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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Abstract

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

Introduzione

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days3. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.

Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 or Dendra27 and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry8, PAGFP9 or PATagRFP10). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice2.

To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

Protocollo

1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro trascrizione e mRNA Purification

  1. Linearizzare il H2B-PSmOrange contenente pCS2 + plasmide con l'enzima di restrizione NotI secondo le istruzioni del produttore.
    Nota: eseguire i passi successivi utilizzando adeguate protezioni quali guanti e camice da laboratorio per evitare la contaminazione mRNA e il degrado.
  2. Purificare il DNA linearizzato utilizzando un kit di purificazione o di fenolo-cloroformio PCR metodi basati secondo protocolli produttori.
  3. Utilizzare 1 mg di DNA modello linearizzato per Sp6-mRNA trascrizione secondo le istruzioni del produttore.
  4. Rimuovere DNA con l'aggiunta di 1,0 U RNasi libero DNasiI per 10-20 minuti a 37 ° C.
  5. Pulire l'mRNA utilizzando un RNA ripulire kit secondo il protocollo del produttore.
  6. Per aumentare mRNA purezza e la concentrazione, precipitare l'mRNA aggiungendo 6 microlitri di acetato di sodio (3,0 M, pH 5,2) e 150 microlitri 96% di etanolo. Incubare il msoluzione ixed a -20 ° C per almeno 30 minuti e fino a 24 ore.
  7. Raccogliere il mRNA facendo girare la soluzione a 18,407 xg per 45 min a 4 ° C. Eliminare il liquido e risospendere il mRNA in 150 ml 70% di etanolo. Mescolare e centrifugare la soluzione per altri 15 min a 4 ° C. Eliminare il liquido, asciugare il pellet per 5 minuti in ghiaccio e risospendere il mRNA in 20 microlitri ultrapura RNasi acqua libera.
  8. Valutare la concentrazione e la purezza del mRNA mediante misurazione fotometrica di una diluizione 1: 100 di mRNA (1 ml mRNA in 99 microlitri ultrapura RNasi acqua libera).
  9. Per la conservazione a breve termine, mantenere la soluzione mRNA a -20 ° C. Per la conservazione a lungo termine, mantenere l'mRNA a -80 ° C.

2. H2B-PSmOrange mRNA microiniezione in embrioni di zebrafish

  1. Impostare accoppiamento coppie la sera prima iniezione utilizzando tg (foxD3: GFP); tg (FLH: GFP) doppio pesci transgenici (o qualsiasi altro pesce transgenico GFP). Lasciare il pesce separato inserendo un distanziatoretra di essi per controllare il tempo di accoppiamento.
  2. Rimuovere il distanziale di mattina di iniezione e lasciare che il compagno di pesce per 20 minuti.
  3. Durante il tempo di accoppiamento, diluire il H2B-PSmOrange mRNA alla concentrazione finale di 130 pg / nl (in RNasi acqua libera) e il trasferimento 6 ml soluzione per l'iniezione in un capillare microiniezione utilizzando una punta microloader. Controllare il volume di iniezione con un vetrino calibrato. Regolare la pressione di iniezione per iniettare 2 soluzione di mRNA nl (260 pg).
  4. Raccogliere le uova in una piastra di Petri di plastica sterilizzati contenente 1x Embryo (E3) di media.
  5. Trasferimento da 20 a 30 embrioni per un piatto di iniezione con una pipetta di plastica Pasteur.
  6. Iniettare 2 mRNA nl contenenti soluzione nella cella o appena sotto la cella nel tuorlo allo stadio unicellulare 11.
  7. Trasferire gli embrioni iniettato in una piastra di Petri contenente medio 1x E3, rimuovere gli embrioni normalmente in via di sviluppo non fecondate o meno e crescere a 28 ° C.
    Nota: la protezione della luce of embrioni non è richiesto durante l'esperimento.
  8. Sollevare embrioni di zebrafish in media 1x E3 e aggiungere 0,2 mM PTU (1-fenil-2 tiourea) dopo gastrulation per inibire la pigmentazione. Cambiare il mezzo due volte al giorno per minimizzare il rischio di contaminazioni batteriche.

