Suivi des cellules dans le poisson zèbre transgénique de la GFP-Utilisation du système photoconvertible PSmOrange

Résumé

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Résumé

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state¹ and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish^2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

Introduction

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days³. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.

Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede⁴, KiGR⁵, mEos2⁶, PS-CFP2 or Dendra2⁷ and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry⁸, PAGFP⁹ or PATagRFP¹⁰). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice².

To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

Protocole

1. H2B-PSmOrange ARNm de transcription in vitro et la purification de l'ARNm

1. Linéariser le H2B-PSmOrange contenant pCS2 + plasmidique en utilisant l'enzyme de restriction Notl, selon les instructions du fabricant.
   Remarque: effectuer les étapes suivantes à l'aide de protections appropriées telles que des gants et une blouse de laboratoire pour éviter la contamination et de la dégradation de l'ARNm.
2. Purifier l'ADN linéarisé en utilisant une PCR méthodes basées sur un kit de purification ou au phénol-chloroforme selon les protocoles du fabricant.
3. En utilisant 1 ug d'ADN matrice linéarisé pour Sp6-transcription de l'ARNm selon les instructions du fabricant.
4. Éliminer l'ADN en ajoutant 1,0 U RNase DNase I pendant 10-20 min à 37 ° C.
5. Nettoyer l'ARNm en utilisant une ARN nettoyer Kit selon le protocole du fabricant.
6. Pour augmenter la pureté et la concentration de l'ARNm, l'ARNm précipiter par addition de 6 ul d'acétate de sodium (3,0 M, pH 5,2) et 150 ul de 96% d'éthanol. Incuber le mixe solution à -20 ° C pendant au moins 30 minutes et jusqu'à 24 heures.
7. Recueillir l'ARNm en faisant tourner la solution à 18,407 g pendant 45 min à 4 ° C. Jeter le liquide et le remettre en suspension dans 150 pi d'ARNm 70% d'éthanol. Mélanger et centrifuger la solution pendant 15 min à 4 ° C. Jeter le liquide, sécher le culot pendant 5 minutes sur de la glace et remettre l'ARNm dans 20 ultrapure pi RNase eau libre.
8. Évaluer la concentration et la pureté de l'ARNm par la mesure photométrique d'un mélange 1: ARNm de dilution 100 (1 pi d'ARNm dans l'eau exempte de RNase ultrapure 99 pi).
9. Pour le stockage à court terme, maintenir la solution d'ARNm à -20 ° C. Pour le stockage à long terme, maintenir l'ARNm à -80 ° C.

2. H2B-PSmOrange ARNm microinjection dans des embryons de poissons zèbres

1. Mettre en place l'accouplement paires la nuit avant l'injection en utilisant tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) deux de poissons transgéniques (ou tout autre GFP poisson transgénique). Laissez le poisson séparés en plaçant une entretoiseentre eux pour contrôler le temps de l'accouplement.
2. Retirer l'entretoise dans la matinée de l'injection et de laisser le compagnon de poisson pendant 20 min.
3. Pendant le temps de l'accouplement, diluer le H2B-PSmOrange ARNm à la concentration finale de 130 pg / nl (en RNase eau libre) et le transfert 6 solution d'injection de pi dans un capillaire de micro-injection à l'aide d'une pointe de microloader. Vérifiez le volume d'injection avec une lame de verre calibré. Régler la pression d'injection pour injecter 2 Solution de ARNm nl (260 p).
4. Ramasser les oeufs dans une boîte de Petri en plastique stérilisée contenant embryon 1x (E3) moyen.
5. Transférer 20 à 30 embryons dans un plat d'injection à l'aide d'une pipette en plastique de pasteur.
6. Injecter 2 nl ARNm contenant une solution dans la cellule ou juste en dessous de la cellule dans le jaune d'oeuf à l'étape ¹¹ une cellule.
7. Transfert d'embryons injectés dans une boîte de Pétri contenant du milieu 1x E3, supprimer les embryons se développent normalement non fécondés ou non et se développent entre eux à 28 ° C.
   Remarque: Protection contre la lumière of les embryons ne sont pas requis pendant toute l'expérience.
8. Soulever les embryons de poisson zèbre dans un milieu de 1x E3 et ajouter 0,2 mM PTU (1-phényl-2 thio) après la gastrulation pour inhiber la pigmentation. Changer le milieu deux fois par jour afin de minimiser le risque de contaminations bactériennes.

