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Resumo

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Resumo

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

Introdução

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days3. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.

Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 or Dendra27 and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry8, PAGFP9 or PATagRFP10). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice2.

To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

Protocolo

1. H2B-PSmOrange mRNA transcrição in vitro e mRNA Purificação

  1. Linearizar o H2B-PSmOrange contendo pCS2 + plasmídeo utilizando a enzima de restrição NotI de acordo com as instruções do fabricante.
    Nota: Execute as seguintes etapas usando proteções adequadas, tais como luvas e bata de laboratório para evitar a contaminação e degradação do mRNA.
  2. Purifica-se o ADN linearizado utilizando um kit de purificação ou de fenol-clorofórmio PCR métodos baseados acordo com os protocolos dos fabricantes.
  3. Use 1 ug de ADN molde linearizados para transcrição sp6-ARNm de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Remover o DNA pela adição de 1,0 U de RNase livre ADNasel durante 10-20 min a 37 ° C.
  5. Limpar o mRNA usando um RNA limpar kit de acordo com o protocolo do fabricante.
  6. Para aumentar a pureza e concentração de ARNm, o ARNm de precipitar por adição de 6 ul de acetato de sódio (3,0 M, pH 5,2) e 150 ul de etanol a 96%. Incubar a mixed solução a -20 ° C durante pelo menos 30 minutos e até 24 h.
  7. Recolhe-se o ARNm por fiação da solução a 18,407 xg durante 45 min a 4 ° C. Descartar o líquido e ressuspender o ARNm em 150 ul de etanol a 70%. Misturar e centrifugar a solução durante mais 15 min a 4 ° C. Descartar o líquido, secar o sedimento durante 5 minutos em gelo e ressuspender o ARNm em 20 ul de ARNase ultrapura água livre.
  8. Avaliar a concentração e pureza do ARNm por medição fotométrica de uma diluição 1: 100 de ARNm (ARNm 1 ul em 99 ul ultrapura RNase isenta de água).
  9. Para armazenagem a curto prazo, manter a solução de ARNm a -20 ° C. Para armazenamento a longo prazo, manter o ARNm a -80 ° C.

2. H2B-PSmOrange mRNA microinjeção em embriões Zebrafish

  1. Configurar o acasalamento pares na noite antes da injeção usando tg (FOXD3: GFP); tg (FLH: GFP) peixes transgénicos casal (ou qualquer outro peixe transgénico GFP). Deixar o peixe separada por colocação de um espaçadorentre eles para controlar o tempo de acasalamento.
  2. Remova o espaçador na manhã de injecção e deixar o companheiro de peixe para 20 min.
  3. Durante o acasalamento tempo, dilui-se o ARNm H2B-PSmOrange até à concentração final de 130 pg / NL (em RNase isenta de água) e a transferência de 6 ul de solução de injecção para um capilar de microinjecção utilizando uma ponta de microloader. Verifique o volume de injeção com uma lâmina de vidro calibrado. Ajuste a pressão de injeção para injetar 2 solução mRNA nl (260 pg).
  4. Recolher os ovos em uma placa de petri de plástico esterilizado contendo Embryo 1x médio (E3).
  5. Transferir 20 a 30 embriões de um prato de injecção, utilizando uma pipeta de pasteur de plástico.
  6. Injectar 2 nl de ARNm contendo uma solução para a célula ou apenas abaixo da célula na gema no estádio de uma célula-11.
  7. Transferência de embriões injetado em uma-placa de petri contendo meio 1x E3, retire os embriões que se desenvolveram normalmente não fertilizados ou não e cultivá-las a 28 ° C.
    Nota: A proteção Luz of os embriões não é necessário durante todo o experimento.
  8. Elevar embriões de peixe-zebra em meio 1x E3 e adicionar PTU 0,2 mM (1-fenil-2 tioureia) após a gastrulação para inibir a pigmentação. Mudar o meio duas vezes por dia para minimizar o perigo de contaminações bacterianas.

