Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System

Zusammenfassung

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Zusammenfassung

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state¹ and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish^2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

Einleitung

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days³. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.

Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede⁴, KiGR⁵, mEos2⁶, PS-CFP2 or Dendra2⁷ and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry⁸, PAGFP⁹ or PATagRFP¹⁰). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice².

To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

Protokoll

1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro-Transkription und mRNA Purification

1. Linearisieren die H2B-PSmOrange enthält pCS2 + Plasmid, das die NotI-Restriktionsenzym unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers.
   Hinweis: Führen Sie die nächsten Schritte mit geeigneten Schutzmaßnahmen wie Handschuhe und Kittel mRNA Verschmutzung und Verschlechterung zu verhindern.
2. Reinige den linearisierten DNA einer PCR Purification Kit oder Phenol-Chloroform-basierte Verfahren nach Herstellerprotokollen.
3. Verwenden 1 ug linearisierte Matrizen-DNA für Sp6-mRNA-Transkription nach Herstellerangaben.
4. Entfernen DNA durch Zugabe von 1,0 U RNase freie DNaseI für 10-20 min bei 37 ° C.
5. Clean up the mRNA eine RNA bereinigen Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
6. Zur Erhöhung der mRNA Reinheit und Konzentration, fallen die mRNA durch Zugabe von 6 ul Natriumacetat (3,0 M, pH 5,2) und 150 & mgr; l 96% Ethanol. Inkubieren Sie die mixed Lösung bei -20 ° C für mindestens 30 min und bis zu 24 Stunden.
7. Sammeln Sie die mRNA, indem die Lösung bei 18,407 xg Zentrifugieren für 45 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren die mRNA in 150 ul 70% Ethanol. Mischen und Zentrifugieren der Lösung für weitere 15 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie die Flüssigkeit, trocknet das Pellet für 5 Minuten auf Eis und resuspendieren die mRNA in 20 ul ultrareinem RNase freies Wasser.
8. Bewerten Sie die Konzentration und Reinheit der mRNA durch photometrische Messung einer 1: 100-mRNA-Verdünnung (1 ul mRNA in 99 & mgr; l ultrareinem RNase freies Wasser).
9. Für kurzzeitige Lagerung, halten Sie die mRNA-Lösung bei -20 ° C. Für die langfristige Lagerung, halten Sie die mRNA bei -80 ° C.

2. H2B-PSmOrange mRNA Mikroinjektion in Zebrafischembryonen

1. Richten Sie Paare in der Nacht vor der Injektion Paarung mit tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) doppelt transgenen Fisch (oder jede andere GFP transgenen Fische). Lassen Sie den Fisch getrennt durch einen Abstandshalter platzierenzwischen ihnen die Zeit der Paarung zu steuern.
2. Entfernen Sie die Abstandshalter am Morgen der Einspritzung und lassen die Fische Kumpel für 20 min.
3. Während der Zeit der Paarung, verdünnte die H2B-PSmOrange mRNA zur endgültigen Konzentration von 130 pg / nl (in RNase freies Wasser) und Transfer 6 ul Injektionslösung in einem Mikroinjektion Kapillare eine Micro Trick. Schauen Sie sich die Einspritzmenge mit einem kalibrierten Glasträger. Stellen Sie den Einspritzdruck zu injizieren 2 nl mRNA-Lösung (260 pg).
4. Sammeln Sie die Eier in eine sterilisierte Kunststoffpetrischale mit 1x Embryo (E3) Medium.
5. Übertragen Sie 20 bis 30 Embryonen zu einem Einspritzschale mit einem Kunststoffpasteurpipette.
6. Injizieren 2 nl mRNA Lösung in der Zelle enthalten oder direkt unter der Zelle in das Eigelb an der Ein-Zell-Stadium ^11.
7. Transfer injizierten Embryonen in eine Petrischale 1x E3-Medium, das Entfernen unbefruchtete oder nicht normal Embryonen und wachsen sie bei 28 ° C zu entwickeln.
   Hinweis: Lichtschutz of den Embryonen nicht während des ganzen Experiments erforderlich.
8. Heben Zebrafischembryonen in 1x E3 Medium und fügen 0,2 mM PTU (1-Phenyl-2 Thioharnstoff) nach gastrulation Pigmentierung zu hemmen. Ändern Sie das Medium zweimal pro Tag, um die Gefahr von bakteriellen Kontaminationen zu minimieren.