3. Embrione Embedding

  1. Selezionare la GFP (verde) e PSmOrange (arancione / rosso) embrioni co-esprimono usando un microscopio binoculare dotato di una lampada a fluorescenza e filtri di emissione adeguati. Trasferire gli embrioni positivi in ​​una piastra di Petri sterile contenente medio 1x E3.
  2. Embrioni Dechorionate sotto uno stereomicroscopio con pinze 12.
  3. Trasferimento un embrione in una provetta da 1,5 ml contenente 1,0 ml di pre-riscaldato 1,0% agarosio basso punto di fusione (LMA) preparato in acqua ultrapura utilizzando una pipetta di cut-tip (P200). Nota: Riscaldare la LMA a 80 ° C e raffreddare per 3-5 minuti a temperatura ambiente prima di incorporare l'embrione.
  4. Trasferire l'embrione in 150 ml LMA in unchambered coprioggetti e regolare l'orientamento dell'embrione, ad esempio lato dorsale giù nell'esperimento descritto per la invertita laser confocale microscopio a scansione A1R + (o qualsiasi altro microscopio adatto), utilizzando una punta plastica fine. Quando la LMA è polimerizzato, riempire la camera con pesci d'acqua contenente 0,2 mM PTU e 0,02% di etile 3 amminobenzoato methansulfonate (Tricaine) per l'anestesia.
  5. Prima di imaging del campione, attendere 15 min per accertare l'effetto di Tricaine. L'anestesia impedisce i movimenti di embrioni, che possono essere monitorati utilizzando uno stereomicroscopio dotato di illuminazione campo chiaro.
    Nota: Le camere possono essere riutilizzati due volte.

4. PSmOrange Fotoconversione

  1. Posizionare il campione sotto il microscopio confocale e scansione dei campioni per identificare l'area da photoconvert utilizzando 488 nm e 561 nm laser per l'imaging rispettivamente GFP e PSmOrange.
    Nota: Utilizzare il invertito confocale a scansione laser microscopio A1R + sul STA invertitage TiEcontrolled dal software di imaging del microscopio e dotato di 488 nm, 561 nm e 640 nm laser per fotoconversione e di imaging. Tuttavia, l'applicazione non è certamente limitato a questo microscopio finché le linee laser per la conversione e l'imaging sono disponibili.
    1. Mettere l'obiettivo di aria 20X in posizione (NA: 0,75; WD: 1,0 mm, FOV: 0,64 x 0,64 mm).
    2. Utilizzare le seguenti impostazioni microscopio per rilevare la proteina PSmOrange prima fotoconversione: 561 nm laser, 0.74 mW misurata in corrispondenza del piano di messa a fuoco sopra l'obiettivo.
      Nota: Questo corrisponde al 40% su questo sistema (misura nel piano focale è l'unico modo per determinare la potenza effettiva). Regolare la potenza del laser in base alle esigenze sperimentali come l'efficienza delle iniezioni H2B-PSmOrange può variare.
    3. Aggiungere fattori di zoom per evidenziare l'area di interesse. ingrandimenti maggiori riducono i tempi di acquisizione delle immagini e quindi fototossicità.
  2. Acquisire un z-stack che copre la strutturas di interesse utilizzando 488 nm e 561 nm laser in modalità sequenziale (modalità riga 1-> 4). Fissare la z-passo tra 1,0 e 2,0 micron. media e la frequenza di scansione possono essere utilizzate per ottimizzare la qualità dell'immagine.
  3. Scansione campione e seleziona la regione di interesse utensile (ROI) per evidenziare la zona per photoconvert. Fissare il ROI come area di stimolazione. Selezionare il modulo Photo Attivazione / candeggio, attivare il laser 488 nm selezionando la rispettiva casella e impostare il laser 488 nm a 80% (1 mW potenza laser misurato allo scopo). Impostare la velocità di scansione di 0,5 sec / Frame.
  4. Aprire l'utilità fotoconversione (ND Stimulation) e specificare le impostazioni fotoconversione.
    1. Fare clic sul comando "Aggiungi" per specificare il protocollo fotoconversione.
    2. Impostare "Fase" 1 nel menu "acquisizione / stimolazione" a "Acquisizione" e indicare il numero di immagini da acquisire prima fotoconversione nel menu "Loop".
    3. Impostare "Fase" 2 su "Stimulation "e inserire il numero di eventi di stimolazione da eseguire.
    4. Regolare "Fase" 3 come descritto per "Fase" 1. Facoltativamente, inserire una attesa "Fase" dopo "Fase" 2 inserendo il tempo di attesa prima che l'ultimo round di acquisizione delle immagini.
    5. Una volta impostati tutti i parametri, applicare l'impostazione stimolazione ed eseguire il fotoconversione.
      Nota: potenza del laser, la frequenza di scansione e numero di iterazioni per ogni turno di fotoconversione può variare e differiscono da embrione embrione. Un ambiente per cominciare è mostrato in Tabella 1.
  5. Acquisire un z-stack finale utilizzando 488 nm, 561 nm e 640 nm laser che applicano le impostazioni come sopra. Impostare il laser 640 nm per visualizzare la PSmOrange convertito con alto potere del laser (fino a 4,5 mW).