3. Embryo Embedding

  1. Seleccione a GFP (verde) e PSmOrange (laranja / vermelho) embriões co-expressando usando um microscópio binocular equipado com uma lâmpada fluorescente e filtros de emissão adequados. Transferir os embriões positivos em uma placa de petri estéril contendo meio 1x E3.
  2. Embriões Dechorionate sob um microscópio estereoscópico com a pinça 12.
  3. Transferência de um embrião em um tubo de 1,5 ml contendo 1,0 ml de pré-aquecido 1,0% de agarose de baixa fusão (LMA) preparadas em água ultrapura, utilizando uma pipeta de corte de ponta (P200). Nota: Aquecer o LMA a 80 ° C e arrefecer durante 3-5 minutos à temperatura ambiente antes de incorporar o embrião.
  4. Transferir o embrião em 150 ul LMA numacompartimentado lamela e ajustar a orientação do embrião, por exemplo, o lado dorsal para baixo na experiência descrita para o laser confocal de varredura microscópio invertido A1R + (ou qualquer outro microscópio adequado), utilizando uma ponta de plástico fino. Quando o LMA é polimerizado, encher a câmara com água de peixe contendo PTU 0,2 mM e 0,02% de acetato de 3-aminobenzoato metanossulfonato (tricaina) para a anestesia.
  5. Antes de imagem da amostra, esperar 15 min para determinar o efeito de tricaina. A anestesia impede movimentos embrião, que pode ser monitorado usando um estereomicroscópio equipado com iluminação de campo claro.
    Nota: As câmaras podem ser reutilizado duas vezes.

4. PSmOrange fotoconversão

  1. Colocar a amostra sob o microscópio confocal e digitalizar a amostra para identificar a área para photoconvert usando 488 nm e 561 nm lasers para geração de imagens GFP e PSmOrange respectivamente.
    Nota: Use o confocal de varredura a laser do microscópio invertido A1R + no sta invertidoge TiEcontrolled pelo software de imagem de microscópio e equipado com 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers para fotoconversão e imagem. No entanto, a aplicação, certamente, não está restringido a esta microscópio, enquanto as linhas de laser para a conversão e de imagem estão disponíveis.
    1. Coloque o objectivo de ar 20X no lugar (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
    2. Use as seguintes configurações microscópio para detectar a proteína PSmOrange antes fotoconversão: 561 nm laser, 0,74 mW medido no plano de foco acima do objetivo.
      Nota: Isto corresponde a 40% neste sistema (de medida no plano do foco é a única forma de determinar a potência efectiva). Ajustar a potência de laser de acordo com as necessidades experimentais como a eficiência de injecções H2B-PSmOrange pode variar.
    3. Adicionar fatores de zoom para destacar a área de interesse. ampliações reduzir o tempo de aquisição de imagem e, portanto, fototoxicidade.
  2. Adquirir uma z-stack que cubra a estruturas de interesse utilizando 488 nm e 561 nm lasers no modo sequencial (modo de linha 1-> 4). Fixar o z-passo entre 1,0 e 2,0 mm. média linha ea frequência de scaneamento pode ser usado para otimizar a qualidade da imagem.
  3. Digitalizar a amostra e selecione a região de interesse ferramenta (ROI) para realçar a área para photoconvert. Fixar o ROI como área de estimulação. Selecione o módulo Foto Activation / Branqueamento, ativar o laser de 488 nm, marcando a respectiva caixa de e definir o laser de 488 nm a 80% (potência do laser 1 mW medida no objetivo). Defina a velocidade de digitalização para 0,5 seg / Frame.
  4. Abra o utilitário fotoconversão (ND Stimulation) e especifique as configurações fotoconversão.
    1. Clique no comando "Adicionar" para especificar o protocolo de fotoconversão.
    2. Ajuste "Fase" 1 no menu "Aquisição / Estimulação" a "Aquisição" e indicar o número de imagens a serem adquiridos antes fotoconversão no menu "Loops".
    3. Ajuste "Fase" 2 para "Stimulation "e digite o número de eventos de estimulação a ser realizada.
    4. Ajuste "Fase" 3 como descrito para "Fase" 1. Opcionalmente, insira uma espera "Phase" depois de "Phase" 2 digitando o tempo de espera antes da última rodada de aquisição de imagem.
    5. Uma vez que todos os parâmetros são definidos, aplicar a definição estimulação e executar o fotoconversão.
      Nota: A potência do laser, a frequência de digitalização e número de iterações para cada rodada de fotoconversão pode variar e ser diferente de embrião para embrião. Uma configuração para começar com é mostrado na Tabela 1.
  5. Adquirir uma z-stack final usando 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers de aplicar as configurações como acima. Definir o laser de 640 nm para visualizar a PSmOrange convertido utilizando alta potência do laser (até 4,5 mW).