3. Embryo Einbetten

1. Wählen Sie das GFP (grün) und PSmOrange (orange / rot) co-exprimierenden Embryonen ein Binokular mit einem Fluoreszenz-Lampe und angemessene Emissionsfiltern. Übertragen Sie die positiven Embryonen in eine sterile Petrischale mit 1x E3 Medium.
2. Dechorionate Embryonen unter einem Stereomikroskop Pinzette ^12.
3. Transfer eines Embryos in ein 1,5 ml Röhrchen mit 1,0 ml vorgewärmten 1,0% niedrig schmelzender Agarose (LMA) in ultrareinem Wasser hergestellt, indem ein Cut-Spitze Pipette (P200) verwendet. Hinweis: Wärmen Sie die LMA bis 80 ° C und Abkühlung für 3-5 Minuten bei Raumtemperatur, bevor der Embryo Einbettung.
4. Übertragen Sie die Embryos in 150 ul LMA in einemKammerdeckgläser und passen Sie die Ausrichtung des Embryos, zum Beispiel Rückenseite nach unten in das Experiment für den invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop A1R + (oder einem anderen geeigneten Mikroskop) beschrieben, eine feine Spitze aus Kunststoff verwenden. Wenn die LMA polymerisiert wird, füllen Sie die Kammer mit Fisch Wasser, das 0,2 mM PTU und 0,02% Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat (Tricaine) für die Anästhesie.
5. Bevor die Probe Bildgebung, warten Sie 15 Minuten, um die Wirkung von Tricaine zu ermitteln. Die Anästhesie verhindert Embryo Bewegungen, die ein Stereomikroskop mit Hellfeldbeleuchtung überwacht werden kann.
   Anmerkung: Die Kammern zweimal wiederverwendet werden kann.

4. PSmOrange Photokonversion

1. Legen Sie die Probe unter dem konfokalen Mikroskop und scannen die Probe um den Bereich zu identifizieren, um photoconvert mit 488 nm und 561 nm Laser zur Abbildung GFP und PSmOrange sind.
   Hinweis: Mit der umgekehrten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop A1R + auf dem umgekehrten stage TiEcontrolled durch das Mikroskop Imaging-Software und ausgestattet mit 488 nm, 561 nm und 640 nm Laser für die Photokonversion und Bildgebung. Jedoch ist die Anwendung sicher nicht auf diese beschränkt Mikroskop solange die Laserlinien zur Umwandlung und Bild verfügbar sind.
   1. Setzen Sie den 20X Luft Objektiv ein (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
   2. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen des Mikroskops die PSmOrange Protein vor Photokonversion zu erkennen: 561-nm-Laser, 0,74 mW bei der Fokusebene über dem Ziel gemessen.
      Hinweis: Diese auf diesem System bis zu 40% entspricht (in der Fokusebene messen, ist der einzige Weg, um die Wirkleistung zu bestimmen). Stellen Sie die Laserleistung nach experimentellen Anforderungen wie die Effizienz der H2B-PSmOrange Injektionen variieren.
   3. In Zoomfaktoren den Bereich von Interesse zu markieren. Höhere Vergrößerungen reduzieren Bildaufnahmezeit und damit Phototoxizität.
2. Erwerben Sie eine Z-Stack für den Aufbaus von Interesse unter Verwendung von 488 nm und 561 nm Laser im sequenziellen Modus (Zeilenmodus 1-> 4). Befestigen Sie die z-Schritt zwischen 1,0 und 2,0 um. Rauh und Scan-Frequenz kann verwendet werden, um Bildqualität zu optimieren.
3. Scannen Sie die Probe und wählen Sie die Region of Interest (ROI) Werkzeug, um den Bereich zu markieren, um photoconvert. Befestigen Sie den ROI als Stimulationsbereich. Wählen Sie das Foto Aktivierung / Bleaching-Modul, aktivieren Sie die 488-nm-Laser durch das entsprechende Kontrollkästchen aktivieren und stellen Sie die 488-nm-Laser bis 80% (1 mW Laserleistung auf dem Ziel gemessen). Stellen Sie die Scan-Geschwindigkeit bis 0,5 sec / Frame.
4. Öffnen Sie die Photo Dienstprogramm (ND Stimulation) und die Photo Einstellungen angeben.
   1. Klicken Sie auf den Befehl "Hinzufügen" die Photo Protokoll anzugeben.
   2. Stellen Sie "Phase" ein in der "Erwerb / Stimulation" -Menü auf "Übernahme" und geben Sie die Anzahl der Bilder vor Photo erworben werden in der "Loops" -Menü.
   3. Stellen Sie "Phase" 2 auf "St.imulation "und die Anzahl der Stimulationsereignisse geben durchgeführt werden.
   4. Stellen Sie "Phase" 3 wie für "Phase" 1. Optional beschrieben, legen Sie eine Warte "Phase" nach der "Phase" 2 durch die Zeit vor der letzten Runde der Bildaufnahme zu warten eingeben.
   5. Sobald alle Parameter eingestellt werden, gelten die Stimulation Einstellung und die Photo laufen.
      Hinweis: Die Laserleistung, die Frequenz des Scannens und der Anzahl der Wiederholungen für jede Runde von Photo variieren und unterscheiden sich von Embryos Embryos. Eine Einstellung zu beginnen, ist in Tabelle 1 gezeigt.
5. Erwerben Sie eine endgültige Z-Stapel mit 488 nm, 561 nm und 640 nm Laser, wie oben die Einstellungen zu übernehmen. Stellen Sie die 640-nm-Laser die konvertierte PSmOrange mit hoher Laserleistung (bis zu 4,5 mW) zu visualisieren.