3. embryon Embedding

1. Sélectionnez la GFP (vert) et PSmOrange embryons (orange / rouge) co-exprimant l'aide d'un microscope binoculaire équipé d'une lampe à fluorescence et les filtres d'émission appropriés. Transférer les embryons positifs dans une boîte de Pétri stérile contenant le milieu 1x E3.
2. Embryons Dechorionate sous un microscope stéréoscopique en utilisant une pince ^12.
3. Transfert d'un embryon dans un tube de 1,5 ml contenant 1,0 ml de pré-chauffé 1,0% agarose bas point de fusion (LMA) préparé dans de l'eau ultra-pure à l'aide d'une pipette coupe-pointe (P200). Remarque: Chauffer le LMA à 80 ° C et refroidir pendant 3-5 min à température ambiante avant de l'intégrer l'embryon.
4. Transférer l'embryon dans 150 ul LMA dans unchambré lamelle et d'ajuster l'orientation de l'embryon, par exemple face dorsale vers le bas dans l'expérience décrite pour le laser microscope confocal à balayage A1R inversé + (ou tout autre microscope approprié), en utilisant un bout de plastique bien. Lorsque le LMA est polymérisé, remplir la chambre avec de l'eau de poisson contenant mM PTU 0,2 et 0,02% éthyl méthanesulfonate 3-aminobenzoate (Tricaine) pour l'anesthésie.
5. Avant l'imagerie de l'échantillon, attendre 15 min pour déterminer l'effet de Tricaine. L'anesthésie empêche les mouvements de l'embryon, qui peuvent être contrôlés au moyen d'un stéréomicroscope équipé d'un éclairage en fond clair.
   Remarque: Les chambres peuvent être réutilisés à deux reprises.

4. PSmOrange Photoconversion

1. Placer l'échantillon sous le microscope confocal et analyser les échantillons pour identifier la zone à l'aide de photoconvert 488 nm et 561 nm lasers pour imager la GFP et PSmOrange respectivement.
   Remarque: Utilisez le confocal à balayage laser microscope A1R + inversé sur la sta inversége TiEcontrolled par le logiciel d'imagerie de microscope et équipées 488 nm, 561 nm et 640 nm pour les lasers photoconversion et d'imagerie. Toutefois, l'application est certes pas limitée à cette microscope aussi longtemps que les rayons laser et l'imagerie de conversion sont disponibles.
   1. Mettez l'objectif de l'air 20X en place (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
   2. Utiliser les paramètres suivants au microscope pour détecter la protéine PSmOrange avant photoconversion: 561 nm laser, 0,74 mW mesurée au plan focal de l'objectif ci-dessus.
      Remarque: ce qui correspond à 40% par rapport à ce système (mesure dans le plan de mise au point est le seul moyen pour déterminer la puissance effective). Régler la puissance du laser en fonction des besoins expérimentaux que l'efficacité des injections H2B-PSmOrange peut varier.
   3. Ajouter facteurs de zoom pour mettre en évidence la zone d'intérêt. grossissements plus élevés réduisent le temps d'acquisition d'image et donc la phototoxicité.
2. Acquérir un z-stack couvrant la structures d'intérêt en utilisant 488 nm et 561 nm lasers à mode séquentiel (mode ligne 1-> 4). Fixer le z-étape entre 1,0 et 2,0 um. moyenne de la ligne et de la fréquence de balayage peuvent être utilisés pour optimiser la qualité d'image.
3. Balayez l'échantillon et sélectionnez la région d'intérêt (ROI) outil pour mettre en évidence la zone à photoconvert. Fixer le retour sur investissement que la zone de stimulation. Sélectionnez le module photo Activation / Blanchiment, activer le laser de 488 nm en cochant la case correspondante et réglez le laser de 488 nm à 80% (de la puissance du laser 1 mW mesurée à l'objectif). Réglez la vitesse de balayage à 0,5 sec / cadre.
4. Ouvrez l'utilitaire de photoconversion (ND Stimulation) et spécifier les paramètres de photoconversion.
   1. Cliquez sur la commande "Ajouter" pour indiquer le protocole de photoconversion.
   2. Set "Phase" 1 dans le menu "Acquisition / Stimulation" à "Acquisition" et indiquer le nombre d'images à être acquis avant photoconversion dans le menu "Loops".
   3. Réglez "Phase" 2 à "Stimulation "et entrez le nombre d'événements de stimulation à effectuer.
   4. Ajuster "Phase" 3 comme décrit pour "Phase" 1. En option, insérer une attente "Phase" après "Phase" 2 en entrant le temps à attendre avant la dernière ronde de l'acquisition d'images.
   5. Une fois que tous les paramètres sont réglés, appliquer le réglage de la stimulation et exécuter le photoconversion.
      Remarque: Puissance du laser, la fréquence de balayage et le nombre d'itérations pour chaque tour de photoconversion peut varier et diffère de l'embryon à l'embryon. Un cadre pour commencer est indiqué dans le tableau 1.
5. Acquérir un z-stack final en utilisant 488 nm, 561 nm et 640 nm lasers appliquant les paramètres comme ci-dessus. Régler le laser 640 nm pour visualiser l'PSmOrange convertie, en utilisant la puissance de laser élevée (jusqu'à 4,5 mW).