5. Desmontar Embrião de LMA

  1. Remover o embrião contendo câmara do microscópio. Remova cuidadosamente o embrião do u agarosecantar fórceps.
  2. Transferência do embrião para um novo plástico esterilizado placa de petri ou em um de 6 poços de placa esterilizada contendo 1x E3 e UTP 0,2 mM. Incubar o embrião a 28 ° C até à fase de desenvolvimento desejado.

6. Analisando o Fate of Photoconverted PSmOrange proteína células que expressam

  1. Re-inserir o embrião como descrito nos pontos 3.3 e 3.4.
  2. Colocar a amostra sob o microscópio confocal e digitalizar a amostra para identificar as células photoconverted (640 nm) na estrutura transgênica GFP de interesse (488 nm).
  3. Adquirir uma z-stack cobrindo as estruturas de interesse utilizando 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers no modo sequencial (modo de linha 1-> 4). Fixar o z-passo entre 1,0 e 2,0 mm. média linha ea frequência de scaneamento pode ser usado para otimizar a qualidade da imagem.
  4. Use um dos seguintes métodos para identificar células, que GFP co-express e a proteína photoconverted.
    1. personalizado feito Imagem automática FijiJ 3 Macro
      1. Convolve a pilha original usando o plugin "GaussianBlur" (→ Processo → Filtros → GaussianBlur) e subtrair as pilhas lisas do original usando o plugin "Calculadora de Imagens" (→ Processo → Calculadora de Imagem). Usar este passo de visualizar as estruturas de interesse e reduzir o tempo de processamento para a análise.
      2. Aplicar limites específicos para os canais verde e vermelho-distante, a fim de destacar as células photoconverted (→ Imagem → Ajuste → Threshold). Use o "Analisar Particles" ferramenta para detectar as áreas de limiar com um ambiente adequado (→ Analisar → Analisar Partículas).
      3. Abra o plugin "Calculadora Imagem" e exibir os ROIs sobrepostos no canal verde e vermelho-distante em amarelo (→ Processo → Calculadora de Imagem).
    2. software de imagem de microscópio para avaliação de dados 3D
      1. Mostrar a pilha no3D utilizando a opção view show de volume (→ 3D Menu de visualização → Mostrar Volume View). Use a interface gráfica para selecionar os canais verde, vermelho e far-vermelhos, ajustar o brilho eo contraste e recortar a pilha 3D para destacar a área photoconverted (Figura 1).
        Nota: métodos similares para analisar os dados estão disponíveis na maior parte do software comum para análise de imagem.

Resultados

A Figura 1 ilustra um exemplo do sistema PSmOrange fotoconversão. O complexo pineal é uma estrutura conservada no diencéfalo dorsal vertebrado. Como em muitos outros vertebrados, esse complexo é constituído por o órgão pineal no centro do diencéfalo e as células parapineal do lado esquerdo. Experimentos uncaging elegantes, mas demoradas mostraram que as células parapineal originam na parte anterior do órgão pineal 13. Em tg (FOXD3: GFP); tg (FLH: G...

Discussão

embriões transgénicos portadores de repórteres fluorescentes têm ajudado fundamentalmente para entender o desenvolvimento embrionário. No entanto, existe ainda a necessidade essencial de promotores de facilitar a visualização específica de estruturas particulares. Na sua ausência, os pesquisadores dependem de técnicas como a fotoconversão de proteínas fluorescentes para saber mais sobre a origem eo desenvolvimento de sua estrutura de interesse. Esta por sua vez é um pré-requisito fundamental para identific...

Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

We thank O. Subach for providing the original H2B-PSmOrange plasmid and our fish facility team for fish care. We are grateful to the Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg for access to microscopy equipment and analysis software. We acknowledge the support of the Core Facility Live Cell Imaging Mannheim at the CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). This work was supported by the Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), University of Heidelberg to C.A.B. and the Medical Faculty Mannheim of the University Heidelberg and the DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 and 298/6-1) to M.C.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
PCR Purification KitQiagen28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kitAmbionAM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kitQiagen74204
Plastic Pasteuralpha laboratoriesLW4000
Original H2B-PSmOrange PlasmidAddgene31920The plasmid described in the paper is available in the Carl lab
FemtoJet MicroinjectorEppendorf5247 000.013
Forceps (5 Inox)NeoLab2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System Nunc155382
Nikon A1R+Nikon GmbH GermanyNo Number
Nikon PLAN Apo λ 20X air objective Nikon GmbH GermanyNo Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)Nikon GmbH Germany/Laboratory ImagingNo Number

Referências

  1. Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
  2. Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
  3. Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
  4. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
  5. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
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  8. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
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  10. Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
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  14. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
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