5. Demontieren Embryo aus LMA

1. Entfernen Sie den Embryo aus dem Mikroskop enthaltenden Kammer. Entfernen Sie vorsichtig den Embryo aus der Agarose usingen Zange.
2. Bringen Sie den Embryo in eine neue sterilisierte Kunststoffpetrischale oder in eine sterilisierte 6-Well-Platte mit 1x E3 und 0,2 mM PTU. Inkubieren des Embryos bei 28 ° C, bis die gewünschte Stufe der Entwicklung.

6. Die Analyse der Fate of photokonvertiertem PSmOrange Protein exprimierenden Zellen

1. Re-einbetten den Embryo als 3.3 und 3.4 unter den Punkten beschrieben.
2. Legen Sie die Probe unter dem konfokalen Mikroskop und scannen die Probe zu photokonvertiertem Zellen (640 nm) in der GFP transgenen Struktur von Interesse (488 nm) zu identifizieren.
3. Erwerben Sie eine Z-Stapel Abdecken der Strukturen von Interesse unter Verwendung von 488 nm, 561 nm und 640 nm Laser im sequenziellen Modus (Zeilenmodus 1-> 4). Befestigen Sie die z-Schritt zwischen 1,0 und 2,0 um. Rauh und Scan-Frequenz kann verwendet werden, um Bildqualität zu optimieren.
4. Verwenden Sie eine der folgenden Methoden, um Zellen zu identifizieren, die Co-express GFP und die photokonvertiertem Protein.
   1. Maß automatische Fidschi BildJ Makro ³
      1. Convolve der Originalstapel die "Weichzeichnen" Plugin (→ Bearbeiten → Filter → Weichzeichnen) und subtrahieren die glatten Stapel von der ursprünglichen Verwendung der "Bild Rechner" Plugin (→ Prozess → Bildrechner) verwenden. Verwenden Sie diesen Schritt, um die Strukturen von Interesse zu visualisieren und zur Verringerung der Rechenzeit für die Analyse.
      2. Übernehmen bestimmte Schwellenwerte zu den grünen und dunkelroten Kanäle, um die photokonvertiertem Zellen zu markieren (→ Bild → → Stellen Threshold). Verwenden Sie den "Analyze Particles" Werkzeug, um die Schwelle Bereiche mit einem passenden Rahmen zu erkennen (→ Analysieren → Analysieren Partikel).
      3. Öffnen Sie die "Bild Rechner" Plugin und zeigen die überlappenden ROIs im grünen und dunkelroten Kanal in gelb (→ Prozess → Bildrechner).
   2. Microscope Imaging-Software für 3D-Datenauswertung
      1. Zeigen Sie den Stapel in3D die Show Volumen Ansichtsoption (→ 3D-Visualisierung Menü → Show Volume anzeigen) verwenden. Verwenden Sie die grafische Schnittstelle, um die grünen, roten und dunkelrotes Kanäle, die Helligkeit, den Kontrast und die Ernte der 3D-Stapel zu wählen Sie die photokonvertiertem Bereich (Abbildung 1) zu markieren.
         Hinweis: Ähnliche Verfahren werden die Daten sind in den meisten der gemeinsamen Software zur Bildanalyse zu analysieren.

Ergebnisse

1 veranschaulicht ein Beispiel des PSmOrange Photosystem. Die Zirbeldrüse Komplex ist eine konservierte Struktur im Wirbeltier dorsalen Zwischenhirn. Wie in vielen anderen Wirbeltieren besteht dieser Komplex der Pinealorgan in der Mitte des Zwischenhirns und den linksseitigen parapineal Zellen. Elegant, aber zeitaufwendig Uncaging Experimente zeigten, dass parapineal Zellen ¹³ in den vorderen Teil des Pinealorgan stammen. In tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) tra...

Diskussion

Transgene Embryonen fluoreszierenden Reporter trägt grundlegend zu verstehen, die embryonale Entwicklung geholfen. Es besteht jedoch immer noch die wesentliche Notwendigkeit für Promotoren die spezifische Visualisierung von besonderen Strukturen zu erleichtern. In ihrer Abwesenheit, verlassen sich die Forscher auf Techniken wie die Photokonversion von fluoreszierenden Proteinen über den Ursprung und die Entwicklung ihrer Struktur von Interesse zu erfahren. Dies wiederum ist eine wesentliche Voraussetzung, die molekul...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR Purification Kit	Qiagen	28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	Ambion	AM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kit	Qiagen	74204
Plastic Pasteur	alpha laboratories	LW4000
Original H2B-PSmOrange Plasmid	Addgene	31920	The plasmid described in the paper is available in the Carl lab
FemtoJet Microinjector	Eppendorf	5247 000.013
Forceps (5 Inox)	NeoLab	2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System	Nunc	155382
Nikon A1R+	Nikon GmbH Germany	No Number
Nikon PLAN Apo λ 20X air objective	Nikon GmbH Germany	No Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)	Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging	No Number