5. Smontare embrione da LMA

  1. Rimuovere l'embrione camera di contenimento dal microscopio. Rimuovere con attenzione l'embrione dalla u agarosiocantare pinze.
  2. Trasferire l'embrione in una nuova plastica sterilizzati petri-piatto o in un 6-pozzetti-sterilizzati contenente 1x E3 e 0,2 mM PTU. Incubare l'embrione a 28 ° C fino alla fase di sviluppo desiderato.

6. Analizzando il destino di Photoconverted PSmOrange proteine ​​cellule che esprimono

  1. Re-inserire l'embrione come descritto ai punti 3.3 e 3.4.
  2. Posizionare il campione sotto il microscopio confocale e la scansione del campione per identificare le cellule photoconverted (640 nm) nella struttura transgenico GFP di interesse (488 nm).
  3. Acquisire un z-stack che copre le strutture di interesse utilizzando 488 nm, 561 nm e 640 nm laser in modalità sequenziale (modalità riga 1-> 4). Fissare la z-passo tra 1,0 e 2,0 micron. media e la frequenza di scansione possono essere utilizzate per ottimizzare la qualità dell'immagine.
  4. Utilizzare uno dei seguenti metodi per identificare le cellule, che GFP co-express e la proteina photoconverted.
    1. Una soluzione su misura automatica Fiji ImmagineJ 3 Macro
      1. Convolve lo stack originale utilizzando il plugin "GaussianBlur" (→ Processo → Filtri → GaussianBlur) e sottrarre le pile lisce dall'originale utilizzando il plug-in "Immagine calcolatore" (→ Processo → calcolatore di immagine). Utilizzare questo passaggio per visualizzare le strutture di interesse e di ridurre il tempo di calcolo per l'analisi.
      2. Applicare soglie specifiche per i canali verde e lontano-rosso al fine di evidenziare le cellule photoconverted (→ Immagine → Regola → Soglia). Utilizzare lo strumento "Analisi Particelle" per rilevare le aree di soglia con un ambiente adatto (→ Analisi → Analisi Particelle).
      3. Aprire il plugin "immagine Calcolatore" e visualizzare i ROI sovrapposte nel canale verde e lontano-rosso in giallo (→ Processo → Immagine Calculator).
    2. software di imaging Microscopio per la valutazione dei dati 3D
      1. Visualizzare lo stack in3D utilizzando l'opzione di visualizzazione Mostra volume (→ Visualizzazione 3D Menu → Visualizza Volume View). Utilizzare l'interfaccia grafica per selezionare i canali verde, rosso e rosso lontano, regolare la luminosità ed il contrasto e ritagliare stack 3D per evidenziare l'area photoconverted (Figura 1).
        Nota: Metodi simili per analizzare sono disponibili i dati nella maggior parte del software comune per l'analisi delle immagini.

Risultati

La Figura 1 illustra un esempio del sistema PSmOrange fotoconversione. Il complesso pineale è una struttura conservata nel diencefalo dorsali vertebrati. Come in molti altri vertebrati, il complesso costituito dall'organo pineale nel centro del diencefalo e le cellule parapineal sinistre. Elegante ma in termini di tempo esperimenti uncaging hanno dimostrato che le cellule parapineal hanno origine nella parte anteriore dell'organo pineale 13. In tg (fo...

Discussione

embrioni transgenici portatori giornalisti fluorescenti hanno contribuito fondamentalmente a comprendere lo sviluppo embrionale. Tuttavia, vi è ancora la necessità essenziale per i promotori per facilitare la visualizzazione specifica di particolari strutture. In loro assenza, i ricercatori si basano su tecniche come la fotoconversione di proteine ​​fluorescenti per scoprire l'origine e lo sviluppo della loro struttura di interesse. Questo a sua volta è un prerequisito fondamentale per identificare i meccanis...

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

We thank O. Subach for providing the original H2B-PSmOrange plasmid and our fish facility team for fish care. We are grateful to the Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg for access to microscopy equipment and analysis software. We acknowledge the support of the Core Facility Live Cell Imaging Mannheim at the CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). This work was supported by the Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), University of Heidelberg to C.A.B. and the Medical Faculty Mannheim of the University Heidelberg and the DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 and 298/6-1) to M.C.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
PCR Purification KitQiagen28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kitAmbionAM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kitQiagen74204
Plastic Pasteuralpha laboratoriesLW4000
Original H2B-PSmOrange PlasmidAddgene31920The plasmid described in the paper is available in the Carl lab
FemtoJet MicroinjectorEppendorf5247 000.013
Forceps (5 Inox)NeoLab2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System Nunc155382
Nikon A1R+Nikon GmbH GermanyNo Number
Nikon PLAN Apo λ 20X air objective Nikon GmbH GermanyNo Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)Nikon GmbH Germany/Laboratory ImagingNo Number

Riferimenti

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