorf	5247 000.013
Forceps (5 Inox)	NeoLab	2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System	Nunc	155382
Nikon A1R+	Nikon GmbH Germany	No Number
Nikon PLAN Apo λ 20X air objective	Nikon GmbH Germany	No Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)	Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging	No Number