5. Démonter embryon de LMA

1. Retirer l'embryon chambre contenant du microscope. Retirez délicatement l'embryon de l'u agarosechanter forceps.
2. Transférer l'embryon dans un nouveau plastique stérilisé boîte de Pétri ou dans une 6 puits plaque stérilisée contenant 1x E3 et mM PTU 0,2. Incuber l'embryon à 28 ° C jusqu'à ce que le stade de développement souhaité.

6. Analyse du destin de Photoconverted PSmOrange protéines cellules exprimant

1. Re-intégrer l'embryon comme indiqué aux points 3.3 et 3.4.
2. Placer l'échantillon sous le microscope confocal et analyser l'échantillon pour identifier les cellules photoconverted (640 nm) dans la structure transgénique GFP d'intérêt (488 nm).
3. Acquérir un z-stack couvrant les structures d'intérêt en utilisant 488 nm, 561 nm et 640 nm lasers à mode séquentiel (mode ligne 1-> 4). Fixer le z-étape entre 1,0 et 2,0 um. moyenne de la ligne et de la fréquence de balayage peuvent être utilisés pour optimiser la qualité d'image.
4. Utilisez l'une des méthodes suivantes pour identifier les cellules qui GFP co-express et la protéine photoconverted.
   1. Du sur mesure automatique Fidji imageJ ³ Macro
      1. Convolve la pile d'origine en utilisant le plugin "GaussianBlur" (→ Processus → Filtres → GaussianBlur) et soustraire les piles lisses de l'original à l'aide du plug-in "de la calculatrice de l'image" (→ Processus → Calculatrice de l'image). Cette étape permet de visualiser les structures d'intérêt et de réduire le temps de calcul pour l'analyse.
      2. Appliquer des seuils spécifiques aux canaux vert et rouge lointain afin de mettre en évidence les cellules photoconverted (→ Photo → Ajuster → Seuil). Utilisez l'outil "analyser des particules" pour détecter les zones de seuil avec un réglage approprié (→ Analyser → analyser des particules).
      3. Ouvrez le "calculateur d'image" plugin et afficher les ROI de chevauchement dans le canal vert et rouge lointain en jaune (→ Processus → Calculatrice de l'image).
   2. logiciel d'imagerie Microscope pour l'évaluation des données 3D
      1. Afficher la pile3D en utilisant la vue option Afficher le volume (→ 3D Visualization Menu → Afficher Volume View). Utiliser l'interface graphique pour sélectionner les canaux vert, rouge et rouge lointain, régler la luminosité et le contraste et recadrer la pile 3D pour mettre en évidence la zone photoconverted (Figure 1).
         Remarque: Des méthodes similaires pour analyser les données sont disponibles dans la plupart des logiciel commun pour l'analyse d'images.

Résultats

La figure 1 illustre un exemple de système PSmOrange de photoconversion. Le complexe pinéale est une structure conservée dans la dorsale diencéphale vertébrés. Comme dans beaucoup d'autres vertébrés, le complexe se compose de la glande pinéale dans le centre du diencéphale et les cellules parapineal du côté gauche. Expériences uncaging élégantes mais chronophages montré que les cellules parapineal originaires de la partie antérieure de la glande pin?...

Discussion

embryons transgéniques portant reporters fluorescents ont contribué fondamentalement à comprendre le développement embryonnaire. Cependant, il y a encore le besoin essentiel pour les promoteurs pour faciliter la visualisation précise des structures particulières. En leur absence, les chercheurs comptent sur des techniques telles que la photoconversion de protéines fluorescentes de se renseigner sur l'origine et le développement de leur structure d'intérêt. Cela est une condition préalable essentielle ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR Purification Kit	Qiagen	28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	Ambion	AM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kit	Qiagen	74204
Plastic Pasteur	alpha laboratories	LW4000
Original H2B-PSmOrange Plasmid	Addgene	31920	The plasmid described in the paper is available in the Carl lab
FemtoJet Microinjector	Eppendorf	5247 000.013
Forceps (5 Inox)	NeoLab	2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System	Nunc	155382
Nikon A1R+	Nikon GmbH Germany	No Number
Nikon PLAN Apo λ 20X air objective	Nikon GmbH Germany	No Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)	Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging	No Number